楊夢(mèng)香 柴方超 周前進(jìn)① 苗 亮 黃光亮 陳 炯

(1. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院 寧波 315211; 2. 寧德市水產(chǎn)技術(shù)推廣站 寧德 352100)

河流弧菌為嗜鹽性革蘭性陰性菌, 廣泛分布于河流和近?？谒? 可導(dǎo)致魚(yú)蝦貝等多種水生動(dòng)物患病, 是海水養(yǎng)殖的主要病原菌之一(Baffone et al,2001)。同時(shí), 河流弧菌可從不同水體、城市污水、動(dòng)物和人類(lèi)糞便, 以及水產(chǎn)品中分離得到, 感染后導(dǎo)致人出現(xiàn)嚴(yán)重的水樣腹瀉, 伴隨嘔吐、腹痛、發(fā)燒, 以及不同程度的脫水等癥狀(Chowdhury et al, 2012;Ramamurthy et al, 2014)。在美國(guó), 該細(xì)菌還被認(rèn)為是引起嬰兒小腸結(jié)腸炎的重要病原之一(Bellet et al,1989)。因此, 河流弧菌已成為一種重要的全球性人獸共患病病原菌, 不僅危害水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展, 而且對(duì)人類(lèi)健康和食品安全也構(gòu)成了嚴(yán)重威脅, 因此亟待建立靈敏、快捷、特異的檢測(cè)技術(shù)用于基層檢測(cè)。

目前, 河流弧菌的檢測(cè)以傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化鑒定為主, 但是該方法存在檢測(cè)周期長(zhǎng)、費(fèi)時(shí)費(fèi)力等缺點(diǎn), 而且檢測(cè)人員需要專(zhuān)業(yè)的知識(shí)背景, 遠(yuǎn)不能滿足疾病的快速診斷和及時(shí)治療。尤其, 該病原菌被認(rèn)定為人獸共患病病原菌, 使得對(duì)于該病原的快速準(zhǔn)確鑒定變得更加重要。因以蛋白或核酸為檢測(cè)靶標(biāo)的分子檢測(cè)技術(shù)具有檢測(cè)快速、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn),在病原微生物的診斷和鑒定等領(lǐng)域得到廣泛使用,但關(guān)于河流弧菌分子檢測(cè)技術(shù)的報(bào)道還很少?；赑CR原理的核酸擴(kuò)增技術(shù)均以toxR基因作為檢測(cè)靶標(biāo)(Chakraborty et al, 2006; 曹際娟等, 2008; 文萬(wàn)僥等, 2009; Vinothkumar et al, 2013)。其中, 曹際娟等(2008)將 PCR技術(shù)與高效液相色譜聯(lián)合應(yīng)用于河流弧菌的檢測(cè), 也取得了較好的效果。鄢慶枇等(2006)使用滅活的河流弧菌抗原制備了效價(jià)較高的特異性抗血清, 利用該血清建立了河流弧菌的熒光抗體檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于牙鲆(Paralichthys olivaceus)體內(nèi)該病原的檢測(cè)。已有的這些方法存在著對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求高、工作環(huán)境嚴(yán)格等局限性, 僅限于實(shí)驗(yàn)室診斷, 不能很好地在基層檢測(cè)中普及推廣。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)自被報(bào)道以來(lái), 憑借其低設(shè)備依賴(lài)性、高靈敏度和特異性等優(yōu)勢(shì), 在病原微生物的檢測(cè)領(lǐng)域取得了巨大成功(Niemz et al, 2011; Mori et al, 2013)。但該方法在檢測(cè)過(guò)程的某些階段仍存在很大的提高空間。如何做到在有效、準(zhǔn)確判讀結(jié)果的基礎(chǔ)上, 使得產(chǎn)物的檢測(cè)過(guò)程也脫離對(duì)儀器設(shè)備的依賴(lài), 是 LAMP方法改進(jìn)性研究的重要方向。LAMP-LFD技術(shù)的原理是將LAMP的反應(yīng)產(chǎn)物與特異性的探針雜交, 通過(guò)熒光素標(biāo)記在橫向流動(dòng)試紙條(lateral flow dipstick, LFD)上完成顯色和結(jié)果判讀。該方法無(wú)需EB等有毒試劑, 也擺脫了對(duì)儀器設(shè)備的依賴(lài), 特異性探針可極大程度地降低了產(chǎn)物的假陽(yáng)性。該項(xiàng)技術(shù)目前已成功用于 ISKNV (Infectious spleen and kidney necrosis virus, 傳染性脾腎壞死病毒) (Ding et al, 2010)、IMNV (Infectious myonecrosis virus, 傳染性肌肉壞死病毒) (Puthawibool et al, 2009),以及海豚鏈球菌(Strepstococcus iniae)等水產(chǎn)病原微生物的檢測(cè)(王瑞娜等, 2014)。

