劉 筱, 徐敬東, 于 放

(1. 北京市十五中學(xué), 北京 100054; 2. 首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系, 北京 100069)

丙烯酰胺對幼年大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及維生素C緩解作用觀察

劉 筱1, 徐敬東2, 于 放1

(1. 北京市十五中學(xué), 北京 100054; 2. 首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系, 北京 100069)

目的觀察丙烯酰胺(ACR)對幼年大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及維生素C對ACR毒性的緩解作用。方法將40只SPF級SD大鼠隨機分為對照組(生理鹽水)和低劑量組(2.5 mg/kg)、高劑量組(10 mg/kg)和ACR+維生素C泡騰片(維生素C組, 10 mg/kg ACR+ 1 mg/kg 維生素C), 每組10只, 雌雄各半。采用灌胃方式進行染毒, 每周染毒5 次, 連續(xù)染毒4 周。每周測量大鼠體質(zhì)量、染毒結(jié)束后進行轉(zhuǎn)棒試驗和水迷宮試驗及大鼠腦組織HE染色。結(jié)果與對照組相比，高劑量ACR染毒可引起大鼠體質(zhì)量減輕(P＜0.05)、轉(zhuǎn)棒停留時間縮短(P＜0.05)、水迷宮試驗潛伏期延長(P＜0.05)和游泳路程增加(P＜0.05); HE染色提示大鼠海馬組織有損傷; 維生素C組的各項指標(biāo)好于實驗組。結(jié)論ACR可引起幼年大鼠運動功能和學(xué)習(xí)記憶能力降低，維生素C可在一定程度上減輕ACR的毒性、緩解ACR對大鼠海馬引起的損傷。

丙烯酰胺ACR; 學(xué)習(xí)記憶; 氧化; 維生素C

丙烯酰胺(acrylamide，ACR)是一種化工原料，廣泛存在于人類的食物和飲用水中。高淀粉食物在高溫烘焙過程中(＞120℃)可以產(chǎn)生ACR，油炸馬鈴薯、咖啡、茶葉都是ACR含量高的食物[1]。研究表明，ACR具有神經(jīng)毒性、生殖毒性和潛在的致癌性，有一定的蓄積性[2]，ACR的神經(jīng)毒性顯著影響大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[3,4]。據(jù)調(diào)查，薯片、餅干等油炸食品是兒童偏好食品之一，導(dǎo)致兒童攝入ACR的量約為成人 2～3倍[5]。因此，兒童暴露ACR的風(fēng)險較成年人更高，可能會對兒童造成更大危害。本實驗建立幼年大鼠ACR染毒模型，觀察幼年大鼠成長過程中ACR對其學(xué)習(xí)記憶力的影響及攝入維生素C是否可以降低ACR神經(jīng)毒性作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

3周齡SPF級SD大鼠40只，體質(zhì)量為70～90 g，雌雄各半，由北京維通利華有限公司提供[SCXK(京)2016-0005]，均飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物部 [SYXK(京) 2013-0005]。

1.2 儀器設(shè)備與試劑

ACR(純度為99.9%, CAS: 79-06-1, 北京化學(xué)試劑廠, 中國), 采用生理鹽水配制成濃度為2.5g/L的儲存液; 維生素C泡騰片(國藥準(zhǔn)字H20056946, 北京拜耳醫(yī)藥保健有限公司, 中國), 采用蒸餾水配制成濃度為0.1g/L的儲存液; 水合氯醛(CAS號: 302-17-0, 北京化學(xué)試劑廠, 中國); TD6102 型電子天平(金兆市金諾天平儀器有限公司，中國); 大鼠轉(zhuǎn)棒實驗儀(Ugo Basile，型號：47750，意大利); Morris水迷宮儀(中國醫(yī)藥科學(xué)院藥物研究所，型號:DNS-2, 中國)。

1.3 大鼠分組與處理

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后隨機分成4組，每組各10只, 雌雄各半, 其中對照組給予生理鹽水; ACR低劑量組, 2.5 mg /kg; ACR高劑量組, 10 mg/kg; ACR高劑量加維生素C泡騰片(簡稱維生素C組)，每日10 mg/kg ACR, 同時給予1 mg/kg維生素C。4組均采用灌胃方式給藥，每周5次, 連續(xù)4周, 第6周后采用體積分數(shù)10%水合氯醛麻醉處死; 每周測量大鼠的體質(zhì)量。第5周開始進行運動能力及神經(jīng)行為學(xué)測試。

