陳夢(mèng)丹 朱 凱 徐鑄婕 李長(zhǎng)紅 苗 亮 陳 炯

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室 寧波 315211)

鐵蛋白(Ferritin, Fer)是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種鐵儲(chǔ)存蛋白, 在維持機(jī)體鐵平衡中發(fā)揮著重要作用。Fer的結(jié)構(gòu)高度保守, 由24個(gè)亞基圍繞形成的巨大復(fù)合體, 中間含有一個(gè)中空球體, 內(nèi)部可儲(chǔ)存4500個(gè)鐵原子(Harrison et al, 1996; Orino et al, 2008)。鐵蛋白中的鐵以三價(jià)鐵離子氧化物的形式存在, 不僅能儲(chǔ)存機(jī)體內(nèi)過剩的鐵, 為含鐵元素蛋白質(zhì)的合成提供鐵原子, 還能防止鐵氧化過程中所產(chǎn)生的自由基帶來的傷害(Harrison et al, 1996; Orino et al, 2008)。哺乳動(dòng)物Fer通常由輕鏈(light chain, L)和重鏈(heavy chain, H)兩種鐵蛋白亞基組成, 其中H亞基通過將二價(jià)鐵氧化為三價(jià)鐵實(shí)現(xiàn)快速解毒(Clegg et al, 1981),L亞基在鐵的礦化、鐵核晶體形成和長(zhǎng)期儲(chǔ)存中發(fā)揮重要作用(Levi et al, 1994)。在魚類和兩棲類動(dòng)物等低等脊椎動(dòng)物中, 通常還具有中型鏈(middle chain, M)(Dickey et al, 1987; Andersen et al, 1995; Zhang et al,2010; Elvitigala et al, 2013; Oh et al, 2016)。由于具有FTH亞基的鐵氧化酶中心和FTL亞基鐵成核位點(diǎn), M亞基兼具H和L亞基的功能(Torti et al, 2002)。除具有鐵離子儲(chǔ)存和抗氧化損傷功能, Fer在機(jī)體免疫反應(yīng)中也起著重要作用。

香魚(Plecoglossus altivelis)是日本、中國和朝鮮等東亞地區(qū)國家特有的一種小型名貴經(jīng)濟(jì)魚類。近年來,由于長(zhǎng)期集約化養(yǎng)殖、種質(zhì)退化和環(huán)境污染等諸多原因, 細(xì)菌性病害頻繁發(fā)生, 對(duì)香魚養(yǎng)殖業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失(李長(zhǎng)紅等, 2009)。人工養(yǎng)殖香魚要求無污染和綠色健康, 抗生素和農(nóng)藥的使用受到諸多限制。因此, 迫切需要深入研究香魚的免疫機(jī)制, 為指導(dǎo)病害防治和抗病遺傳育種奠定理論基礎(chǔ)。鑒于Ferritin在動(dòng)物抗菌免疫反應(yīng)中的重要作用, 我們擬對(duì)香魚Fer(PaFer)進(jìn)行研究, 測(cè)定其基因cDNA序列, 分析其結(jié)構(gòu)特征、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系及其mRNA在組織中的表達(dá)特征, 并研究鰻弧菌感染后香魚重要組織中 PaFer mRNA的表達(dá)變化; 原核表達(dá)PaFer重組蛋白并純化復(fù)性, 分析其鐵結(jié)合和抑菌活性, 為進(jìn)一步深入研究魚類Ferritin在魚類的鐵代謝及免疫機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)所用的健康香魚(20—25g)購自寧波水產(chǎn)大世界, 規(guī)格均一、健康無傷。創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)香魚分離株ayu-H080701、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、大腸桿菌(Escherichia coli) BL21 plys E和TG1菌株、載體pET-28a等由本實(shí)驗(yàn)室保存。RNAiso試劑、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、T4 DNA連接酶、pMD19-T Simple Vector、Ex Taq DNA聚合酶、Ni-NTA SefinoseTM試劑盒和SYBR Premix Ex Taq試劑盒均購于 TaKaRa公司(日本); 菲洛嗪試劑購自生工生物工程(上海)股份有限公司; Gel Extraction Kit購于Omega公司(美國); 引物合成及序列測(cè)定由英維捷基貿(mào)易有限公司(上海)完成。

