前 言

阿片類鎮(zhèn)痛藥，如嗎啡，仍然是處理嚴重的、圍手術(shù)期和慢性疼痛的主要藥物。在過去的幾十年中，隨著疼痛急劇增多，阿片類藥物廣泛用于疼痛管理明顯增加。 在美國，阿片藥物處方的增長伴隨成癮率上升，及相關(guān)死亡率急劇增高，即稱為阿片流行病。長期阿片類藥物使用可導(dǎo)致鎮(zhèn)痛耐受，在固定藥物劑量時鎮(zhèn)痛效力逐漸減弱，且出現(xiàn)矛盾的阿片誘導(dǎo)的痛覺過敏 (OIH)。 耐受和OIH是削弱疼痛控制和劑量增加的主要驅(qū)動因素，迫切需要能減緩阿片耐受和OIH，同時又能增強阿片藥物鎮(zhèn)痛作用的新治療策略來增加病人的安全性。

雖然阿片鎮(zhèn)痛原理來自于結(jié)合和信號疼痛神經(jīng)回路MORs，但細胞類型、以及介導(dǎo)耐受和OIH的受體仍然存在爭議。耐受和OIH是外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的MORs在分子水平、以及在突觸、細胞和通路水平復(fù)雜改變的自適應(yīng)過程。因此，長期阿片類藥物會改變神經(jīng)元MOR功能，包括通過受體磷酸化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、多聚交聯(lián)等，這可能是耐受和OIH的基礎(chǔ)。其它研究表明神經(jīng)膠質(zhì)細胞，尤其是小膠質(zhì)細胞，是阿片耐受性和OIH的重要貢獻者。慢性阿片類物質(zhì)引起小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞活化，干擾神經(jīng)膠質(zhì)功能顯示降低耐受性和OIH。從機制上來說，以前的研究提出神經(jīng)膠質(zhì)細胞表達MORs，阿片樣物質(zhì)與MOR結(jié)合激活小膠質(zhì)細胞。但是，小膠質(zhì)細胞中表達MOR缺少明確的證據(jù)，其他研究支持嗎啡結(jié)合并激活小膠質(zhì)細胞中Toll樣受體4 (TLR4) 和MD-2信號的觀點。除爭議之外，最近發(fā)現(xiàn)TLR4敲除 (KO)小鼠中的耐受性和OIH沒有變化。因此，神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細胞相比的貢獻，以及啟動鎮(zhèn)痛耐受和OHI的分子機制，仍然懸而未決。

阿片樣物質(zhì)改變MOR表達神經(jīng)元的性質(zhì)并連接于背根神經(jīng)節(jié)、脊髓背角和腦（包括腦干下行疼痛控制系統(tǒng)）的傷害性回路水平。 初級傳入傷害感受器的MOR作為嗎啡耐受和OIH啟動位點的功能有特別意義，因為這種細胞類型涉及阿片類鎮(zhèn)痛耐受、身體依賴和促傷害感受效應(yīng)的發(fā)展。持續(xù)疼痛時，在CNS環(huán)路下游，傷害感受器經(jīng)歷和驅(qū)動促傷害感受可塑性變化。 電生理研究已經(jīng)證明阿片類藥物不僅抑制傷害感受器和背角神經(jīng)元之間神經(jīng)傳遞，但也可以產(chǎn)生適應(yīng)不良的可塑性，如長時程增強 (LTP)。阿片類物質(zhì)誘導(dǎo)的LTP被認為是OIH關(guān)鍵的神經(jīng)學(xué)基礎(chǔ)，并可能導(dǎo)致耐受。阿片誘導(dǎo)的LTP的突觸前和突觸后來源目前尚有爭議，LTP是否由傷害性感受器或脊髓神經(jīng)元中的MOR激活尚不清楚。 值得注意的是，以前的報告已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TRPV1傷害感受器的消除不僅消除了阿片樣物質(zhì)誘導(dǎo)的LTP，但也減少耐受和OIH。鑒于本研究和其他人已經(jīng)表明MORs主要由DRG中肽能的TRPV1傷害感受器表達，本文驗證了這個假說，即表達在傷害感受器的MOR代表了一種重要的、在傷害性環(huán)路中驅(qū)動鎮(zhèn)痛耐受和OIH的不良適應(yīng)機制啟動的易感因素。

