顧劍潔, 葛 蓉, 徐偉超, 劉麗均

(1. 上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院, 上海200240;2. 上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司, 上海 201615;3. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095)

不同超排卵方案對(duì)BALB/c小鼠超排卵效果的影響

顧劍潔1,2, 葛 蓉2, 徐偉超3, 劉麗均2

(1. 上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院, 上海200240;2. 上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司, 上海 201615;3. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095)

目的研究不同劑量及注射時(shí)間的促黃體素釋放激素(LHRH-A2)、孕馬血清促性腺激素(PMSG)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、抑制素抗血清(IAS)對(duì)小鼠超排卵效果的影響。方法以BALB/c近交系小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，160只雌性小鼠隨機(jī)分為4組，每組40只，按照注射劑量不同分為4組，A組: 腹腔注射5 IU LHRH-A2，間隔72 h后注射10 IU PMSG，間隔48 h后注射10 IU hCG; B組: 腹腔注射5 IU LHRH-A2，間隔48 h后注射10 IU PMSG，間隔48 h后注射10 IU hCG;C組: 腹腔注射10 IU PMSG, 間隔48 h后注射10 IU hCG; D組: 腹腔注射0.2 mL IAS, 間隔48 h后注射10 IU hCG。次日早取卵、體外受精(IVF)培養(yǎng), 統(tǒng)計(jì)排出卵母細(xì)胞的數(shù)量, IVF率(IVF%)和異常率。結(jié)果D組平均超數(shù)排卵數(shù)高于另外3組(P＜0.05), 但同時(shí)IVF率低于另外3組(P＜0.05)。A 、B、C組平均超數(shù)排卵數(shù)，IVF率, 異常率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。結(jié)論對(duì)于BALB/c小鼠,采用IAS和hCG超排激素組合, 得到的卵子數(shù)目比另外3組顯著增多, 但2-細(xì)胞期胚胎數(shù)少。采用LHRH-A2、PMSGT和hCG超排激素組合, 得到的2-細(xì)胞期胚胎數(shù)比另外3組更多, 異常卵數(shù)少。

BALB/c小鼠; 抑制素抗血清(IAS); 促黃體素釋放激素(LHRH-A2)

小鼠是現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)中應(yīng)用最為廣泛的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，隨著基因工程技術(shù)(如基因?qū)搿⒒蛑脫Q及基因剔除)的發(fā)展，對(duì)小鼠胚胎的需求量逐漸增多。另外，一些特殊疾病動(dòng)物模型的資源保存和品系培育，也需要大量的胚胎進(jìn)行冷凍保藏。依靠小鼠的自然排卵，得到的胚胎數(shù)較少而且耗時(shí)耗力耗財(cái)[1]。用外源激素處理雌性小鼠，改變其性周期，使之按照預(yù)定時(shí)間超數(shù)量地排卵，從而在短時(shí)間內(nèi)可以獲得大量的胚胎以滿足工作的需要，稱為超排卵(簡(jiǎn)稱超排)[2]。用激素處理動(dòng)物進(jìn)行超數(shù)排卵是進(jìn)行胚胎移植、基因修飾、克隆等研究的基礎(chǔ)技術(shù)之一，通過超數(shù)排卵獲得大量一致的、優(yōu)質(zhì)的卵子或受精卵是胚胎移植的關(guān)鍵技術(shù)之一，這種方法在現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究中具有重要的意義。

黃體激素釋放激素(LHRH)是與生殖功能密切相關(guān)的由10個(gè)氨基酸組成的多肽，由于它能刺激垂體前葉釋放促性腺激素，故又稱為促性腺激素(GnRH)[3]。天然的LHRH是由丘腦下部弓狀核合成，作用于腦垂體促性腺細(xì)胞，能促使動(dòng)物垂體前葉釋放促黃體素(LH)和促卵泡素(FSH)合成與分泌，調(diào)控受體激素水平及生殖功能，調(diào)節(jié)LH和FSH的合成與分泌。1971年LHRH的結(jié)構(gòu)被確定并合成，1972年以來，人工合成的LHRH上千種，近30年來，LHRH及其他類似物在動(dòng)物生殖系統(tǒng)促進(jìn)繁殖等方面廣為應(yīng)用。

