吳 彪 劉志鴻 周麗青 孫秀俊 王澤江 楊愛(ài)國(guó)①

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071;2. 山東省五蓮縣許孟鎮(zhèn)水利站 日照 262315)

魁蚶(Scapharca broughtonii)是一種大型冷溫性蚶類, 廣泛分布于太平洋西部沿岸, 因其個(gè)體大、肉味鮮美, 并富含蛋白質(zhì)和多種維生素, 在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)深受喜愛(ài), 是我國(guó)黃、渤海區(qū)的重要經(jīng)濟(jì)貝類(吳彪等,2012)。最近幾年, 由于消費(fèi)市場(chǎng)及增殖放流活動(dòng)對(duì)魁蚶的需求量激增, 帶動(dòng)了苗種繁育產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展?？罓I(yíng)體外受精、體外發(fā)育的生殖方式, 卵子排出體外后的受精、發(fā)育等過(guò)程完全暴露于水環(huán)境中。處在開(kāi)放水體中的胚胎或者幼體非常容易受到病原微生物的侵染, 導(dǎo)致胚胎孵化率下降、幼體生長(zhǎng)緩慢, 甚至死亡, 嚴(yán)重影響人工繁育魁蚶的幼苗出庫(kù)率和苗種質(zhì)量。胚胎發(fā)育早期, 個(gè)體自身免疫系統(tǒng)尚未形成或發(fā)育不完善, 除受精膜第一道免疫防線外, 多數(shù)水產(chǎn)動(dòng)物能夠通過(guò)卵子從母體獲得免疫因子而具備一定的免疫力, 即母源性免疫。因此, 母源免疫因子對(duì)胚胎早期的正常發(fā)育具有重要的免疫保護(hù)作用。

母源免疫研究已在哺乳類、鳥(niǎo)類、爬行類等多種動(dòng)物中廣泛開(kāi)展(Bandrick et al, 2014; Blanco et al,2015), 但在水產(chǎn)動(dòng)物中的相關(guān)研究起步較晚, 已有的報(bào)道主要集中在魚(yú)、蝦等少數(shù)物種(Huang et al,1999; Swain et al, 2009)。在高等的脊椎動(dòng)物中, 通過(guò)免疫母體來(lái)增強(qiáng)子代免疫力已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用, 如用黏液囊病病毒疫苗免疫母雞, 其子代卵黃囊中有不同水平的黏液囊病病毒抗體存在, 能夠?qū)ψ哟缙诎l(fā)育發(fā)揮免疫保護(hù)作用(Grindstaff et al, 2006)。目前高等動(dòng)物的相關(guān)研究多關(guān)注于抗體的傳遞和作用,但是關(guān)于水產(chǎn)動(dòng)物的一些研究已經(jīng)證明, 除抗體外,補(bǔ)體、溶菌酶、凝集素等非特異性免疫因子也能夠通過(guò)卵子傳遞給子代, 發(fā)揮重要的免疫功能(Yousif et al, 1991; Olafsen, 1996; L?voll et al, 2006; Wang et al,2009), 尤其是對(duì)主要依靠非特異性免疫系統(tǒng)進(jìn)行機(jī)體免疫反應(yīng)的軟體動(dòng)物更重要。目前關(guān)于貝類的研究報(bào)道較少, 母源性免疫因子的轉(zhuǎn)移特點(diǎn)及在子代早期的變化規(guī)律尚不清楚, 明確該問(wèn)題是開(kāi)發(fā)利用母源免疫的前提和基礎(chǔ), 對(duì)提高貝類胚胎和幼蟲(chóng)早期免疫力具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。

大防御素(big-defensin), 是一種富含半胱氨酸的抗菌肽, 最先在鱉(Saito et al, 1995)中發(fā)現(xiàn), 后來(lái)在菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinesis)(Wei et al, 2003;Zhao et al, 2010)、海灣扇貝(Argopecten irradians)(Zhao et al, 2007)、蝦夷扇貝(Patinopecten yesoensis)(于赫男, 2012)、長(zhǎng)牡蠣(Crassostrea gigas)(Rosa et al,2015)、三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)(Wang et al, 2014)等多種貝類中也被證實(shí)存在, 且具有廣譜的抗革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌及真菌的生物活性, 發(fā)揮重要的免疫保護(hù)作用。Li等(2012)克隆獲得了魁蚶大防御素基因cDNA序列, 為本研究的開(kāi)展奠定了前期基礎(chǔ)。本研究擬通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)技術(shù)從mRNA和蛋白質(zhì)水平上檢測(cè)魁蚶胚胎及幼蟲(chóng)發(fā)育早期大防御素的表達(dá)變化, 以明確大防御素從母體向子代傳遞和表達(dá)規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 魁蚶苗種繁育及樣品收集