1.2 組織樣品制備

香魚暫養(yǎng)7d后, 隨機(jī)選取5尾, 分別采集肝、心、腎、腦、脾、腸、鰓和肌肉等組織, 立即放入液氮中,隨后保存于實(shí)驗(yàn)室–70℃超低溫冰箱, 用于分析PaFer基因mRNA的組織表達(dá)特征。剩余香魚隨機(jī)分成感染組和對(duì)照組, 各30尾。感染組以1.0×104CFU/尾的感染濃度腹腔注射鰻弧菌懸液(李長(zhǎng)紅等, 2009),對(duì)照組注射等體積無菌生理鹽水。感染組和對(duì)照組香魚于注射后4、8、12和24h采集血液和組織樣品, 每組每次取4尾香魚。組織采集方法同上。

1.3 PaFer基因cDNA序列獲得及分析

采用Illumina HisSeq 2000測(cè)序平臺(tái)對(duì)香魚頭腎來源的單核/巨噬細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序, 從測(cè)序結(jié)果中獲得PaFer基因cDNA序列, 并通過特異引物PCR擴(kuò)增和和序列測(cè)定的方法進(jìn)行驗(yàn)證。同源蛋白序列比對(duì)采用 BLASTP 軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/); 多重序列比對(duì)采用 ClustalW 軟件(http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/); 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建采用MEGA 5.0軟件(Tamura et al, 2011); 蛋白分子量大小及等電點(diǎn)預(yù)測(cè)采用Compute pI/Mw程序 (http://web.expasy.org/compute_pi/); 信號(hào)肽序列預(yù)測(cè)采用SignalP 4.1軟件 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/);N糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)采用 NetCGlyc 1.0軟件 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCGlyc/); 保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)采用 PROSITE軟件(http://kr.expasy.org/prosite/);二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)參考Rost(1996)的方法。

氨基酸序列多重比對(duì)及進(jìn)化樹構(gòu)建所用序列詳見表1。

1.4 不同組織中PaFer mRNA的表達(dá)

采用 qPCR分析健康香魚不同組織中 PaFer mRNA的表達(dá), 以及鰻弧菌感染后不同時(shí)間段 PaFermRNA在各組織中轉(zhuǎn)錄水平變化。參照 Li等(2015)的方法進(jìn)行總RNA的抽提、DNase I處理、第一鏈cDNA合成及qPCR檢測(cè)。

表1 多重比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建采用序列Tab.1 The sequences used for multiple alignment and phylogenetic tree construction

根據(jù)獲得PaFer cDNA序列設(shè)計(jì)引物, 引物序列如下:

PaFer(+): 5′-GCTGGAGAAGAACGTCAACC-3′;

PaFer(-): 5′-GCGTCCATCTTGGTGAGATT-3′。

預(yù)期擴(kuò)增片段為165bp。

以香魚β-actin基因(登錄號(hào): AB020884)作為內(nèi)參,擴(kuò)增引物序列如下:

pActin2(+): 5′-TCGTGCGTGACATCAAGGAG-3′;

pActin2(–): 5′-CGCACTTCATGATGCTGTTG-3′。

預(yù)期擴(kuò)增片段為231bp (Li et al, 2014)。

qPCR 擴(kuò)增體系(25μL): SYBR Premix Ex Taq (2×)緩沖液 12.5μL、cDNA 模板 0.5μL、引物(10μmol/L)各 1μL, 超純水補(bǔ)足至 25μL。擴(kuò)增反應(yīng)在 ABI Step One熒光定量 PCR儀(美國)上進(jìn)行, 反應(yīng)條件為:94 ℃ 3min (預(yù)變性, 1個(gè)循環(huán)); 94℃ 30s, 58℃ 30s,72 ℃ 30s (擴(kuò)增段, 40個(gè)循環(huán)); 94 ℃ 30s, 72℃ 60s,95 ℃ 3 0s (融解階段, 1個(gè)循環(huán))。qPCR監(jiān)測(cè)時(shí)每個(gè)樣品重復(fù) 3次, 包括目的基因(PaFer)和內(nèi)參基因(β-actin)。根據(jù)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法 2–ΔΔCt分析 PaFer mRNA的相對(duì)表達(dá)量(Livak et al, 2001)。