結(jié) 果

1.嗎啡耐受和OIH需要MORs參與，但小膠質(zhì)細胞激活不需要

作者首先驗證了是否可以通過檢測小膠質(zhì)細胞激活將嗎啡耐受和OIH分開，與此同時，檢測野生型對照組和MOR KO小鼠在嗎啡處理時對小膠質(zhì)細胞激活、抗傷害感受耐受和OIH的影響。在野生型小鼠中，慢性嗎啡處理 （每日一次10 mg/kg劑量，或每日兩次從10 mg/kg遞增到40 mg/kg）產(chǎn)生了顯著的鎮(zhèn)痛耐受和OIH，以及明顯的以CD11b密度增加為證據(jù)的小膠質(zhì)細胞激活，值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)用逐級遞增劑量的嗎啡處理MOR KO小鼠，顯示相當(dāng)明顯的的小神經(jīng)膠質(zhì)細胞激活，但不產(chǎn)生OIH。

2.小膠質(zhì)細胞缺乏Oprm1 mRNA轉(zhuǎn)錄物，MOR標(biāo)記蛋白和MOR免疫源性

為了進一步調(diào)查OIH和小膠質(zhì)細胞激活之間的機制關(guān)系，作者使用免疫組化 (IHC)，原位雜交 (ISH)和表達熒光標(biāo)記受體 (MOR-mCherry) 的敲入小鼠來建立表達MORs細胞群。作者發(fā)現(xiàn)MORs表達于傷害感受神經(jīng)元DRG和脊髓背角。然而，背角切片的檢測并沒有提供小膠質(zhì)細胞中表達Oprm1 mRNA轉(zhuǎn)錄物（編碼典型的七跨膜蛋白的MOR），抗MOR免疫源性或MORmCherry的清晰證據(jù)，如CX3CR1-GFP或CD11b免疫陽性。本研究用RNA測序(RNA-seq)轉(zhuǎn)錄分析了急性純化的非培養(yǎng)的成年小鼠脊髓小膠質(zhì)細胞。分析了編碼跨膜七個蛋白質(zhì)的外顯子，以及選擇性剪接變異體和Oprm1的截短受體的表達。與DRG不同，在純化的脊髓小膠質(zhì)細胞中沒有檢測到任何Oprm1轉(zhuǎn)錄物。RNA測序讀取相反方向的Ipcef1基因部分與Oprm1重疊，但沒有讀取到與外顯子1-4連接的Oprm1 (這是表達七跨膜蛋白的要求)。在慢性神經(jīng)性疼痛小鼠或長期嗎啡處理的小鼠，也檢測不到小膠質(zhì)細胞外顯子1-4連接的Oprm1。神經(jīng)元中的MOR可能驅(qū)動阿片類傷害性副作用的啟動。

3.基因敲除傷害感受器的MOR不減輕全身嗎啡的抗傷害感受

緊接著本研究試圖確定促使嗎啡鎮(zhèn)痛、以及啟動耐受和OIH的特定MOR陽性神經(jīng)元群，由于采用傳統(tǒng)的藥理學(xué)方法難以探到突觸前后MOR的特殊功能，利用小鼠基因工程技術(shù)，產(chǎn)生缺失MORs的TRPV1神經(jīng)元譜系的條件性基因敲除小鼠（MOR cKO小鼠）。攜帶外顯子2和3的Oprm1等位基因loxP與表達受Trpv1基因啟動子驅(qū)動的Cre重組酶敲入小鼠進行交配。 在成年小鼠，TRPV1很大程度上限定于肽能傷害感受器，但也在非肽能和發(fā)育早期的有髓傷害感受器表達，導(dǎo)致絕大多數(shù)傷害性感受器的Cre介導(dǎo)重組。從而MOR cKO小鼠DRG的Oprm1基因選擇性切除，脊髓或腦中的保持完整。熒光ISH和IHC實驗顯示MOR cKO小鼠Oprm1僅在6.3% (ISH)和4.2% (IHC)的背根神經(jīng)元表達,在同窩對照組中表達為42.6% (ISH)和38.7%(IHC)。在脊髓背角CGRP 陽性的I層和II層外部，MOR免疫反應(yīng)明顯降低，而在IB4陽性的II層有微弱MOR信號表達，并表達于脊髓中間神經(jīng)元。

