李智勇 李永春 陳 焰 郭健文

廣東省佛山市南海區(qū)人民醫(yī)院，廣東佛山 528200

T-SPOT聯(lián)合CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)早期診斷HIV/AIDS合并肺結(jié)核潛伏感染的診斷價值分析

李智勇 李永春 陳 焰 郭健文

廣東省佛山市南海區(qū)人民醫(yī)院，廣東佛山 528200

目的探討結(jié)核（TB）感染T細(xì)胞酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-SPOT）與CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)聯(lián)合應(yīng)用對艾滋?。℉IV/AIDS）合并肺結(jié)核潛伏感染（LTBI）早期診斷的價值。方法選取2014年7月～2017年4月我院人類免疫缺陷病毒（HIV）陽性（+）感染者20例，其中合并LTBI的10例患者作為HIV（+）TB待排組，其余作為單純HIV（+）組；HIV陰性（-）30例，合并LTBI 的10例患者作為HIV（-）TB待排組，其余作為單純HIV（-）組。以診斷TB標(biāo)準(zhǔn)（病原學(xué)檢驗(yàn)）做參照，以上述四組人員為對象，比較結(jié)核菌素實(shí)驗(yàn)（TST）和T-SPOT診斷TB 的靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值，比較TST與T-SPOT診斷TB的一致性，以及CD4+細(xì)胞計(jì)數(shù)對兩者的影響。結(jié)果T-SPOT在TB診斷中，靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度均明顯高于TST，在HIV（+）TB待排組和HIV（-）TB待排組中，T-SPOT和TST診斷TB一致性良好（Kappa＞0.75）。CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)增加能夠引起T-SPOT與TST對TB診斷的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性的明顯增加，且T-SPOT優(yōu)于TST。結(jié)論在AIDS合并LTBI人群中，T-SPOT對TB診斷的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度均明顯高于TST，且T-SPOT對TB的診斷價值隨著CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)增加而提高。

結(jié)核酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)；CD4+T淋巴細(xì)胞；結(jié)核??；診斷

R378.911

A

2095-0616（2018）01-22-04

廣東省佛山市醫(yī)學(xué)類科技攻關(guān)項(xiàng)目（2014AB000582）。

Value of T-SPOT combined with CD4+T lymphocyte count in early diagnosis of HIV/AIDS with latent tuberculosis infection

LI Zhiyong LI Yongchun CHEN Yan GUO Jianwen
Guangdong Province Foshan City Nanhai District People's Hospital,Foshan 528200,China

ObjectiveTo investigate the value of T-cell enzyme-linked immunospot assay (T-SPOT) for pulmonary tuberculosis(TB)and CD4+T lymphocyte count in early diagnosis of acquired immunodeficiency syndrome(HIV/AIDS) with latenttuberculosis infection (LTBI).MethodsTwenty cases of human immunodeficiency virus (HIV)positive (+) patients who were admitted to our hospital during the period from July 2014 to April 2017 were enrolled in the study.10 cases with LTBI were included into HIV (+) TB for eliminationgroup and the other were included intosimple HIV (+) group.There were 30 HIV negative (-) cases,10 cases with LTBI were included into HIV (-) TB for eliminationgroup,and the other were included into simple HIV (-) group.With the diagnostic criteria of TB (etiological test) as the reference,the sensitivities,specificities,accuracy rates,positive predictive values,negative predictive values and the consistencies were compared between tuberculin skin test (TST) and T-SPOT in the diagnosis of TB.The influence of CD4+cell count on the two was also compared.ResultsThe sensitivity, specificity and accuracy of T-SPOT in diagnosis of TB were significantly higher than those of TST.In HIV (+) TB for eliminationgroup and HIV (-)TB for elimination group,the consistenciesof T-SPOT and TST are good in diagnosis of TB (Kappa＞0.75).The increase of CD4+T lymphocyte count can significantly increase the sensitivities,specificities and accuracy rates of T-SPOT and TST in the diagnosis of TB,and T-SPOT was better than TST.ConclusionThe sensitivity,specificity and accuracy of T-SPOT in the diagnosis of TB in patients with AIDS complicated with LTBI are significantly higher than those of TST,and the value of T-SPOT in the diagnosis of TB increases with the increase of CD4+T lymphocyte count.