1.5 原核表達(dá)和蛋白純化

根據(jù)PaFer的ORF設(shè)計(jì)原核表達(dá)引物, 引物序列如下:

pET-28a-PaFer(+): 5′-GGAATTC ATGGAGTCTC AGATCCGCC-3′;

pET-28a-PaFer(–): 5′-CAAGCTT TTAGCTCTGG CTCCCCAAG-3′。

下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶 EcoR I和 Hind III的識(shí)別序列, 斜體字母為保護(hù)堿基。PCR擴(kuò)增體系(25μL): 10×LA buffer 2.5μL, dNTP (2.5mmol/L) 3.5μL,cDNA 模板 1μL, 上下游引物(10μmol/L)各 1μL, LA Taq DNA聚合酶0.25μL, ddH2O 15.75μL。擴(kuò)增反應(yīng)在Mastercycler pro梯度PCR儀(德國eppendorf公司)上進(jìn)行, 反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性2min; 94℃變性30s,56℃退火30s, 72℃延伸1.5min, 共30個(gè)循環(huán), 循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離、切膠純化后, 用 EcoRⅠ和 HindⅢ雙酶切后, 與同樣酶切的原核表達(dá)載體 pET-28a相連接, 獲得重組質(zhì)粒pET28a-PaFer。pET28a-PaFer轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21 pLys E菌株, IPTG誘導(dǎo)表達(dá), 細(xì)菌總蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離, 考馬斯亮藍(lán)G-250染色檢測(cè) PaFer重組蛋白(rPaFer)表達(dá)情況。

轉(zhuǎn)化菌經(jīng) IPTG大量誘導(dǎo)后, 收集大腸桿菌, 于4℃ 8000g離心10min, 棄上清, 加入PBS重懸浮細(xì)菌沉淀, 超聲波破碎3次, 4 ℃ 8 000g離心10min, 獲得包涵體沉淀, PBS洗滌 5次后, 將用結(jié)合緩沖液(20mmol/L Tris-HCl, 8mol/L尿素, 500mmol/L NaCl,5mmol/L咪唑, pH 8.0)洗滌, 然后4 ℃ 12000r/min離心 30min, 收集上清用于存化復(fù)性。按照 Ni-NTA SefinoseTM試劑盒說明書, 取洗滌后蛋白溶液, 上樣至預(yù)平衡的Ni2+柱中, 依次用洗滌緩沖液1和洗滌緩沖液2洗脫去除雜蛋白, 最后洗滌緩沖液洗脫目的蛋白。收集每一步的洗脫液, 經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)樣品的蛋白質(zhì)純度。

1.6 鐵離子螯合能力測(cè)定

采用 Bradford法(Bradford, 1976)測(cè)定純化復(fù)性的rPaFer濃度, 以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)樣。冷凍干燥后保存, 用于后續(xù)結(jié)合鐵和抑菌實(shí)驗(yàn)。rPaFer螯合鐵離子的能力測(cè)定參照 De Zoysa等(2007)提出的方法并略作改進(jìn)。具體步驟如下: 分別將 1mL不同濃度rPaFer水溶液 (0, 2, 4, 6, 8和 10μg/mL)加至 20μL FeCl2(2mmol/L)中, 然后加入 40μL 菲洛嗪試劑(5mmol/L), 混勻, 室溫振蕩孵育10min。采用分光光度計(jì)(Ultrospec 1100 Pro UV/Visible spectrophotometer)于波長(zhǎng) 562nm測(cè)定溶液的吸光值。每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。根據(jù)下面公式計(jì)算rPaFer的鐵離子螯合能力:

鐵離子螯合能力(%) = [C－(S－B)]/C×100

其中, S表示rPaFer樣品水溶液反應(yīng)后的吸光值, C表示水替代反應(yīng)體系中樣品溶液后的吸光值, B表示水代替反應(yīng)中的FeCl2溶液后的吸光值。

1.7 抗菌活性分析

參照Chang等(2006)的方法, 采用二倍稀釋法將rPaFer原液稀釋至 100、50、25、12.5、6.25、3.125和1.5625μg/mL共7個(gè)濃度。將創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌、鰻弧菌和溶藻弧菌活化后, 30℃培養(yǎng)18h后用無菌生理鹽水稀釋至1.0×105CFU/mL菌懸液備用。將稀釋后的菌懸液接種至 96孔 U型微量滴定板內(nèi)(20μL/孔), 然后加入不同濃度的PaFer蛋白到各孔內(nèi)(80μL/孔), 混勻后置30℃恒溫培養(yǎng)24h。以不接菌的為空白對(duì)照組, 采用Varioskan Flash全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀(Thermo Fisher)測(cè)定OD600值。以細(xì)菌沒有生長(zhǎng)的最小藥物濃度作為rPaFer抑制4種弧菌的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC), 重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±S.D.), 采用 SPSS 13.0軟件中的單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì), P<0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 PaFer cDNA序列分析

PaFer cDNA序列包含943bp核苷酸(GenBank登錄號(hào): FR714867), 包含一個(gè)完整的、長(zhǎng)度為531bp的ORF, 預(yù)測(cè)編碼一個(gè)由176個(gè)氨基酸組成、相對(duì)分子質(zhì)量約為20.4kDa的多肽, 預(yù)測(cè)理論等電點(diǎn)為5.46, N末端不存在信號(hào)肽序列。

通過PROSITE工具對(duì)PaFer氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè), 結(jié)果表明, PaFer在氨基酸7—156位存在保守的鐵蛋白樣雙鐵結(jié)構(gòu)域(ferritin-like di-iron domain), 并且僅存在 1個(gè)鐵離子結(jié)合區(qū)域信號(hào)(iron-binding region signature, IBRS2) (123–DPHLCD FLETHYLNEQVEAIK–143) (圖 1)。通過 NCBI的 CDD工具預(yù)測(cè)表明, 鐵氧化酶雙鐵中心鐵結(jié)合位點(diǎn)具有 7個(gè)高度保守的氨基酸殘基(24E, 31Y, 58E, 59E, 62H,104E和138Q) (圖1), 這7個(gè)殘基在H和M亞基中作為鐵離子配體發(fā)揮作用(Lawson et al, 1989; Arosio et al, 2009)。哺乳動(dòng)物L(fēng)亞基成核位置中3個(gè)帶負(fù)電荷氨基酸殘基(E54, E57和E61) (Santambrogio et al,1996)也存在于 PaFer, 但 E57被 D57取代(圖 1)。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明, PaFer存在 4個(gè) α螺旋, 分別為4—38、45—72、93—120 和 124—154(圖 1), 這個(gè) 4螺旋束與哺乳動(dòng)物Fer的相似(Harrison et al, 1996)。

2.2 PaFer的系統(tǒng)進(jìn)化分析

氨基酸序列多重比對(duì)表明, PaFer與中國大鯢(Andrias davidianus)及其他魚類 Fer-M 同源性為68.5%—92.0%, 其中與胡瓜魚(Osmerus mordax)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)和大西洋鮭Fer-M的同源性分別為 91.9%、92.0%和 92.0%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明, 各物種 Fer-M、Fer-H和 Fer-L分別成簇, PaFer與胡瓜魚、大西洋鮭和虹鱒的 Fer-M 聚為一個(gè)小簇,與虹鱒Fer-M進(jìn)化相關(guān)性最高(圖2)。

2.3 PaFer mRNA的組織表達(dá)特征

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示, PaFer基因擴(kuò)增產(chǎn)物 mRNA在所檢的香魚各組織中均有表達(dá), 其中在脾臟中表達(dá)量最高, 腎臟、鰓、腦和心臟中的表達(dá)量次之, 肝臟和腸中表達(dá)量相對(duì)較少, 而在肌肉組織中表達(dá)量微弱(圖3)。