臨床上，阿片類藥物對感覺和痛苦體驗的情感維度都有緩解作用。接下來評估基礎(chǔ)傷害性感受和MOR cKO鼠的嗎啡抗傷害感受，監(jiān)測傷害性感覺反射和情感動機行為。條件性MOR敲除鼠呈現(xiàn)出與同窩對照組相似的，對熱和機械刺激的基礎(chǔ)傷害性反射和情感動機反應(yīng)。值得注意的是，雖然對照組小鼠急性鞘內(nèi)注射嗎啡 (1 μg) 產(chǎn)生了強烈的抗傷害感受，但在條件性MOR敲除鼠，嗎啡鞘內(nèi)注射沒有產(chǎn)生明顯的反應(yīng)或情感動機的抗傷害感受，表明這種脊髓阿片樣物質(zhì)的抗傷害作用主要來源于傷害感受器中的突觸前MOR信號傳導(dǎo)。相比之下，條件性MOR敲除鼠皮下注射嗎啡 (10 mg/kg) 產(chǎn)生最大反應(yīng)和情感動機的抗傷害效應(yīng)。

4.嗎啡作用于傷害感受器的MORs預(yù)示嗎啡耐受和OIH的啟動

本研究評估了條件性MOR敲除小鼠中嗎啡鎮(zhèn)痛耐受性和OIH的發(fā)展。作者用全身固定劑量的嗎啡（10 mg/kg，皮下注射）每日一次，持續(xù)10天處理小鼠。在每日注射前和注射后30分鐘測量熱和機械傷害閾值，以及對有害熱刺激的情緒動機反應(yīng)來分別評估OIH和耐受性。值得注意的是，發(fā)現(xiàn)雖然嗎啡在同窩對照組中抗傷害感受效應(yīng)逐漸減弱，而在MOR cKO小鼠，嗎啡全天保持接近完全鎮(zhèn)痛效果。此外，MOR cKO小鼠對熱和機械刺激產(chǎn)生較對照小鼠明顯少的OIH。這一結(jié)果提示長期阿片類藥物的作用于傷害感受器表達的MORs，觸發(fā)了促傷害感受適應(yīng)不良的可塑性起始，導(dǎo)致鎮(zhèn)痛耐受性和OIH。

5.阿片類物質(zhì)誘導(dǎo)MOR依賴的脊髓突觸前形式的LTP

阿片類藥物不僅可以急性抑制脊髓的突觸傳遞，還會引發(fā)興奮性可塑性機制，例如LTP。 是否激活突觸前或突觸后膜MOR的信號機制觸發(fā)阿片類物質(zhì)誘導(dǎo)的LTP尚不清楚。為回答此問題，作者采用在TRPV1傷害感受器表達光激活通道視紫紅質(zhì)2 (ChR2) 的條件性MOR敲除鼠及同窩對照鼠，來檢測傷害感受器和脊髓神經(jīng)元之間的突觸傳遞。作者證實了DRG傷害感受器胞體及中樞突在脊髓I層和II層外ChR2-eYFP的表達。并作了此神經(jīng)元與單突觸的全細胞記錄。用MOR激動劑-腦啡肽 (DAMGO) 作用在所記錄的神經(jīng)元5分鐘后,光誘發(fā)的興奮性突觸后電流 (EPSCs) 出現(xiàn)快速抑制（在施用5分鐘時抑制52%±10.5%）。30分鐘后沖洗DAMGO，EPSC振幅增強至142.2%±6.1%，這與以前的報告一致。這種阿片誘導(dǎo)LTP在記錄期間持續(xù)存在。值得注意的是，發(fā)現(xiàn)在MOR cKO小鼠，所記錄的9個神經(jīng)元中DAMGO誘導(dǎo)的抑制和LTP有9個完全丟失 （對照的98%±8.12%DAMGO沖洗：96.2%±11.9%）?？偟膩碚f，該結(jié)果確定了TRPV1傷害性感受器突觸前MOR信號對于阿片類藥物誘導(dǎo)的LTP脊髓適應(yīng)不良的是至關(guān)重要的。