實(shí)驗(yàn)用的魁蚶親貝取自山東省長(zhǎng)島縣海區(qū), 在親本自然繁育期前一個(gè)月從海區(qū)捕獲后轉(zhuǎn)移至育苗車間升溫促熟。性腺成熟后, 利用升溫過(guò)濾海水刺激以誘導(dǎo)親本產(chǎn)卵、排精, 建立兩個(gè)同父異母半同胞家系。同一母本的卵細(xì)胞在受精后即刻被平均分成兩組,一組在22°C的充氣海水中孵化、培育, 為對(duì)照組; 另一組則在含有5×108CFU/L鰻弧菌(Vibrio anguillarum)的同條件海水中培育, 為鰻弧菌脅迫處理組。培育期間, 以投喂金藻為主, 配合小球藻等其他單胞藻, 日換水2—3次。

實(shí)驗(yàn)樣品的收集時(shí)間分別為: 卵細(xì)胞期、受精卵期、多細(xì)胞期、囊胚期、擔(dān)輪幼蟲(chóng)前期、擔(dān)輪幼蟲(chóng)后期、D形幼蟲(chóng)期和殼頂幼蟲(chóng)期。用500目或300目篩絹在上述各幼體發(fā)育時(shí)期隨機(jī)收集實(shí)驗(yàn)材料。材料固定方法如下, RNA提取材料: 加入Trizol后, 液氮速凍后保存于–80°C; 蛋白質(zhì)提取材料: 樣品先置于預(yù)冷的無(wú)菌Tris-HCl緩沖液中(pH8.0), 4°C下超聲波細(xì)胞破碎儀將樣品充分破碎, 6000×g離心30min后, 取上清液氮速凍, 保存于–80°C。

1.2 RNA的提取及qRT-PCR檢測(cè)

總RNA的提取參考Zheng等(2015)的方法, 并稍作修改。樣品去除Trizol后, 分別經(jīng)過(guò)Solution D、氯仿/異戊醇、β-巰基乙醇充分裂解, 水飽和酚/氯仿/異戊醇兩次抽提, 異丙醇/醋酸鈉沉淀、75%乙醇兩次洗滌后, RNA溶于RNA-free水中, 并加入DNaseⅠ去除基因組DNA。運(yùn)用超微量分光光度計(jì)(A260/A280值)和瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA濃度及完整性。根據(jù)試劑盒PrimeScript? RT reagent Kit(TaKaRa)說(shuō)明書(shū)合成cDNA第一條鏈用于qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。

以上各時(shí)間點(diǎn)樣品中大防御素 mRNA表達(dá)水平通過(guò) qRT-PCR進(jìn)行檢測(cè), 具體操作方法參照 Wu等(2015)的方法進(jìn)行。根據(jù)已有的魁蚶大防御素基因的cDNA序列(GenBank登錄號(hào): JQ782659), 用 Primer Premier 5.0設(shè)計(jì) qRT-PCR 引物(序列為 F:ACCTTTTGTTGTCCACG, R: TGTTCTACACCACCC TC), 選用魁蚶 β-actin基因作為內(nèi)參基因(引物序列為F: GGTTACACTTTCACCACCACAG, R: ACCGG AAGTTTCCATACCTAAGA)。qRT-PCR在儀器LineGene 9600(BIOER)上進(jìn)行, 反應(yīng)體系為25μL, 具體包括: ExTaq12.5μL、正反向引物(10μmol/L)各0.5μL、cDNA模板2μL、滅菌蒸餾水9.5μL。具體反應(yīng)程序?yàn)? 94°C預(yù)變性 2min, 94°C變性30s, 62°C退火30s, 72°C延伸30s, 40個(gè)循環(huán)。內(nèi)參基因與目的基因分管同時(shí)進(jìn)行, 每個(gè)樣品重復(fù)3次, 利用儀器軟件計(jì)算各樣品 Ct值, 數(shù)據(jù)取平均值。將卵細(xì)胞時(shí)期mRNA含量作為參照1, 采用2–Ct△△法對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行相對(duì)定量分析(Livak et al, 2001)。運(yùn)用SPSS軟件, 采用t檢驗(yàn)法檢測(cè)每個(gè)相同發(fā)育時(shí)期處理組與正常組之間的差異性, 單因素方差分析不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)量差異, 差異顯著水平設(shè)為P<0.05, 極顯著水平為P<0.01。

1.3 魁蚶大防御素蛋白水平的ELISA檢測(cè)