C57BL/6背景小鼠是在2002年完成的第一個(gè)基因組測(cè)序的小鼠品系，廣泛應(yīng)用于建立轉(zhuǎn)基因小鼠模型[4]。對(duì)于C57BL/6背景小鼠超排的最適合的激素劑量，國(guó)內(nèi)外已做過很多相關(guān)實(shí)驗(yàn)，目前，常規(guī)劑量國(guó)外多采用PMSG與hCG各5 IU或各7.5 IU劑量[5]，國(guó)內(nèi)采用PMSG與hCG各5 IU或各10 IU劑量的方法，間隔時(shí)間為48～52 h[6]。2015年日本熊本大學(xué)實(shí)驗(yàn)室通過結(jié)合使用抑制素抗血清(IAS)與馬絨毛膜促性腺激素(eCG), 相對(duì)PMSG與hCG的方法，C57BL/6J小鼠超排卵子數(shù)目提高了3倍[7]。

但對(duì)于BALB/c，使用IAS與hCG是否有同等效果，目前還未可知。另外，在常規(guī)激素組合PMSG和hCG中，嘗試添加LHRH，是否能提高小鼠超排卵子數(shù)目。

本試驗(yàn)在雌鼠的年齡與體質(zhì)量、外源激素等因素不變的條件下，以BALB/c小鼠為試驗(yàn)材料，實(shí)驗(yàn)探索外源激素LHRH，PMSG，hCG，IAS不同劑量組合對(duì)白化小鼠超排的最佳劑量組合，為今后的相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)BALB/c小鼠(雌鼠8周齡左右, 雄鼠10周齡以上)由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(滬)2012-0002]提供; 飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物室內(nèi)[SYXK(滬)2012-0002], 自由采食和飲水, 室溫(22±2) ℃, 光照12 h/d，8∶00～20∶00，調(diào)節(jié)生理周期，使其適應(yīng)環(huán)境。

1.2 實(shí)驗(yàn)器械

超凈工作臺(tái), CO2恒溫培養(yǎng)箱, 體視顯微鏡, 實(shí)體倒置顯微鏡, 維納斯剪, 撿卵針, 口吸式移卵管等。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

促黃體素釋放激素A2(LHRH-A2)(生產(chǎn)批號(hào): 獸藥字(2016)110252086)、PMSG(生產(chǎn)批號(hào): 獸藥字(2015)110254564)、hCG(生產(chǎn)批號(hào): 獸藥字(2016)110251281)均購(gòu)自寧波第二激素廠; 人輸卵管液(HTF)按QQuinn 的方法[8]配制; IAS由熊本大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供,其余試劑除特殊說明外均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 雌鼠的超排 選用8周齡的雌鼠40只, 雌鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，激素劑量分別為L(zhǎng)HRHA2(5 IU)，PMSG(10 IU)，hCG(10 IU)，IAS(0.2 mL)，按照注射時(shí)間不同分別分為: A組每只小鼠腹腔注射LHRH-A2, 間隔72 h后注射PMSG，間隔48 h后注射hCG；B組每只小鼠腹腔注射LHRH-A2, 間隔48 h后注射PMSG，間隔48 h后注射hCG; C組每只小鼠腹腔注射PMSG, 間隔48 h后注射hCG;D組每只小鼠腹腔注射IAS，間隔48 h后注射hCG進(jìn)行超排，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.4.2 培養(yǎng)皿的準(zhǔn)備 第6日用35 mm養(yǎng)皿做HTF培養(yǎng)滴，礦物油覆蓋，放入37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱平衡過夜，第7日使用。

1.4.3 精子獲能 10周齡雄鼠頸椎脫臼法處死, 剖腹取附睪，用注射針刺破附睪，擠出精子團(tuán)放入HTF 培養(yǎng)滴中，培養(yǎng)箱培養(yǎng)1.5 h獲能[9]。

1.4.4 卵母細(xì)胞的收集 雌鼠脫頸處死，在超凈臺(tái)中取出兩側(cè)輸卵管，利用體視顯微鏡，用眼科鑷撕開輸卵管膨大的壺腹部，并將卵母細(xì)胞-卵丘復(fù)合物收集到HTF液點(diǎn)內(nèi)。

1.4.5 體外受精(IVF) 顯微鏡下觀察培養(yǎng)1.5 h后的精子活力和數(shù)量，取適量的已獲能的精子加入含卵母細(xì)胞的培養(yǎng)滴中，培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。隔日在顯微鏡下觀察, 統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞數(shù)、2-細(xì)胞期胚胎數(shù)、未受精卵數(shù)、異常卵數(shù), 并計(jì)算IVF率=(2-細(xì)胞期胚胎數(shù)/卵母細(xì)胞數(shù))×100%，異常率=(異常卵/卵母細(xì)胞數(shù))×100%[10]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)用x-± s表示，利用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用方差分析和多重比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