2.4 鰻弧菌侵染過程中香魚各組織PaFer mRNA表達(dá)變化

腹腔注射鰻弧菌后, 感染組香魚表現(xiàn)典型的弧菌病癥狀, 并能從肝、脾和腎等組織中分離出病原菌(結(jié)果未顯示), 對(duì)照組香魚無明顯癥狀。與對(duì)照組相比, 鰻弧菌感染4h后, 肝中PaFer mRNA的表達(dá)量顯著增加, 24h時(shí)達(dá)到峰值, 為對(duì)照組的 103.67倍(P<0.05); 脾和腎中PaFer mRNA表達(dá)量在感染8h后顯著增加, 均在24h時(shí)達(dá)到峰值, 分別為對(duì)照組5.75和 70.88倍(P<0.05)(圖 4)。

2.5 PaFer的原核表達(dá)及純化

重組質(zhì)粒 pET-28a-PaFer經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證無誤后, 轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 Plys E中, 加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá),菌體蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離及考馬斯亮藍(lán)G-250染色后, 出現(xiàn)一條高表達(dá)蛋白條帶, 相對(duì)分子質(zhì)量約為23kDa, 與預(yù)期大小相符(圖5)。利用重組質(zhì)粒攜帶的多組氨酸標(biāo)簽, 表達(dá)的重組蛋白經(jīng)Ni2+親和層析柱純化后經(jīng) SDS-PAGE檢測(cè), 顯示為單一條帶(圖 5),實(shí)現(xiàn)了重組蛋白 rPaFer的一步純化。純化的 rPaFer經(jīng)尿素梯度透析復(fù)性及透析去除尿素后, 用于檢測(cè)其活性。

2.6 PaFer結(jié)合鐵能力分析

菲洛嗪是一種高靈敏性的低鐵顯色劑, 能與Fe2+配位, 形成有色螯合物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 隨著 rPaFer濃度的增加, 各樣品的鐵離子螯合能力也隨之增加,當(dāng)濃度為 4μg/mL時(shí)達(dá)到峰值(43.96%), 之后進(jìn)入平臺(tái)期(圖 6)。

2.7 PaFer體外抑菌作用

利用酶標(biāo)儀測(cè)定 rPaFer蛋白對(duì) 4種魚類常見弧菌的體外抑菌活性, 結(jié)果表明, PaFer對(duì)鰻弧菌、溶藻弧菌和創(chuàng)傷弧菌均有抑制作用, 其 MIC值分別為:1.5625、25、100μg/mL, 對(duì)副溶血弧菌無明顯抑制作用。

3 討論

鐵蛋白調(diào)節(jié)鐵離子的儲(chǔ)存和釋放, 是魚類先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分。本研究在香魚單核/巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)上得到了香魚鐵蛋白基因。序列分析揭示, PaFer具有與其它物種鐵蛋白相似的結(jié)構(gòu)特征: 包括保守的鐵蛋白樣雙鐵結(jié)構(gòu)域、鐵氧化酶雙鐵中心鐵結(jié)合位點(diǎn)的 7個(gè)高度保守的氨基酸殘基及4個(gè)α螺旋等, 且與大西洋鮭和虹鱒Fer-M同源性最高, 為 92.0%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明, 各物種Fer-M、Fer-H和Fer-L分別成簇, PaFer與胡瓜魚、大西洋鮭和虹鱒的Fer-M聚為一個(gè)小簇, 與虹鱒Fer-M進(jìn)化相關(guān)性最高。

圖1 香魚與其他物種Fer氨基酸序列的多重比對(duì)Fig.1 Multiple alignment of fish Fer isoforms and those of other species

圖2 基于NJ法構(gòu)建的香魚和其他物種全長(zhǎng)鐵蛋白亞基氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic (Neighbor-joining) analysis of complete ferritin subunits from ayu and other species

圖3 健康香魚PaFer mRNA的組織表達(dá)特征Fig.3 The mRNA expression patterns of PaFer in various tissues of healthy ayu