魁蚶大防御素抗體由艾比瑪特生物醫(yī)藥有限公司提供, 利用抗原蛋白免疫健康兔子七次后純化獲得。不同發(fā)育時(shí)期大防御素蛋白含量通過(guò) ELISA檢測(cè), 具體操作參照劉帥帥等(2013)的方法進(jìn)行。主要過(guò)程為: 運(yùn)用 BCA法測(cè)定每份樣品總蛋白濃度并調(diào)整至濃度一致后, 取200μL樣品加入酶標(biāo)板, 4°C過(guò)夜后棄去殘液, 之后用PBST洗滌3次; 用300μL10%的脫脂奶粉于 37°C中孵育 2h, 去掉封閉液并用PBST洗板3次; 加入1:1000稀釋的魁蚶大防御素抗體 100μL, 37°C 孵育 2h, PBST洗滌 3次; 加入 1∶2000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗100μL, 37°C 孵育 2h, PBST 洗滌 4次; 加入 100μL 辣根酶底物 TMB溶液, 避光條件下 37°C條件下反應(yīng)10min后, 加入2mol/L的硫酸50μL以終止反應(yīng)。用PBS溶液代替樣品作為陰性對(duì)照, 其余條件與上述相同。每個(gè)樣品設(shè)置三個(gè)平行, 酶標(biāo)儀讀取OD450吸光值。以制備抗體時(shí)所用的蛋白抗原為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線和曲線方程, 通過(guò)方程用OD值計(jì)算各樣品中大防御素蛋白的濃度。將卵細(xì)胞時(shí)期大防御素蛋白含量視為參照 1, 計(jì)算每個(gè)發(fā)育時(shí)期蛋白含量的相對(duì)值,繪制蛋白表達(dá)變化趨勢(shì)圖。差異顯著性檢驗(yàn)與上述qRT-PCR差異分析方法相同。

2 結(jié)果

2.1 mRNA水平的動(dòng)態(tài)變化

魁蚶大防御素 mRNA在兩個(gè)魁蚶家系的幼蟲(chóng)發(fā)育早期表達(dá)變化如圖1所示。從圖1中可以看出, F1、F2兩家系的對(duì)照組和脅迫處理組 mRNA的變化趨勢(shì)基本相同, 即先降后升, 但家系之間、以及同家系對(duì)照組和處理組之間在變化幅度和時(shí)間上有一定差別。結(jié)合表 1的差異顯著性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn), 在 F1家系中,大防御素在卵細(xì)胞受精后開(kāi)始降低, 對(duì)照組和處理組分別在囊胚期和多細(xì)胞期達(dá)到最低值, 分別為卵細(xì)胞期的0.27倍和0.23倍, 之后開(kāi)始上調(diào)表達(dá); 正常組中, 多細(xì)胞期、囊胚期的表達(dá)量極顯著低于卵細(xì)胞期(P<0.01), 經(jīng)多細(xì)胞期的最低值后上調(diào), 至 D形幼蟲(chóng)期達(dá)到最高值, 差異達(dá)到顯著水平(P<0.05); 而脅迫處理組, 除了受精卵期, 其余各發(fā)育期的表達(dá)量與卵細(xì)胞期相比均達(dá)到了極顯著差異, 經(jīng)囊胚期最低值后開(kāi)始不斷升高, 殼頂幼蟲(chóng)期達(dá)到卵細(xì)胞期的 3.8倍; 對(duì)照組與處理組相比, 對(duì)照組在多細(xì)胞期極顯著高于處理組, 在殼頂幼蟲(chóng)期極顯著低于處理組, 囊胚期之后的各階段, 處理組高于正常組, 但差異不顯著。F2家系與F1表現(xiàn)出基本相同的變化趨勢(shì), 也是先下降至最低, 之后擔(dān)輪幼蟲(chóng)前期開(kāi)始顯著上調(diào); 擔(dān)輪幼蟲(chóng)期至殼頂幼蟲(chóng)期, 正常組和處理組的表達(dá)量與卵細(xì)胞期的表達(dá)均達(dá)到了顯著或極顯著水平; 兩組之間, 受精卵期、囊胚期、殼頂幼蟲(chóng)期具有顯著差異。

圖1 魁蚶大防御素mRNA在魁蚶幼蟲(chóng)不同發(fā)育時(shí)期的變化Fig.1 The big-defensin mRNA during the early-larvae developmental stage of S. broughtonii