作者在本文中根據(jù)河流弧菌外膜蛋白 ompU基因的保守區(qū), 設(shè)計(jì)出3對(duì)引物和1條異硫氰酸酯熒光素標(biāo)記的探針, 優(yōu)化反應(yīng)條件后, 建立了LAMP-LFD技術(shù), 以期為河流弧菌的現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)提供一種便捷可靠的方法。

1 材料與方法

1.1 菌種

河流弧菌(Vibrio fluvialis ATCC 33809)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila ATCC 7966)、哈維氏弧菌(V. harveyi ATCC 33866)和創(chuàng)傷弧菌(V. vulnificus ATCC 27562)購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏中心; 遲緩愛(ài)德華菌(Edwardsiella tarda MCCC 235)由中國(guó)海洋微生物菌種保藏管理中心惠贈(zèng); 溶藻弧菌(V.alginolyticus ATCC 17749)、海豚鏈球菌(Streptococcus iniae ATCC 29178)購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心; 銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027)和單增李斯特菌(Listeria monocytogenes ATCC 19115)購(gòu)自廣東省微生物菌種保藏中心; 鰻弧菌香魚(yú)分離株(V.anguillarum ayu-H080701)為本實(shí)驗(yàn)室保存的菌種。其中, 河流弧菌ATCC 33809用于LAMP-LFD的條件優(yōu)化和靈敏度分析實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的培養(yǎng)與基因組DNA制備 將實(shí)驗(yàn)所需的各弧菌從–70°C取出后, 在TCBS固體培養(yǎng)基上劃線接種, 28—30°C培養(yǎng)12—24h后, 挑取單菌落于堿性蛋白胨水中震蕩培養(yǎng)至所需濃度; 海豚鏈球菌、遲緩愛(ài)德華菌、嗜水氣單胞菌和單增李斯特菌劃線接種于LB或BHI固體培養(yǎng)基, 于30°C或37°C培養(yǎng)后,挑取單菌落, 于LB或BHI液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)至所需濃度。

新鮮培養(yǎng)的各細(xì)菌菌株, 菌落計(jì)數(shù)后調(diào)整濃度至1.0×108cfu/mL, 作為起始濃度。分別取所需濃度的各實(shí)驗(yàn)菌株新培養(yǎng)液1mL, 按照基因組DNA提取試劑盒(離心柱型) D3350-01 (Omega Bio-Tek, USA)提取基因組DNA, 溶解于50 μL的無(wú)菌ddH2O用于PCR和LAMP實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 選擇已在 NCBI公布的河流弧菌的外膜蛋白o(hù)mpU (登錄號(hào): KC182592)基因, 序列比對(duì)分析后, 在保守的基因區(qū)段設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物(外引物 VflompU-F3和 VflompU-B3, 內(nèi)引物VflompU-FIP和 VflompU-BIP, 環(huán)引物 VflompU-LF和VflompU-LB)用于LAMP反應(yīng); 同時(shí), 設(shè)計(jì)1條探針VflompU-HP, 可與LAMP產(chǎn)物特異性雜交, 并用于LFD檢測(cè), 見(jiàn)表1和圖1。其中探針VflompU-HP的 5′端進(jìn)行異硫氰酸熒光素標(biāo)記, 內(nèi)引物 VflompUFIP的5′端進(jìn)行生物素標(biāo)記。以上探針和引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。另外, 將外引物VflompU-B3和VflompU-F3也作為PCR擴(kuò)增的特異性引物, 擴(kuò)增預(yù)期片段大小約為278bp。