表達(dá)特征分析表明, PaFer mRNA在健康香魚被檢組織中有不同程度的表達(dá), 且在脾臟中表達(dá)量最高, 與已報(bào)道的大黃魚(Zhang et al, 2010)、半滑舌鰨(Wang et al, 2011)、條石鯛(Elvitigala et al, 2013)和牙鲆(Wang et al, 2015)等魚類Fer-M在肝臟中表達(dá)最高不同。脾臟是機(jī)體參與貯鐵的主要器官之一, PaFer在脾臟中大量表達(dá), 揭示其可能在香魚鐵離子貯存中發(fā)揮重要的作用。目前, 已有較多文獻(xiàn)揭示魚類Fer的表達(dá)與病原體感染密切相關(guān), 主要體現(xiàn)為病原體感染后魚類 Fer基因表達(dá)顯著上調(diào)(Zhanget al,2010; Wanget al, 2011; Wanget al, 2015)。例如, 大黃魚感染弱化的活鰻弧菌后, 肝中Fer-M mRNA的表達(dá)在12h達(dá)到峰值, 上調(diào)4.4倍, 脾Fer-M mRNA的表達(dá)在12h達(dá)到峰值, 上調(diào)4.7倍, 腎臟Fer-M mRNA的表達(dá)量在5d時(shí)達(dá)到峰值, 上調(diào)4.4倍(Zhanget al,2010); 半滑舌鰨感染鰻弧菌后, 腎、脾和肝中Fer-M mRNA表達(dá)分別在48h、4h和1h時(shí)達(dá)到峰值, 分別約為對(duì)照組的62、48和11倍(Wanget al, 2011); 而半滑舌鰨感染海豚鏈球菌后, 腎、脾和肝中 Fer-M mRNA表達(dá)達(dá)到峰值的時(shí)間分別為24h、48h和24h,上調(diào)倍數(shù)也明顯低于鰻弧菌感染組(Wanget al, 2011);牙鲆感染遲緩愛德華菌后, FerM在頭腎、脾和肝中的表達(dá)量顯著上調(diào), 達(dá)到峰值的時(shí)間分別為 12h、24h和12h, 分別約為對(duì)照組的13、35和20倍(Wanget al,2015)。本研究中, 香魚感染鰻弧菌后, 肝、脾和腎中PaFer mRNA表達(dá)變化趨勢(shì)與上述研究結(jié)果相似, 但達(dá)到峰值的時(shí)間點(diǎn)和峰值不同, 肝、脾和腎中 PaFer mRNA均在感染 24h時(shí)達(dá)到最高, 分別為對(duì)照組的103.67、5.75和70.88倍, 揭示PaFer可能在香魚抗細(xì)菌侵染的免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。

圖4 鰻弧菌感染后香魚各組織中PaFer mRNA的表達(dá)變化Fig.4 Analysis on PaFer mRNA expression changes in various tissues of V. anguillarum infected ayu

圖5 PaFer的原核表達(dá)及純化Fig.5 Prokaryotic expression of PaFer in Escherichia coli and its purification

圖6 不同濃度rPaFer的鐵螯合能力Fig.6 Iron chelation activity of rPaFer in different concentrations