2.2 蛋白水平的動(dòng)態(tài)變化

大防御素蛋白水平的表達(dá)變化如圖2所示, 顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表 2。結(jié)果表明, 大防御素蛋白在魁蚶幼體早期發(fā)育階段與 mRNA的變化趨勢(shì)基本相似,同樣表現(xiàn)為先下降后升高, 而且在升高階段, 處理組表達(dá)量普遍高于正常組。F1家系中, 正常組蛋白從受精后開(kāi)始下降, 多細(xì)胞期、囊胚期下降至極顯著水平,之后開(kāi)始逐漸升高, 但均未達(dá)到顯著水平; 而處理組,多細(xì)胞期、囊胚期、擔(dān)輪幼蟲(chóng)前期、殼頂幼蟲(chóng)期與卵細(xì)胞期有極顯著差異, D形幼蟲(chóng)期則具有顯著差異;兩組之間, 處理組從囊胚期之后高于對(duì)照組, 但只有囊胚期和擔(dān)輪幼蟲(chóng)前期時(shí)差異達(dá)到顯著(P<0.05)。F2家系趨勢(shì)與F1基本相同, 囊胚期前, 處理組低于正常組; 擔(dān)輪幼蟲(chóng)前期之后, 處理組高于對(duì)照組, 其中擔(dān)輪幼蟲(chóng)前期、擔(dān)輪幼蟲(chóng)后期和殼頂幼蟲(chóng)期的差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

表1 魁蚶大防御素mRNA變化的顯著性檢驗(yàn)Tab.1 Significance test on big-defensin mRNA

表2 魁蚶大防御素蛋白變化的顯著性檢驗(yàn)Tab.2 Significance test on big-defensin protein

圖2 魁蚶大防御素蛋白在魁蚶幼蟲(chóng)不同發(fā)育時(shí)期的動(dòng)態(tài)變化Fig.2 The big-defensin protein during the early-larvae developmental stage of S. broughtonii

3 討論

傳代免疫效應(yīng)是母體免疫力通過(guò)母源性物質(zhì)傳遞給后代, 從而使子代擁有一定的免疫能力。母體產(chǎn)生的一些抗體以及凝集素、溶菌酶等先天性免疫因子從母體向子代傳遞, 并發(fā)揮免疫保護(hù)作用, 已經(jīng)在很多動(dòng)物中得到證實(shí)(張士璀等, 2007; Wanget al, 2009,2010, 2012)。與脊椎動(dòng)物研究相比, 目前有關(guān)無(wú)脊椎動(dòng)物母源免疫方面的研究報(bào)道較少。不過(guò), 也有研究證明一些頭索動(dòng)物、軟體動(dòng)物也同樣存在這種被動(dòng)的母體免疫。如, 刁明月(2015)在文昌魚(yú)(Branchiostoma lanceolatum)1—2細(xì)胞期的受精卵液中發(fā)現(xiàn)了以蛋白和mRNA存在的α2巨球蛋白, 并證實(shí)這種母源性蛋白發(fā)揮了重要的抑菌作用; 岳峰(2013)在櫛孔扇貝(Chlamys farreri)卵細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有 CfCu/Zn-SOD、CfLBP/BPI、CfLBP、CfLec-3和CfLYZ的mRNA和蛋白表達(dá)。本研究在魁蚶卵細(xì)胞期檢測(cè)到了大防御素mRNA和蛋白, 這與上述的研究結(jié)果相一致, 進(jìn)一步證實(shí)了無(wú)脊椎動(dòng)物先天免疫因子的母源傳遞現(xiàn)象。