6.外周MOR阻斷可預(yù)防嗎啡耐受和OIH的發(fā)生

條件性敲除Oprm1證實在DRG傷害感受器中MOR信號的喪失可預(yù)防嗎啡鎮(zhèn)痛耐受和OIH發(fā)生。作者推斷外周MOR藥理性阻斷可同樣緩解此類阿片類藥物的副作用。在野生型C57Bl/6J小鼠中，作者用甲基納曲酮溴化物 (MNB)——一種不透過血腦屏障MOR拮抗劑皮下注射，發(fā)現(xiàn)嗎啡用藥極大減少傷害性反射，并有效緩解情感動機行為。作者用MNB (0.1～10.0 mg/kg) 的聯(lián)合處理沒有改變嗎啡抗傷害作用，接下來用固定嗎啡 (10 mg/kg) 和MNB (0.1～10.0 mg/kg) 的組合，或嗎啡，每天一次，持續(xù)7天來處理小鼠，確定MNB是否能夠有效阻止阿片類鎮(zhèn)痛耐受和OIH。作者發(fā)現(xiàn)，嗎啡加MNB共同治療，小鼠耐受和OIH發(fā)生呈劑量依賴性下降。MNB聯(lián)合治療的用藥不產(chǎn)生任何測試劑量的身體戒斷行為

7.MNB和嗎啡聯(lián)合治療長效緩解慢性疼痛

臨床上阿片類藥物是用于管理圍術(shù)期的和慢性的疼痛。作者接下來評估了持續(xù)性疼痛時嗎啡和MNB聯(lián)合治療的鎮(zhèn)痛效果。作者使用了脛骨骨折和骨釘扎模型的骨創(chuàng)傷炎性疼痛，發(fā)現(xiàn)雖然單獨用嗎啡 (10 mg/kg)很快產(chǎn)生抗傷害感受，長時間治療7 d后的嗎啡不再有效地減少原軀干痛傷害性刺激或情感動機。相比之下，嗎啡 (10 mg/kg) 和MNB(10 mg/kg) 的聯(lián)合療法產(chǎn)生強烈的抗機械傷害性感受超敏反應(yīng)，以及情感動機疼痛反應(yīng)，并不出現(xiàn)耐受。此外，在長期聯(lián)合治療期間沒有觀察到OIH。同樣，在神經(jīng)病理性CCI模型中嗎啡和MNB聯(lián)合治療也阻止了鎮(zhèn)痛耐受的發(fā)展。總之，該研究的藥理作用結(jié)果揭示了阿片類外周拮抗劑具有限制長期阿片類使用所致的促傷害感受的副作用的潛在價值。

討 論

本文研究確定了阿片信號作為關(guān)鍵的分子，通過初級傳入傷害感受器的MORs，而不是脊髓小膠質(zhì)細胞，觸發(fā)傷害性神經(jīng)環(huán)路中適應(yīng)不良可塑性改變，從而導(dǎo)致鎮(zhèn)痛耐受和OIH。在長期阿片類藥物治療之后，MOR的幾種細胞類型和回路被發(fā)生改變，包括在DRG的水平傷害感受器、脊髓神經(jīng)元、脊髓小膠質(zhì)細胞、腦干核團、皮質(zhì)下和皮質(zhì)腦區(qū)。作者提出嗎啡誘導(dǎo)的表達MOR的傷害感受器敏化，可易化CNS疼痛和鎮(zhèn)痛環(huán)路的下游可塑性變化，促進OIH和嗎啡耐受。因此，消除外周MOR信號可使阿片類藥物中樞鎮(zhèn)痛作用保留。