對(duì)4組劑量組超排效果進(jìn)行比較, D組的卵母細(xì)胞數(shù)明顯高于A、B、C組(P＜0.05)。但D組的IVF率明顯低于A組、B組、C組(P＜0.05)(表1)。

實(shí)驗(yàn)顯示, 使用IAS后, 有效提高了BALB/c小鼠超排數(shù)目，但同時(shí)降低了卵母細(xì)胞的受精率。添加LHRH-A2后，卵母細(xì)胞數(shù)沒有顯著提高，但2-細(xì)胞期胚胎數(shù)的增加和異常卵的減少，實(shí)際上提高了IVF獲得的有效胚胎數(shù)(表1)。

表 1 4組激素組合對(duì)BALB/c小鼠超排效果比較

3 討論

在小鼠IVF-胚胎移植(ET)實(shí)驗(yàn)中，常用PMSG模仿內(nèi)源性FSH的促進(jìn)卵成熟作用， hCG模仿LH的誘導(dǎo)作用[11]。

超排成功與否取決于雌鼠的年齡與體質(zhì)量、激素的劑量和注射時(shí)間以及小鼠的品系。根據(jù)我們實(shí)驗(yàn)室前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 相比C57BL/6J雌鼠超排，BALB/c雌鼠的最適日齡是大于8周齡, 這可能與白化雌性小鼠的性成熟程度有關(guān), 8周齡小鼠已達(dá)到性成熟, 卵泡成熟周期已經(jīng)開始，對(duì)FSH有反應(yīng)，所以本實(shí)驗(yàn)中所用的小鼠統(tǒng)一為8周齡[12]。另外，不同品系的小鼠其受精率也不盡相同，這取決于對(duì)FSH和LH的敏感程度。盡管對(duì)于大多數(shù)小鼠品系，推薦使用PMSG和hCG劑量是腹腔注射5 IU，但因具體小鼠品系和激素生產(chǎn)廠家的不同而有所區(qū)別，本實(shí)驗(yàn)采用LHRH-A2的劑量為5 IU，PMSG和hCG的劑量為10 IU。注射激素的間隔時(shí)間，既影響卵母細(xì)胞發(fā)育的同步性，又影響獲得卵母細(xì)胞的數(shù)量。

超排的最終目的是通過IVF可以獲得大量早期發(fā)育的且分裂同步的優(yōu)質(zhì)受精卵，可以用于小鼠品系資源的保存，尤其適用于每年不斷新增的遺傳工程小鼠，從而節(jié)省大量人力、經(jīng)費(fèi)和物力的投入。在本實(shí)驗(yàn)中，相比PMSG與hCG的組合, 使用IAS與hCG的組合能有效提高BALB/c小鼠超排卵子數(shù)目, 但同時(shí)卻又降低了卵母細(xì)胞的受精率, 2-細(xì)胞期胚胎數(shù)并沒有顯著增多。IAS對(duì)于BALB/c小鼠并沒有達(dá)到C57BL/6J小鼠的相同效果。添加了LHRH后，雖然不能顯著提高獲得的卵母細(xì)胞數(shù)，但2-細(xì)胞期胚胎數(shù)的增加和異常卵的減少，實(shí)際上提高了IVF獲得有效胚胎的效率，對(duì)于某些以白化小鼠為背景的轉(zhuǎn)基因小鼠的有效保持，以及白化小鼠生物凈化等工作提供了思路。對(duì)于LHRH注射劑量的進(jìn)一步細(xì)化、LHRH注射是否能提高IVF胚胎的著床率以及仔鼠出生率，我們還在進(jìn)一步研究當(dāng)中。對(duì)于IAS對(duì)其他品系的白化小鼠超排的效果如何，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

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Q95-33

B

1674-5817(2017)06-0482-03

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.06.012

2017-03-31

上海市科委實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專項(xiàng)科研計(jì)劃項(xiàng)目(14140900500, 15140900100)

顧劍潔(1984-), 女, 碩士生, 研究方向: 動(dòng)物生殖工程和低溫生物學(xué)。E-mail: 770980460@qq.com

劉麗均(1974-), 女, 副研究員, 研究方向: 低溫生物學(xué)和生殖工程。E-mail：lijunliu2005@163.com