1.2.3 LAMP的反應(yīng)條件確立 以各供試細(xì)菌的基因組DNA為模板, 參考文獻(xiàn)的方法建立LAMP反應(yīng)體系(Ding et al, 2010), 具體組成如下(25μL): 外引物VflompU-F3和VflompU-B3各0.2μmol/L, 內(nèi)引物VflompU-FIP和 VflompU-BIP各 1.6μmol/L, 環(huán)引物VflompU-LB 和 VflompU-LF各 0.4μmol/L, dNTPs 1.4mmol/L, Tris-HCl (pH 8.8) 20mmol/L, KCl 10mmol/L, MgSO46.5mmol/L, (NH4)2SO410mmol/L,Triton X-100 0.1%, 8U Bst DNA聚合酶大片段(New England Biolabs)和2μL樣品模版。Bst DNA聚合酶能夠在一定的溫度范圍(60—65°C)保持其最佳活性, 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已有的研究結(jié)果結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道, 得出 63°C和65°C在研究中最常使用。本研究將LAMP反應(yīng)的溫度設(shè)定為 63°C, 在此基礎(chǔ)上篩得了 LAMP引物。在上述LAMP體系中添加EvaGreen、SYTO 9等熒光染料后, 通過(guò)類(lèi)似于熒光定量 PCR反應(yīng)的方式進(jìn)行LAMP結(jié)果的判斷(定義為實(shí)時(shí)熒光LAMP反應(yīng)), 即反應(yīng)的實(shí)時(shí)曲線特征, 熒光強(qiáng)度等能夠直觀的顯示LAMP反應(yīng)的情況。研究證實(shí), LAMP反應(yīng)陽(yáng)性擴(kuò)增的起始時(shí)間與模板的添加量具有明顯的相關(guān)性(Zhouet al, 2014)。為確定本研究的LAMP反應(yīng)時(shí)間, 我們首先將起始濃度1.0×108CFU/mL以10倍濃度梯度進(jìn)行稀釋, 將所獲各不同濃度的菌液按步驟 1.2.1的方法提取基因組 DNA, 以此為模板, 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光LAMP反應(yīng), 反應(yīng)時(shí)間為60min。根據(jù)LAMP反應(yīng)陽(yáng)性擴(kuò)增的起始時(shí)間結(jié)合熒光曲線到達(dá)平臺(tái)期的時(shí)間,初步分析模板濃度對(duì)于 LMAP反應(yīng)的影響。在此基礎(chǔ)上, 選擇較低濃度的細(xì)菌基因組 DNA為模板, 將接近于該濃度下獲得的陽(yáng)性擴(kuò)增起始時(shí)間作為最短反應(yīng)時(shí)間, 以5min作為時(shí)間間隔逐步延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間,進(jìn)行多次 LAMP反應(yīng), 確定 LAMP反應(yīng)的最佳反應(yīng)時(shí)間。反應(yīng)產(chǎn)物分別經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳、LFD,以及在反應(yīng)產(chǎn)物中添加SYBR Green I熒光染料等方法進(jìn)行結(jié)果判斷。

表1 根據(jù)河流弧菌ompU基因序列設(shè)計(jì)的LAMP-LFD擴(kuò)增引物的序列和DNA探針Tab.1 The primers and DNA probes targeting ompU gene of V. fluvialis used in LAMP-LFD assay

圖1 河流弧菌外膜蛋白o(hù)mpU基因的LAMP-LFD引物序列及DNA探針設(shè)計(jì)Fig.1 The primers and DNA probes targeting ompU gene of V.fluvialis used in LAMP-LFD assay