非選擇性藥理性膠質(zhì)細胞抑制劑，如米諾環(huán)素和propentofylline，是所熟知的可減輕嚙齒動物的阿片耐受，最近有提出嗎啡作用于表達在小膠質(zhì)細胞上的MORs，激活這些細胞并啟動OIH。與以前從體外和體內(nèi)研究的調(diào)查結(jié)果相反，本研究用多種組織學(xué)方法和高度敏感的、非培養(yǎng)急性純化的成年脊髓小膠質(zhì)細胞的RNA陣列，并沒有發(fā)現(xiàn)支持MOR在小膠質(zhì)細胞表達的可信的證據(jù)。很顯然，在培養(yǎng)條件下的神經(jīng)膠質(zhì)細胞可展示出改變的表型，從而與它們在體內(nèi)基因表達的類型不一致，包括受體的異位表達。值得注意的是，與本研究的發(fā)現(xiàn)一致，在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的大規(guī)模RNA測序研究以及ISH實驗，提示小膠質(zhì)細胞不表達MORs。作者也發(fā)現(xiàn)MOR KO小鼠顯示完整的嗎啡誘導(dǎo)的小神經(jīng)膠質(zhì)細胞激活，但不表達OIH，表明在OIH和小膠質(zhì)細胞的組織學(xué)指征無關(guān)。該分子機制暗示，在長期嗎啡處理小膠質(zhì)細胞激活期間，必須通過受體而不是MOR介導(dǎo)發(fā)生。小膠質(zhì)細胞激活的幾種途徑強調(diào)觸發(fā)小神經(jīng)膠質(zhì)細胞增生過程的復(fù)雜性，強調(diào)了從神經(jīng)元釋放分子的可能性，除了嗎啡對小膠質(zhì)細胞的直接作用之外，可能與以下所觀察到的嗎啡處理的激活反應(yīng)有關(guān)。例如，識別小膠質(zhì)細胞上的TLR4受體可能通過神經(jīng)元釋放的結(jié)合損傷相關(guān)的分子類型(DAMPs)或通過結(jié)合嗎啡本身引發(fā)激活，但最后一點仍依然存在爭議。最近的研究提出TLR4對嗎啡或阿片耐受和痛覺過敏的所致的小膠質(zhì)細胞活化不是必須的。其它提出控制小膠質(zhì)細胞活化狀態(tài)的關(guān)鍵調(diào)質(zhì)包括TLR2，小膠質(zhì)細胞ATP受體P2X4和CSF1R。因此，作者提出阿片樣作用表達是通過傷害性感受器上的MORs，而不是小膠質(zhì)細胞，觸發(fā)疼痛通路中的下游事件發(fā)生，這些反而促進分子，突觸和網(wǎng)絡(luò)水平的適應(yīng)，導(dǎo)致耐受和OIH，以及小膠質(zhì)細胞激活和LTP。

阿片誘導(dǎo)的脊髓傷害性感受器的LTP現(xiàn)被認為是OIH的基本促進因素，也可能促使嗎啡耐受。然而，阿片類藥物誘導(dǎo)的脊髓LTP機制仍然存在爭議，特別是突觸前與突觸后的啟動過程。目前，在TRPV1傷害感受器和背角神經(jīng)元間的光遺傳訊號的突觸傳遞揭示，消除突觸前MOR不僅消除DAMGO誘導(dǎo)的神經(jīng)傳遞抑制，也消除了LTP，支持突觸前起源假說。因此本文提出，長期阿片類藥物暴露時，傷害感受器中MOR長時間激活，具有重要的促傷害感受作用，并且通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)整個傷害性感受通路來驅(qū)動耐受和OHI發(fā)展，進而啟動下游可塑性變化。此時并不能確切得出傷害性感受器中促進嗎啡耐受和OIH發(fā)生的MOR的細胞定（如在傷害感受器皮膚外周神經(jīng)末梢、傷害感受器軸索或傷害感受器細胞體）。但值得指出的是，反復(fù)皮內(nèi)給予MOR激動劑，可以說只作用于傷害性感受器外周末端的MOR，或外周作用的阿片類藥物洛哌丁胺慢性給藥足以誘導(dǎo)OIH和鎮(zhèn)痛耐受。