1.4 外周神經(jīng)損傷檢測實驗

4組大鼠在灌胃給藥4周后進行轉(zhuǎn)棒(運動協(xié)調(diào)性)實驗[6,7]。觀察動物在一定轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)棒上的停留時間，推測動物的后肢運動能力，判斷ACR的外周神經(jīng)毒性作用。第5周時先適應(yīng)性訓(xùn)練大鼠站在轉(zhuǎn)棒上10 min，隨后訓(xùn)練大鼠在轉(zhuǎn)速為20 r/min的轉(zhuǎn)棒上保持平衡，并能持續(xù)保持1 min。每日3次，連續(xù)5 d。若在此期間墜落在轉(zhuǎn)棒底部，將受到轉(zhuǎn)棒下電刺激器的電激懲罰，促使每次實驗中大鼠都能盡最大能力在轉(zhuǎn)棒上運動。當(dāng)所有動物達到這一成績后，開始正式測試。第6周正式測試時的轉(zhuǎn)速20 r/min，每只動物先適應(yīng)3次后，連續(xù)測5次記錄大鼠能夠停留在轉(zhuǎn)棒上的時間，取其平均值進行統(tǒng)計，每次測試時間為1 min、間隔1 min。

1.5 學(xué)習(xí)記憶能力的測試

采用Morris水迷宮對動物學(xué)習(xí)記憶能力進行測試[8]。本實驗采用的Morris 水迷宮儀是一個圓形水池, 直徑180 cm、高55 cm，隱蔽性平臺高30 cm，直徑12 cm。采用視頻追蹤技術(shù)記錄大鼠尋找隱藏在水面下平臺的時間(逃避潛伏期, escape latency)和游泳總路程。測試前, 大鼠先被置于不含平臺的水池中自由游泳2次, 熟悉迷宮環(huán)境。在定位航行實驗中，將平臺置于第一象限, 將大鼠面向池壁分別從4個入水點放入水中。若大鼠在入水游泳1 min以內(nèi)未能找到水池中的平臺，引導(dǎo)其至平臺上站立20 s。大鼠爬上平臺休息10 s后將其從平臺上拿下來, 休息1 min以后再進行下一次訓(xùn)練, 每日于固定時間段訓(xùn)練4次，連續(xù)3 d，記錄每次訓(xùn)練逃避潛伏期和游泳總路程，取平均值進行統(tǒng)計學(xué)分析。第5日撤去平臺，進行空間探索實驗。任選一個入水點將大鼠放入水池中，記錄其在1 min內(nèi)的游泳軌跡, 考察大鼠對原平臺的記憶。另外, 將平臺置于第三象限(對位臺子)，同樣記錄其在1 min內(nèi)的游泳軌跡, 考察大鼠的整合記憶能力。第9日進行長期記憶實驗, 將平臺依舊放在第一象限，同樣訓(xùn)練4次，記錄其平均逃避潛伏期和游泳總路程。

1.6 海馬HE染色

染毒和行為學(xué)測試實驗結(jié)束后，以10 mL/kg的劑量給予大鼠體積分數(shù)10%水合氯醛過量麻醉對大鼠實施安死術(shù)后，取出大鼠的腦組織置于質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛中固定24 h后進行脫水、透明、浸蠟、包埋等步驟得到組織蠟塊, 修整切片為7 μm，經(jīng)HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察海馬組織。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

調(diào)查所得數(shù)據(jù)均錄入Excel 2007 軟件, 采用t檢驗檢查兩組間差異。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ACR對大鼠體質(zhì)量的影響

由表1可見，低劑量ACR組SD大鼠的體質(zhì)量與對照組體質(zhì)量比較無明顯差異(P＞0.05); 高劑量ACR組大鼠體質(zhì)量始終低于對照組，至第6周時體質(zhì)量與對照組達到顯著差異(P＜0.05)。維生素C組體質(zhì)量與對照組比較沒有顯著差異(P＞0.05)。

2.3 ACR對大鼠運動功能的影響

與對照組比較，雄性及雌性SD大鼠高劑量組在轉(zhuǎn)棒運動的第2日和第3 日，均顯示出在勻速轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)棒上的停留時間降低(P＜0.05, P＜0.01)(表2)，并且雄性組的停留時間(3.00±13.75 s)明顯短于雌性組(26.50±18.35 s, P＜0.05); 維生素C組在勻速轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)棒上的停留時間也出現(xiàn)性別差異，雌性SD大鼠與高劑量組比較僅在第2日出現(xiàn)轉(zhuǎn)棒上停留時間增加的趨勢(P＞0.05); 而在雄性維生素C組，與高劑量組比較，在第2日和第3 日均顯示出停留時間顯著增加(P＜0.05)。