認(rèn)識(shí)免疫因子在子代的傳遞表達(dá)規(guī)律是母源免疫的重要研究?jī)?nèi)容, 也是開(kāi)發(fā)利用母源免疫的前提和基礎(chǔ)。通過(guò)對(duì)兩個(gè)魁蚶家系幼蟲(chóng)不同發(fā)育階段的檢測(cè), 本研究發(fā)現(xiàn)大防御素 mRNA和蛋白的表達(dá)規(guī)律基本一致, 即自受精后開(kāi)始持續(xù)下降, 一般至囊胚期都維持在比較低的水平, 從擔(dān)輪幼蟲(chóng)期開(kāi)始, 含量開(kāi)始迅速上升, 這與已有的研究報(bào)道結(jié)果相似。大西洋鮭(Salmo salar)卵細(xì)胞中的抗體在受精后開(kāi)始下降,經(jīng)過(guò)孵化期、仔魚(yú)期, 直至幼魚(yú)自身合成抗體, 水平開(kāi)始迅速上升(Olsenet al, 1997); 王鴻淼(2012)運(yùn)用Western檢測(cè)發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)(Danio rerio)母源性 IgM從受精后開(kāi)始減少, 至第5天檢測(cè)不到抗體。這些結(jié)果說(shuō)明, 母源性的免疫因子在卵細(xì)胞受精后開(kāi)始被逐步消耗, 含量不斷下降, 直至幼體開(kāi)始自身合成, 含量開(kāi)始升高。本研究中, 魁蚶大防御素含量基本在擔(dān)輪幼蟲(chóng)期開(kāi)始升高, 而且 mRNA的變化幅度比蛋白水平更大, 這表明此時(shí)的魁蚶幼蟲(chóng)可能已經(jīng)開(kāi)始自身合成大防御素。岳峰(2013)發(fā)現(xiàn)櫛孔扇貝模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor, PRR)分子CfPGRP-S1、CfLGBP、CfLec-1和CfLec-3的 mRNA在擔(dān)輪幼蟲(chóng)期開(kāi)始大量表達(dá), 利用整體免疫熒光定位進(jìn)一步證實(shí)了其表達(dá)部位最早是出現(xiàn)在擔(dān)輪幼蟲(chóng)基部的兩側(cè)對(duì)稱細(xì)胞中, 認(rèn)為此時(shí)是扇貝免疫系統(tǒng)的最早形成期。這可以解釋本研究中大防御素含量為什么在擔(dān)輪幼蟲(chóng)期開(kāi)始升高, 同時(shí)也說(shuō)明魁蚶的免疫系統(tǒng)也可能在此時(shí)形成, 當(dāng)然, 這還需要更多的證據(jù)來(lái)證明。

免疫刺激能夠增強(qiáng)免疫因子的表達(dá), 這在許多物種中已有報(bào)道。如, 鰻弧菌刺激能夠增強(qiáng)蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis)卵黃蛋白原(Wu et al,2015)、魁蚶鐵蛋白(Zheng et al, 2016)及半乳糖凝集素(鄭利兵等, 2015)這些免疫因子的表達(dá)等。本研究中, 擔(dān)輪幼蟲(chóng)之前, 處理組與對(duì)照組大防御素的表達(dá)量基本相當(dāng), 互有高低; 而之后的時(shí)期, 處理組表達(dá)量基本高于對(duì)照組, 但差異未全部都達(dá)到顯著水平。這與魁蚶成體受到鰻弧菌刺激后的響應(yīng)情況有差別。Li等(2012)研究了鰻弧菌刺激魁蚶成體后,血細(xì)胞和肝胰腺中大防御素mRNA的動(dòng)態(tài)變化, 結(jié)果表明, 刺激 8h后血細(xì)胞中的表達(dá)量顯著升高, 至16h時(shí)上調(diào)至最高值; 肝胰腺中的表達(dá)量在24h達(dá)到最高值。而且, 最高值分別是對(duì)照組的 10.25倍和5.14倍?？梢?jiàn), 擔(dān)輪幼蟲(chóng)期后的幼體對(duì)鰻弧菌刺激的響應(yīng)與成體相似, 受刺激后大防御素均上調(diào)表達(dá),但是響應(yīng)程度不如成體。這可能是由于幼體免疫系統(tǒng)發(fā)育并不完善, 再加上鰻弧菌沒(méi)有進(jìn)行滅活而具有致病性, 可能會(huì)使得部分幼蟲(chóng)機(jī)體發(fā)育受阻而影響其免疫活性因子的合成。岳峰(2013)的研究表明,用滅活的鰻弧菌對(duì)櫛孔扇貝親貝進(jìn)行免疫刺激后,許多免疫分子的蛋白表達(dá)在子代卵細(xì)胞、胚胎或幼蟲(chóng)中均明顯升高, 且免疫刺激組的抗菌活力顯著高于對(duì)照。這給我們新的提示, 在充分了解先天免疫因子在子代表達(dá)規(guī)律前提下, 結(jié)合母源免疫開(kāi)發(fā)提高母源免疫因子含量的方法, 能夠有效增強(qiáng)子代的免疫抵抗力, 可以為科學(xué)制定提高子代早期成活率的策略提供理論依據(jù), 對(duì)魁蚶苗種繁育產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

4 結(jié)論

本文通過(guò)qRT-PCR和ELISA檢測(cè)了魁蚶胚胎及幼體早期發(fā)育過(guò)程中大防御素在 mRNA水平和蛋白質(zhì)水平上的動(dòng)態(tài)變化, 發(fā)現(xiàn)母源性大防御素能夠通過(guò)卵細(xì)胞傳遞給子代, 并在卵子受精后被逐漸消耗。幼體發(fā)育至擔(dān)輪幼蟲(chóng)期可能具備了自身合成大防御素的能力, 使幼體體內(nèi)大防御素含量增加, 并且鰻弧菌刺激能夠促進(jìn)其增加幅度。

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