雖然阿片類藥物仍然廣泛用于圍手術(shù)期、癌痛和慢性非癌癥疼痛的治療，近期重新評估阿片類藥物的副作用，強調(diào)劑量增加是致死性和并發(fā)癥增多的直接因素。風(fēng)險減緩策略可潛在減少嗎啡耐受和OIH，限制劑量升級，是目前阿片流行病的迫切需要。根據(jù)作者條件性MOR敲除鼠和MNB對未損傷的小鼠、圍術(shù)期和慢性疼痛的的研究結(jié)果，作者提出，通過阻斷傷害性感受器的MOR可改善人類的嗎啡耐受。外周限制性的阿片拮抗劑，如MNB和口服納絡(luò)酮，是臨床用于治療非癌痛病人阿片誘導(dǎo)的便秘，臨床試驗沒有發(fā)現(xiàn)這些藥物給藥后疼痛或戒斷癥狀增加或僅輕微增加。迄今為止，沒有臨床研究直接評估外周性MOR拮抗劑減少阿片類鎮(zhèn)痛藥耐受性的效果。不過，最近的三期臨床試驗報告，MNB對阿片類藥物引起的便秘發(fā)現(xiàn)，與安慰劑相比，服用MNB (12 mg，隔日1次) 1～4周后可穩(wěn)定或減少嗎啡使用，視覺模擬評分量表(visual analogue scale, VAS)評分沒有增加。此外，口服緩釋羥考酮聯(lián)合納洛酮對慢性疼痛病人的疼痛緩解與便秘觀察發(fā)現(xiàn)，與治療單獨使用羥考酮相比，前者對疼痛的緩解更為顯著，可明顯減低疼痛評分。鑒于阿片拮抗劑納洛酮具有非常低的口服生物利用度和極大的首過代謝效應(yīng)，在此情況下，該結(jié)果提示納絡(luò)酮是通過阻止外周阿片受體起作用。相反，一項臨床研究報告表明MNB治療增加病人在手術(shù)后的第一個4小時嗎啡消耗量，但之后無此作用。特別高劑量的MNB (0.9 mg/kg) 使用，即比目前推薦治療劑量高6倍的量，且比之前的劑量高兩倍，顯示有中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用，可能導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的阻斷，因此MNB的外周限制性被認為是劑量依賴性的。與這種可能性一致，接受高劑量MNB而不是安慰劑的病人，表現(xiàn)出較高的惡心和嘔吐發(fā)生率，提示阻斷中樞MOR后的撤藥綜合征，可以解釋嗎啡消耗量的增加。值得注意的是，這一發(fā)現(xiàn)以及使用外周MOR拮抗劑的臨床前研究提示，MOR外周信號促使在受傷后數(shù)小時內(nèi)發(fā)生內(nèi)源性鎮(zhèn)痛。而中樞MOR信號介導(dǎo)更長的時間的從傷后幾天到幾個月內(nèi)源性鎮(zhèn)痛。的確，本研究沒有發(fā)現(xiàn)MNB增加骨創(chuàng)傷或神經(jīng)損傷相關(guān)的疼痛，表明內(nèi)源性鎮(zhèn)痛機制不受這種治療的影響。

本研究得出結(jié)論，表達在初級傳入傷害性感受器的MORs，驅(qū)使對阿片類藥物的不利反應(yīng)促進鎮(zhèn)痛耐受和OIH的發(fā)生。本研究的數(shù)據(jù)支持，在限制潛在有害的阿片類藥物劑量遞增時，阻斷外周MOR信號來維持完全長時間疼痛控制的治療策略。人類試驗的設(shè)計旨在嚴格評估阿片激動劑/外周阿片拮抗劑聯(lián)合用于有恰當(dāng)阿片類藥物反應(yīng)的疼痛病人的潛在轉(zhuǎn)化價值，將對于開發(fā)更安全，更有效的疼痛管理策略至關(guān)重要。