1.2.4 利用橫向流動(dòng)試紙條LFD檢測(cè) 使用生物素標(biāo)記的內(nèi)引物VflompU-FIP進(jìn)行LAMP反應(yīng), 反應(yīng)結(jié)束后不經(jīng)過(guò)高溫終止反應(yīng), 而是直接向反應(yīng)體系中加入20pmol FITC標(biāo)記的探針VflompU-HP, 63°C雜交 5min; 取雜交液 5μL加入到 100μL LFD buffer(Milenia Biotec GmbH公司, 德國(guó))中混勻; 將LFD試紙條(Milenia Biotec GmbH公司, 德國(guó))的檢測(cè)端豎直浸入雜交液中, 靜置3—5min, 以肉眼判別結(jié)果。

1.2.5 河流弧菌的LAMP-LFD特異性實(shí)驗(yàn) 為評(píng)價(jià)河流弧菌 LAMP-LFD方法的特異性, 選取與之相近的弧菌屬的多個(gè)致病菌, 即哈維氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌、鰻弧菌以及溶藻弧菌, 同時(shí)選擇海豚鏈球菌、遲緩愛(ài)德華菌、銅綠假單胞菌, 單增李斯特菌以及嗜水氣單胞菌等四種水產(chǎn)養(yǎng)殖或水產(chǎn)品中的常見(jiàn)病原菌。將各菌株的新培養(yǎng)物調(diào)整濃度至 1×105CFU/mL, 按1.2.1所述, 提取基因組 DNA, 并以此為模板, 利用優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行有生物素標(biāo)記的 LAMP反應(yīng),待產(chǎn)物與探針雜交后, 經(jīng) LFD 進(jìn)行結(jié)果判讀; 同時(shí)LAMP產(chǎn)物也通過(guò) 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳以及添加SYBR Green I的方法進(jìn)行判讀。

1.2.6 河流弧菌LAMP-LFD的靈敏度實(shí)驗(yàn) 取培養(yǎng)的新鮮河流弧菌菌液, 調(diào)整至起始濃度 1.0×108CFU/mL, 進(jìn)行 10倍濃度梯度稀釋, 按照步驟 1.2.1提取基因組DNA, 各濃度制備三個(gè)平行樣品。利用優(yōu)化反應(yīng)條件, 進(jìn)行有生物素標(biāo)記的LAMP反應(yīng), 產(chǎn)物與探針雜交后, 經(jīng) LFD進(jìn)行結(jié)果判讀; 同時(shí) LAMP產(chǎn)物也通過(guò) 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳以及添加 SYBR Green I的方法進(jìn)行判讀。

同時(shí), 我們選擇由 VflompU-F3VflompU-B3為引物的 PCR方法作為方法學(xué)上的比較。選擇上述各稀釋度的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng), 反應(yīng)體系(25μL)包括: 10×PCR buffer 2.5μL, rTaq DNA 聚合酶 (5U/μL) (TaKaRa, 大 連 ) 0.15μL, dNTPs(2.5mmol/μL) 2μL, VflompU-F3 (10pmol/μL) 1μL,VflompU-B3 (10pmol/μL) 1μL, 基因組 DNA 模板2μL。PCR 的反應(yīng)程序?yàn)? 94°C 預(yù)變性 1 min; 94°C 變性30s, 54°C退火30s, 72°C延伸30s, 30個(gè)循環(huán); 最后在72°C延伸10min。對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7 LAMP-LFD重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取1mL培養(yǎng)的新鮮河流弧菌菌液, 計(jì)數(shù), 調(diào)整濃度至1.0×108CFU/mL,以此為起始濃度, 進(jìn)行 10倍濃度梯度稀釋, 按照步驟1.2.1提取基因組DNA, 每個(gè)濃度制備三個(gè)平行樣品。以此 DNA為模板, 利用優(yōu)化反應(yīng)條件, 進(jìn)行有生物素標(biāo)記的 LAMP反應(yīng), 產(chǎn)物與探針雜交后, 經(jīng)LFD進(jìn)行結(jié)果判讀, 驗(yàn)證方法的可重復(fù)性; 同時(shí),LAMP產(chǎn)物也利用 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳和 SYBR Green I染料判讀結(jié)果, 并與LFD結(jié)果進(jìn)行比較分析。