T-cell enzyme-linked immunospot assay for pulmonary tuberculosis;CD4+T lymphocyte;Tuberculosis;Diagnosis

結(jié)核?。═B）是艾滋病患者常見的并發(fā)癥，早期病原學(xué)陽性率低，不易被診斷，使艾滋病死亡率增高，目前在臨床上使用的諸多方法中，均不能同時有效保障高靈敏度和高特異性[1]。通過進(jìn)一步研究，近年來學(xué)者發(fā)現(xiàn)結(jié)核感染T細(xì)胞酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-SPOT）對TB的診斷有較高的靈敏度和特異度，但 CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)對診斷結(jié)果有影響[2-4]。本研究以30例結(jié)核病患者與20例健康受試者為對象，對比T-SPOT與常規(guī)診斷方法結(jié)核菌素實(shí)驗(yàn)（TST）做對比，并結(jié)合CD4+淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，綜合診斷TB，以期為TB的診斷提供更準(zhǔn)確的方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2014年7月～2017年4月收治的30例HIV合并LTBI患者，按照臨床癥狀表現(xiàn)分為三組，每組10例，無咳嗽、發(fā)熱等結(jié)核病表現(xiàn)，但近期密切接觸過活動性肺結(jié)核患者：病原學(xué)檢測HIV病毒呈陽性，記為組1，HIV（+）TB待排組；HIV感染陰性，為組2，HIV（-）TB待排組。不來自結(jié)核病高發(fā)區(qū)域，不在結(jié)核傳播高危環(huán)境工作且無活動性結(jié)核密切接觸史和吸毒史，不合并其他臟腑器官疾?。翰≡瓕W(xué)檢測HIV病毒呈陽性，為組3，單純HIV（+）組；HIV感染陰性，為組4，單純HIV（-）組。組4由符合條件的我院20例健康醫(yī)務(wù)人員組成。以上四組人員年齡，男女分別為36和24例，年齡20～50歲，平均（35.6±5.6）歲，四組人員在性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；對所有待檢者進(jìn)行血沉（ESR）、腺苷脫氨酶（ADA）、結(jié)核抗體、病原學(xué)和影像學(xué)檢測。

1.2 方法

1.2.1 T-SPOT檢測 按照試劑盒（英國Oxford Immunotec公司）說明書進(jìn)行，取枸櫞酸鈉抗凝靜脈血5mL，加入淋巴細(xì)胞抗原分離液，離心，取下層血樣配制成細(xì)胞液，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，采用PBS洗板清晰，孵育，再用PBS清洗，加蒸餾水，烘干；結(jié)果判斷：空白對照孔斑點(diǎn)數(shù)＞6，任一實(shí)驗(yàn)孔斑點(diǎn)數(shù)減去空白孔斑點(diǎn)數(shù)大于6，記為陽性；空白對照孔斑點(diǎn)數(shù)＞6，任一實(shí)驗(yàn)孔斑點(diǎn)數(shù)大于空白孔斑點(diǎn)數(shù)的兩倍也表示陽性，陽性結(jié)果即診斷為LTBI[2]。

1.2.2 結(jié)核菌素實(shí)驗(yàn)(TST) 取0.1mL體積的結(jié)核菌素純蛋白衍生物（PPD）（含5單位結(jié)核菌素，S10960016，北京祥瑞生物制品有限公司，50IU/mL，1mL/支）對患者行前臂尺側(cè)皮內(nèi)試驗(yàn)，72h后觀察檢測結(jié)果，判斷標(biāo)準(zhǔn)：對HIV（+）患者，陽性反應(yīng)為皮膚硬結(jié)直徑≥5mm，對HIV（-）人員，陽性反應(yīng)為硬結(jié)直徑≥15mm[5]。

1.2.3 CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)，主要操作步驟：取標(biāo)記抗體10uL，將測定標(biāo)本加入后震動混勻，然后避光放置15～20min再加入溶血素（免洗）震動混勻，再避光放置15～20min后加入PBS平衡10S，最后將與測定標(biāo)本等量的計(jì)數(shù)微球加入后上機(jī)測定即可[6]。

1.2.4 診斷標(biāo)準(zhǔn) 即病原學(xué)檢測：清晨空腹留取每組人員痰液。取痰標(biāo)本進(jìn)行涂片后再抗酸染色（24h內(nèi)），TB陰性：抗酸染色陰性；TB陽性：抗酸染色陽性[7]。

1.3 觀察指標(biāo)

以標(biāo)準(zhǔn)做參照，觀察T-SPOT和TST對TB診斷的敏感度、特異度和準(zhǔn)確度，計(jì)算陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值；觀察CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)對兩者診斷TB的影響。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TST、T-SPOT診斷結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)比較