研究表明, 半滑舌鰨、條石鯛和牙鲆Fer-M重組蛋白表現(xiàn)出顯著的鐵螯合活性, 分別在濃度為 8、6和 8μg/mL時(shí)鐵螯合能力最強(qiáng)(Wanget al, 2011;Elvitigalaet al, 2013; Wanget al, 2015), 而且牙鲆Fer-M 重組蛋白能完全抑制遲緩愛德華氏菌的生長(zhǎng),半滑舌鰨Fer-M重組蛋白能完全抑制鰻弧菌的生長(zhǎng)。在本實(shí)驗(yàn)中, rPaFer具有明顯的鐵螯合能力, 并能體外抑制三種魚類重要的弧菌病原鰻弧菌、溶藻弧菌和創(chuàng)傷弧菌的生長(zhǎng), 與上述研究結(jié)果基本一致。結(jié)合病原菌感染誘導(dǎo)魚體各組織中Fer表達(dá)量大幅上調(diào)這一結(jié)果, 我們推測(cè), 由于鐵是大部分微生物生長(zhǎng)和維系其致病性的必需元素(Bullen, 1981), 當(dāng)病原菌感染魚體后, 短時(shí)間內(nèi)鐵蛋白大量合成, 一方面通過螯合環(huán)境中對(duì)細(xì)菌代謝所必需的鐵離子來抑制細(xì)菌的繁殖(Ong et al, 2006), 另一方面, 由于魚體血漿內(nèi)鐵離子含量大大降低(Lauffer, 1992), 大量合成的鐵蛋白可維持體內(nèi)鐵含量的穩(wěn)定, 從而參與調(diào)控鐵代謝以及抵抗微生物的宿主自身免疫過程。

4 結(jié)論

本研究測(cè)定了香魚 Ferritin基因的 cDNA序列,序列分析揭示它與虹鱒和大西洋鮭Ferritin M亞基序列最為相似。健康香魚中, PaFer mRNA在脾中表達(dá)量最高, 鰻弧菌感染后, PaFer mRNA在各組織中表達(dá)量顯著上調(diào); 鐵結(jié)合能力和抑菌活性實(shí)驗(yàn)表明,PaFer重組蛋白具有明顯的鐵結(jié)合能力, 且對(duì)鰻弧菌、溶藻弧菌和創(chuàng)傷弧菌生長(zhǎng)均有明顯抑制作用, 揭示PaFer與香魚抗病原感染的免疫反應(yīng)緊密相關(guān), 可能通過調(diào)控鐵代謝參與魚類抵抗微生物的宿主自身免疫過程。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究魚類鐵蛋白的結(jié)構(gòu)和功能機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

李長(zhǎng)紅, 陳 炯, 史雨紅等, 2009. 寧海地區(qū)香魚弧菌病病原菌鑒定. 微生物學(xué)報(bào), 49(7): 931—937

Andersen O, Dehli A, Standal H et al, 1995. Two ferritin subunits of Atlantic salmon (Salmo salar): cloning of the liver cDNAs and antibody preparation. Mol Mar Biol Biotechnol, 4(2): 164—170

Arosio P, Ingrassia R, Cavadini P, 2009. Ferritins: a family of molecules for iron storage, antioxidation and more. Biochim Biophys Acta Gen Subj, 1790(7): 589—599

Bradford M M, 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 72(1—2):248—254

Bullen J J, 1981. The significance of iron in infection. Clin Infect Dis, 3(6): 1127—1138

Chang C I, Zhang Y A, Zou J et al, 2006. Two cathelicidin genes are present in both rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and Atlantic salmon (Salmo salar). Antimicrob Agents Chemother, 50(1): 185—195

Clegg G A, Fitton J E, Harrison P M et al, 1981. Ferritin:molecular structure and iron-storage mechanisms. Prog Biophys Mol Biol, 36: 53—86

De Zoysa M, Lee J, 2007. Two ferritin subunits from disk abalone (Haliotis discus discus): cloning, characterization and expression analysis. Fish Shellfish Immunol, 23(3):624—635

Dickey L F, Sreedharan S, Theil E C et al, 1987. Differences in the regulation of messenger RNA for housekeeping and specialized-cell ferritin. A comparison of three distinct ferritin complementary DNAs, the corresponding subunits,and identification of the first processed in amphibia. J Biol Chem, 262(16): 7901—7907

Elvitigala D A S, Premachandra H K A, Whang I et al, 2013. A teleostean counterpart of ferritin M subunit from rock bream(Oplegnathus fasciatus): an active constituent in iron chelation and DNA protection against oxidative damage,with a modulated expression upon pathogen stress. Fish Shellfish Immunol, 35(5): 1455—1465

Harrison P M, Arosio P, 1996. The ferritins: molecular properties,iron storage function and cellular regulation. Biochim Biophys Acta Bioenerg, 1275(3): 161—203