1.2.8 河流弧菌人工污染大黃魚(yú)組織實(shí)驗(yàn) 取若干份健康大黃魚(yú)的肝臟組織100mg加入少量無(wú)菌水,充分勻漿后, 定容至 1mL。取 1mL新鮮培養(yǎng)的河流弧菌菌液(約 1.0×108CFU/mL)進(jìn)行 10倍濃度梯度稀釋, 分別取濃度為 1.0×101, 1.0×102, 1.0×103, 1.0×104,1.0×105CFU/mL的菌液各1mL, 與大黃魚(yú)肝組織勻漿液等體積混勻。每個(gè)濃度平行制備三個(gè)樣品。取1mL被細(xì)菌污染的肌肉組織樣品, 采用動(dòng)物組織基因組DNA 提取試劑盒(TaKaRa, 大連)提取該樣品基因組DNA, 溶解于50μL的ddH2O中, 用作PCR和LAMP測(cè)試的模板。以健康大黃魚(yú)的肝臟組織勻漿液作為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 LAMP擴(kuò)增條件的確定

將起始濃度1.0×108CFU/mL進(jìn)行倍比稀釋后, 選擇 1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102和1.0×101CFU/mL 7個(gè)濃度梯度的基因組DNA為模板, 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光 LAMP反應(yīng)。結(jié)果表明, 當(dāng)以1.0×107, 1.0×106, 1.0×105, 1.0×104, 1.0×103和 1.0×102CFU/mL的基因組DNA為模板時(shí), 熒光曲線呈典型的“S”型, 擴(kuò)增為陽(yáng)性; 而當(dāng)模板濃度降低至 1.0×101CFU/mL時(shí), 擴(kuò)增結(jié)果呈陰性(圖2a)。當(dāng)陽(yáng)性擴(kuò)增模板濃度由1.0×107逐步降低至1.0×102CFU/mL時(shí), 起峰時(shí)間逐漸增加, 呈線性相關(guān)(圖2b)。然后, 選擇可引起陽(yáng)性擴(kuò)增的較低模板濃度1.0×102CFU/mL為模板, 設(shè)定多個(gè)反應(yīng)時(shí)間, 進(jìn)行有生物素標(biāo)記的LAMP反應(yīng)。反應(yīng)時(shí)間以20min (20min略低于該濃度下的陽(yáng)性擴(kuò)增起峰時(shí)間)起, 時(shí)間間隔為5min, 判斷低濃度下LAMP反應(yīng)的最佳有效時(shí)間。各 LAMP產(chǎn)物與探針VflompU-HP雜交后, 經(jīng)LFD試紙條顯色; 同時(shí), 利用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳和產(chǎn)物中添加 SYBR Green I的方法進(jìn)行檢測(cè), 比較分析。結(jié)果表明, 當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為20min時(shí), LFD的檢測(cè)線位置未見(jiàn)有條帶, 結(jié)果為陰性; 當(dāng)反應(yīng)時(shí)間增至25min時(shí), LFD檢測(cè)線位置可見(jiàn)明顯的條帶, 結(jié)果為陰性; 當(dāng)繼續(xù)增加反應(yīng)時(shí)間至 30、35和40min時(shí), 利用LFD均可穩(wěn)定地檢測(cè)為陽(yáng)性(圖2d)。利用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)表明, 當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為 25min時(shí), 開(kāi)始明顯檢測(cè)到典型的梯形條帶, 反應(yīng)時(shí)間為 30min時(shí), 梯形條帶達(dá)到最為明亮, 產(chǎn)物量達(dá)到最大, 反應(yīng)時(shí)間繼續(xù)增加至 40min時(shí), 產(chǎn)物量未見(jiàn)明顯增加(圖2c); 向產(chǎn)物中添加SYBR Green I后觀察發(fā)現(xiàn), 當(dāng)反應(yīng)時(shí)間從 25min逐漸增至 40min時(shí), 均可明顯觀察到LAMP產(chǎn)物呈現(xiàn)綠色變化, 反應(yīng)時(shí)間為20min時(shí), LAMP產(chǎn)物呈現(xiàn)SYBR Green I稀釋后的橙色, 結(jié)果呈陰性(圖2e)。綜上, 盡管通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳的方法, 直到反應(yīng)時(shí)間達(dá)到 30min時(shí)才達(dá)到帶型最亮, 但是利用LFD和添加SYBR Green I的方法, 在反應(yīng)時(shí)間達(dá)到25min時(shí)即可穩(wěn)定可靠的判定結(jié)果, 因此,應(yīng)用于LFD檢測(cè)的LAMP的最佳反應(yīng)時(shí)間為25min。