分別收集應(yīng)用TST法和T-SPOT法診斷各組中TB的陽性病例和陰性病例，并與采用金標(biāo)準(zhǔn)診斷的陽性病例和陰性病例對比。以金標(biāo)準(zhǔn)為100%診斷正確，當(dāng)金標(biāo)準(zhǔn)為陽性，TST或T-SPOT為陽性，說明該方法診斷為真陽性；當(dāng)金標(biāo)準(zhǔn)為陽性，TST或T-SPOT為陰性，說明該方法診斷為假陰性；當(dāng)金標(biāo)準(zhǔn)為陰性，TST或T-SPOT為陽性，說明該方法診斷為假陽性，當(dāng)金標(biāo)準(zhǔn)為陰性，TST或T-SPOT為陰性，說明該方法診斷為真陰性。以此評價TST和T-SPOT對TB診斷的靈敏度、特異度、正確度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值。見表1。

表1 TST、T-SPOT診斷結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)比較

表2 TST、T-SPOT診斷TB靈敏度、特異度和正確度比較（%）

表3 TST、T-SPOT診斷肺結(jié)核一致性分析結(jié)果

表4 CD4淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)對TST與T-SPOT的影響（%）

2.2 TST、T-SPOT診斷TB靈敏度、特異度和正確度比較

由表1數(shù)據(jù)，計(jì)算TST、T-SPOT診斷的靈敏度、特異度、正確度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值。與同組人員比較，T-SPOT診斷的靈敏度、特異度、正確度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值均明顯高于TST，見表 2。

2.3 TST、T-SPOT診斷肺結(jié)核一致性分析

TST與T-SPOT在HIV(+)TB待排組一致性檢驗(yàn)Kappa值為0.80，在HIV(-)TB待排組Kappa值為0.78，一致性均為良好（Kappa＞0.75）。見表3。

2.4 CD4淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)對TST、T-SPOT的影響

CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)目的增加，引起TST與T-SPOT檢驗(yàn)靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度增加，同組比較可知，T-SPOT優(yōu)于TST。見表4。

3 討論

艾滋病是由于感染攻擊機(jī)體CD4+T淋巴細(xì)胞的HIV病毒引起，HIV病毒入侵機(jī)體，會導(dǎo)致免疫系統(tǒng)癱瘓，為各種病原菌感染提供便利，較難治愈，死亡率較高，其中TB是艾滋病人群非常容易感染的并發(fā)癥，能促進(jìn)患者病情惡化，加速患者死亡，危害極大，對于免疫系統(tǒng)已經(jīng)受損的機(jī)體來說，感染TB后，早期臨床表現(xiàn)并不明顯，此時稱為結(jié)核潛伏感染（LTBI），結(jié)核桿菌在免疫系統(tǒng)低下的機(jī)體內(nèi)能重新大量復(fù)制，出現(xiàn)臨床癥狀時已經(jīng)發(fā)展成了活動性肺結(jié)核[8]。因此，針對HIV合并TB的雙重感染，及時診斷，就能避免延誤治療時機(jī)，及時切斷病菌的進(jìn)一步傳播，降低死亡率。臨床上TB傳統(tǒng)診斷主要依靠涂片法、影像學(xué)檢查、培養(yǎng)法、結(jié)核抗體法、血沉檢查等，每一種檢查方法都有明顯的缺陷，診斷的可靠性較低[9-10]。作為TB檢驗(yàn)金標(biāo)準(zhǔn)的病原學(xué)涂片，無法辨識死菌和活菌，對結(jié)核分枝桿菌及其分枝也不能較好的區(qū)分，而培養(yǎng)法耗時較長，除此之外，上述方法在HIV合并TB的患者中也不能獲得較高的陽性率[11]。由于機(jī)體CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)越低，患者臨床癥狀表現(xiàn)越不明顯，從而影響影像學(xué)診斷的正確率， ESR、結(jié)核抗體等不能檢測患者血清中的所有結(jié)核抗體，且存在干擾[12]。TST所用PPD為混合蛋白，與卡介苗等非結(jié)核分枝桿菌（NTM）之間也能發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致在TB的診斷過程中出現(xiàn)假陽性率，受到免疫抑制劑的影響而出現(xiàn)假陰性率，同時，該實(shí)驗(yàn)主要依靠醫(yī)務(wù)人員主觀判讀，容易存在一定的誤差，導(dǎo)致診斷結(jié)果不夠精確[13]。T-SPOT診斷TB感染是依靠酶聯(lián)斑點(diǎn)雜交計(jì)數(shù)（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）檢測體外活化的免疫細(xì)胞數(shù)，通過觀察細(xì)胞數(shù)目變化，判斷TB感染是否存在，該法以ESAT-6 和 CFP-10蛋白作為診斷抗原，刺激外周血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，較好的避開了普遍缺失這兩種蛋白的 BCG和非結(jié)核桿菌的干擾，擁有很高的特異性，除此之外，該方法在體外進(jìn)行試驗(yàn)，24 ～ 48h即可通過儀器客觀判讀結(jié)果，較快較好的降低誤差率[14]。通過研究文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前對TB診斷的方法均能受到機(jī)體免疫狀態(tài)的影響，機(jī)體最重要的免疫細(xì)胞CD4+T淋巴細(xì)胞，在HIV患者中大量被HIV病毒攻擊，導(dǎo)致免疫反應(yīng)不明顯而不能很好的診斷HIV合并TB[15]。準(zhǔn)確評估患者細(xì)胞免疫狀況的關(guān)鍵，是快速精確的檢測CD4+T淋巴細(xì)胞的計(jì)數(shù)，需采用最先進(jìn)最準(zhǔn)確的免疫檢測方法，流式細(xì)胞術(shù)是目前最常用的，同時也符合本研究要求[11-12]。