表 1 不同劑量丙烯酰胺及維生素C攝入對大鼠體質(zhì)量的影響Table 1 Effects of different doses of acrylamide and vitamin C on the rats weight g

2.4 ACR對大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響

結(jié)果表明(表3)，低劑量組SD大鼠上岸潛伏期及游泳距離與對照組相比無明顯差異，高劑量組SD大鼠在第2日、第5日(空間探索)、第5日(對位臺子)及第九日均表現(xiàn)出上岸潛伏期、游泳距離較對照組顯著增加(P＜0.05)。第3日及第9日，維生素C組的上岸潛伏期和游泳距離均較高劑量組低(P＜0.05)，但仍高于對照組(P＜0.05)。

表 2 不同劑量丙烯酰胺及維生素C攝入對大鼠運動功能的影響Table 2 Effects of different doses of acrylamide and vitamin C on motor function in rat s

表 3 不同劑量丙烯酰胺及維生素C攝入對大鼠水迷宮逃避潛伏期和游泳距離的影響Table 3 Effects of different doses of acrylamide and vitamin C on the latency and the swimming distance in MWM

2.5 ACR對大鼠海馬的損傷

從圖1可見，對照組、低劑量、高劑量以及維生素C組的大鼠海馬的齒狀回(dentate gyrus, DG)區(qū)形態(tài)類似，CA1區(qū)細胞排列緊密，形態(tài)完整，細胞核飽滿、核仁清晰，然而在高劑量組CA1區(qū)明顯出現(xiàn)細胞排列疏松、紊亂、細胞形態(tài)不規(guī)則，胞膜皺縮、胞核固縮、破裂、濃染，甚至出現(xiàn)核仁模糊或消失。低劑量及維生素C組CA1區(qū)與對照組差異不明顯。

3 討論

3.1 ACR神經(jīng)毒性的發(fā)病機制

ACR是神經(jīng)蓄積性毒物，急性或亞急性損害以中樞神經(jīng)系統(tǒng)及小腦功能障礙為主，慢性中毒以周圍神經(jīng)損害為主[9]。本文結(jié)果表明，高劑量ACR染毒4周后，與對照組相比，大鼠體質(zhì)量下降，周圍神經(jīng)損害明顯，運動功能受損。據(jù)文獻[10-12]報道，ACR進入人體后，在肝臟細胞色素P450的作用下，生成活性環(huán)氧丙烯酰胺，與ACR和血紅蛋白結(jié)合形成加合物，聚集在神經(jīng)、肝、腎及生殖系統(tǒng)中。另外，ACR與驅(qū)動蛋白、動力蛋白巰基相結(jié)合, 抑制軸漿轉(zhuǎn)運的有關(guān)酶類, 從而抑制神經(jīng)生長因子等的轉(zhuǎn)運, 導(dǎo)致髓鞘變性、脫失[13-15]。此外，大鼠在ACR染毒后，腦和肝中的超氧化物歧化酶活性下降，脂質(zhì)過氧化增強[16]; 高濃度的ACR可通過增加細胞內(nèi)活性氧簇的水平，誘導(dǎo)神經(jīng)前體細胞的凋亡和壞死，導(dǎo)致神經(jīng)前體細胞的增殖明顯減少，這些提示氧化損傷可能是ACR神經(jīng)毒性的重要發(fā)病機制。因此本實驗在ACR暴露的同時給予抗氧化劑維生素C，結(jié)果表明維生素C能在一定程度上緩解ACR毒性，降低損傷。

3.2 ACR可通過損傷海馬引起大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降

圖 1 HE染色觀察ACR對大鼠海馬的損傷作用及維生素C的保護作用 (HE×100, 標(biāo)尺: 100 μm)Figure 1 The effect of acrylamide on rat hippocampal injury and the protective effect of vitamin C by HE staining(HE×100, scale: 100 μm)