Hu Y H, Zheng W J, Sun L, 2010. Identification and molecular analysis of a ferritin subunit from red drum (Sciaenops ocellatus). Fish Shellfish Immunol, 28(4): 678—686

Lauffer R B, 1992. Iron and Human Disease. Boca Raton: CRC Press

Lawson D M, Treffry A, Artymiuk P J et al, 1989. Identification of the ferroxidase centre in ferritin. FEBS Lett, 254(1—2):207—210

Lee J H, Pooley N J, Mohd-Adnan A et al, 2014. Cloning and characterisation of multiple ferritin isoforms in the Atlantic salmon (Salmo salar). PLoS One, 9(7): e103729

Levi S, Santambrogio P, Cozzi A et al, 1994. The role of the L-chain in ferritin iron incorporation: studies of homo and heteropolymers. J Mol Biol, 238(5): 649—654

Li C H, Lu X J, Li D F et al, 2014. Passive protective effect of chicken egg yolk immunoglobulins against experimental Vibrio anguillarum infection in ayu (Plecoglossus altivelis).Fish Shellfish Immunol, 37(1): 108—114

Li C H, Lu X J, Li M Y et al, 2015. Cathelicidin modulates the function of monocytes/macrophages via the P2X7 receptor in a teleost, Plecoglossus altivelis. Fish Shellfish Immunol,47(2): 878—885

Liu H, Takano T, Peatman E et al, 2010. Molecular characterization and gene expression of the channel catfish ferritin H subunit after bacterial infection and iron treatment.J Exp Zool Part A: Ecol Genet Physiol, 313A(6): 359—368

Livak K J, Schmittgen T D, 2001. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2?ΔΔCTmethod. Methods, 25(4): 402—408

Neves J V, Wilson J M, Rodrigues P N S, 2009. Transferrin and ferritin response to bacterial infection: the role of the liver and brain in fish. Dev Comp Immunol, 33(7): 848—857

Oh M, Umasuthan N, Elvitigala D A S et al, 2016. First comparative characterization of three distinct ferritin subunits from a teleost: evidence for immune-responsive mRNA expression and iron depriving activity of seahorse(Hippocampus abdominalis) ferritins. Fish Shellfish Immunol, 49: 450—460

Ong S T, Ho J Z S, Ho B et al, 2006. Iron-withholding strategy in innate immunity. Immunobiology, 211(4): 295—314

Orino K, Watanabe K, 2008. Molecular, physiological and clinical aspects of the iron storage protein ferritin. Vet J,178(2): 191—201

Rost B, 1996. PHD: predicting one-dimensional protein structure by profile-based neural networks. Methods Enzymol, 266:525—539

Santambrogio P, Levi S, Cozzi A et al, 1996. Evidence that the specificity of iron incorporation into homopolymers of human ferritin L- and H-chains is conferred by the nucleation and ferroxidase centres. Biochem J, 314(1):139—144

Scudiero R, Esposito M G, Trinchella F, 2013. Middle ferritin genes from the icefish Chionodraco rastrospinosus:comparative analysis and evolution of fish ferritins. C R Biol, 336(3): 134—141

Tamura K, Peterson D, Peterson N et al, 2011. MEGA5:Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol Biol Evol, 28(10): 2731—2739

Torti F M, Torti S V, 2002. Regulation of ferritin genes and protein. Blood, 99(10): 3505—3516

Wang J J, Sun L, 2015. Ferritin M of Paralichthys olivaceus possesses antimicrobial and antioxidative properties. Fish Physiol Biochem, 41(4): 951—959

Wang W, Zhang M, Sun L, 2011. Ferritin M of Cynoglossus semilaevis: an iron-binding protein and a broad-spectrum antimicrobial that depends on the integrity of the ferroxidase center and nucleation center for biological activity. Fish Shellfish Immunol, 31(2): 269—274

Zhang X, Wei W, Wu H Z et al, 2010. Gene cloning and characterization of ferritin H and M subunits from large yellow croaker (Pseudosciaena crocea). Fish Shellfish Immunol, 28(5—6): 735—742