本研究結(jié)果表明，T-SPOT與TST在HIV（+）TB待排組和HIV（-）TB待排組中診斷的一致性良好，CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)增加會引起T-SPOT與TST對TB診斷的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度提高，且T-SPOT明顯優(yōu)于TST。提示HIV（+）患者免疫功能低下，CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)目減少，對TST診斷結(jié)果造成較大偏差，使得T-SPOT檢測結(jié)果更為可信。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致[9-12]。

綜上所述，考慮到CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響，T-SPOT對HIV合并LTBI早期診斷比TST更有價值，值得在臨床擴(kuò)大應(yīng)用。

[1] 陸建紅，吳奕征，楊勇，等.結(jié)核T細(xì)胞酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)診斷結(jié)核性腦膜炎的應(yīng)用價值[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2016，26（6）：816-818.

[2] 鄒丹鳳，肖和平，尹洪云.結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)在HIV/AIDS合并結(jié)核病診斷中的應(yīng)用[J].同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版 )，2015，36（5）：74-78.

[3] 羅丹，潘建華.T淋巴亞群及T-SPOT.TB檢測對活動性結(jié)核病的鑒別診斷[J].中國熱帶醫(yī)學(xué)，2015，15（4）：393-396.

[4] 柳明波，梁欣，翁國慶，等.(1，3)-β-D葡聚糖檢測聯(lián)合CD4+T 淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)對AIDS合并侵襲性真菌病的診斷價值 [J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2015，30（8）：787-790.

[5] 葉魏，孟成艷，韓曉輝，等.酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)快速檢測結(jié)核分枝桿菌感染的應(yīng)用評價[J].中國國境衛(wèi)生檢疫雜志，2013，36（6）：361-364.

[6] 聶尚丹，王軍，黃程，等.肺結(jié)核患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞凋亡的研究[J].中國病原生物學(xué)雜志，2013，8（4）：322-324.

[7] 陳少文，林翀，林明冠，等.結(jié)核分枝桿菌的病原學(xué)檢測及耐藥性分析[J].中國病原生物學(xué)雜志，2015，10（5）：446-449.

[8] 沈佳胤，盧洪洲.艾滋病合并結(jié)核病的防治研究進(jìn)展 [J].中國艾滋病性病， 2015，21（6）：543-546.

[9] 崔哲哲，林玫，藍(lán)如束，等.癥狀篩查與影像學(xué)檢查在結(jié)核桿菌/艾滋病病毒雙重感染監(jiān)測中的應(yīng)用評價[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2017，44（11）：2071-2075

[10] 錢宏波，郭蕊，趙漢東，等.γ-干擾素體外釋放試驗(yàn)在艾滋病并發(fā)結(jié)核感染診斷中的應(yīng)用價值探討[J].現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2016，31（4）：35-37.

[11] 王愛彬，楊思園，蔣榮猛，等.結(jié)核感染T淋巴細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)檢測艾滋病合并結(jié)核病患者的敏感度及影響因素[J].中華傳染病雜志，2016，34（11）：660-664.

[12] 謝靜，邱志峰，韓揚(yáng)，等.HIV/AIDS患者外周血CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)相關(guān)性的多中心研究[J].中華內(nèi)科雜志，2015，54（2）：118-121.

[13] CorbettEL,WattcJ,WalkerN,et al.The growing burden of Tuberculosis：globaltrends and interactions with the HIVepidemic.[J].Arch Intern Med，2003，163（9）：1009-1021.

[14] Talati NJ，Gonzalez-Diaz E，Mutemba C，et al. Diagnosis of latent tuberculosis infection among HIV discordant partners using interferon gamma release assays[J].BMC Infect Dis，2011，30（11）：264.

[15] Oni T，Gideon HP，Bangani N，et al.Risk factors associated with indeterminate gamma interferon responses in the assessment of latent tuberculosis infection in a high-incidence environment[J].Clin Vaccine Immunol，2012，19（8）：1243-1247.

2017-08-15）