有研究[17]觀察到ACR中毒后大鼠大腦皮層、小腦、海馬及視丘等出現(xiàn)多發(fā)部位損害，海馬，屬大腦邊緣系統(tǒng)，與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系密切。大鼠海馬通常由CA1、CA3和CA4區(qū)組成，CA4區(qū)有齒狀回(DG)的多形層。研究[18]表明，海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元對缺血性損傷十分敏感，CA3區(qū)和DG區(qū)則對缺血性刺激相對耐受，反應(yīng)出CA1區(qū)是易損區(qū)。本文結(jié)果顯示，ACR的長期蓄積引起SD大鼠海馬組織CA1區(qū)的損傷，出現(xiàn)顆粒細胞層數(shù)明顯減少、細胞排列紊亂、細胞形態(tài)改變及細胞核固縮，因此本文作者認為，高劑量的ACR可能直接損傷海馬組織，進而影響了大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。Morris水迷宮實驗證實, 高劑量組SD大鼠的短期記憶及長期記憶均受到影響，表現(xiàn)為逃避潛伏期及游泳總路程較對照組明顯增加, 這也證明ACR對幼年大鼠記憶力的影響可能是通過損傷CA1區(qū)發(fā)生的。

3.3 維生素C一定程度上控制了大鼠的ACR毒性

天然維生素C 廣泛存在于新鮮水果和綠色蔬菜中，在體內(nèi)可直接參與氧化還原反應(yīng)或間接還原其它抗氧化系統(tǒng)，是重要的水溶性強抗氧化劑。本文結(jié)果表明，維生素C組與高劑量組相比, 長期記憶的潛伏期縮短，但仍長于對照組。說明1 mg/kg的維生素C一定程度上緩解了ACR對SD大鼠的海馬損傷，但并未扭轉(zhuǎn)或徹底清除毒性作用。維生素C可能通過清除自由基減輕ACR的神經(jīng)毒性，對腦組織有保護作用，其具體機制有待進一步闡明。

本文結(jié)果提示，人類應(yīng)該盡可能避免攝入高ACR食品，經(jīng)常攝入高ACR食品的人群盡可能搭配高維生素C食品，以降低其危害。

(致謝: 感謝首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供我們實驗的場所; 感謝首都醫(yī)科大學(xué)公衛(wèi)學(xué)院余煥玲教授、實驗動物學(xué)系杜小燕副教授給予論文的指導(dǎo)及英文撰寫的幫助；感謝首都醫(yī)科大學(xué)解剖教研室楊春副教授給予大鼠腦HE染色的指導(dǎo)與幫助。)

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Effects of Acrylamide on Learning and Memory Ability in Young Rats and Toxicity Alleviation by Vitamin C

LIU Xiao1, XU Jing-dong2, YU Fang1
(1. Beijing 15 Middle School, Beijing 100054, China; 2. Department of Physiology and Pathophysiology,School of Basic Medical Sciences, The Capital Medical University, Beijing 100069, China)

ObjectiveTo study the effects of acrylamide on learning and memory ability in young rats and alleviated effect of vitamin C.MethodsForty SPF grade SD rats weighing 70-90 g were randomly divided into four groups, 10 in each group and male and female in half. The control groups were given normal saline. The rats in experimental groups were given acrylamide dissolved in normal saline,at the doses of 2.5 mg/kg, 10 mg/kg and vitamin C group was given 10 mg/kg and 1 mg/kg vitamin at the same time. All animals were given test substances through oral gavage, 5 days/week, for 4 weeks. Body weight was measured per week. Special tests included the rotarod Test and the staining of rat brain tissue. Learning and memory ability was tested by Morris water maze (MWM).ResultsCompared with the control group, the weight of rats in high-dose group treated with acrylamide was decreased(P＜0.05) and time for rats standing rotarod was decreased (P＜0.05) and the latency was extended and the distance was increased by Morris water maze (MWM); The HE staining suggested that the hippocampal tissue of rats was damaged. The indexes of vitamin C group were better than the experimental groups.ConclusionAcrylamide can damage motor function and learning-memory capability in young rats and vitamin C can decrease the ACR toxicity and alleviate the hippocampal tissue damage in some degree.

Acrylamide; Learning and memory; Oxidation; Vitamin C

Q95-33

A

1674-5817(2017)06-0460-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.06.007

2017-08-10

劉 筱(2000-), 女, 北京市十五中學(xué)在校高中學(xué)生。E-mail: kongluxinxiang@ sina.com

于 放(1973-), 男, 碩士, 講師。研究方向: 生物學(xué)。 E-mail: 13701063432@ 139.com