2.2 河流弧菌LAMP-LFD的特異性分析

圖2 LAMP反應(yīng)最適反應(yīng)時(shí)間的確定Fig.2 Time optimization of LAMP assay for detection of V. fluvialis

選擇與河流弧菌相似的創(chuàng)傷弧菌、哈維氏弧菌、鰻弧菌和溶藻弧菌等弧菌屬的病原菌, 以及海豚鏈球菌、遲緩愛(ài)德華菌、銅綠假單胞菌、單增李斯特菌、嗜水氣單胞菌等常見(jiàn)的水產(chǎn)病原菌的基因組DNA為模板, 63°C條件下進(jìn)行有生物素標(biāo)記的LAMP反應(yīng),反應(yīng)時(shí)間為25min, 產(chǎn)物與探針雜交后, 用于LFD檢測(cè), 分析 LAMP-LFD方法的特異性。結(jié)果表明以1×105CFU/mL河流弧菌基因組 DNA為模板時(shí),LAMP產(chǎn)物與探針雜交后, 經(jīng)LFD檢測(cè), 檢測(cè)線上有明顯條帶, 結(jié)果呈陽(yáng)性, 瓊脂糖凝膠電泳以及添加SYBR Green I的方法也是顯示陽(yáng)性結(jié)果。當(dāng)以上述 5種弧菌和其他4種水產(chǎn)病原菌的基因組DNA為模板時(shí), LFD的檢測(cè)線位置未見(jiàn)有明顯的條帶, 結(jié)果呈陰性; 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和添加 SYBR Green I檢測(cè),結(jié)果也是陰性。以上說(shuō)明本研究公布的河流弧菌LAMP-LFD方法具有良好的特異性。

2.3 河流弧菌LAMP-LFD的靈敏度驗(yàn)證

根據(jù) LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化時(shí)獲得的實(shí)時(shí)熒光LAMP數(shù)據(jù), 以起始濃度1.0×108CFU/mL作為最高濃度, 1.0×101CFU/mL作為最低濃度, 在上述優(yōu)化反應(yīng)條件下, 進(jìn)行有生物素標(biāo)記的LAMP反應(yīng)。結(jié)果顯示, 當(dāng)模板濃度從 1.0×108CFU/mL逐漸降低至1.0×102CFU/mL時(shí), 利用LFD方法均可穩(wěn)定檢測(cè)到陽(yáng)性結(jié)果; 當(dāng)使用 1.0×101CFU/mL的菌液作為模板時(shí), 檢測(cè)結(jié)果呈陰性。這表明經(jīng)LFD檢測(cè)的最低模板濃度為1.0×102CFU/mL或4 CFU/反應(yīng)(圖4b)。同時(shí),LAMP產(chǎn)物經(jīng) 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳和添加 SYBR Green I的方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn), 能夠檢測(cè)到的最低模板濃度同樣是 1.0×102CFU/mL (圖 4a, 4d)。而以VflompU-F3VflompU-B3為引物的PCR方法可以檢測(cè)到1.0×103CFU/mL或者40CFU/反應(yīng)的最低模板濃度(圖 4c)。

圖3 LAMP (a, c)和LAMP-LFD (b)的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Specificity test of LAMP (a, c) and LAMP-LFD (b) for detection of V. fluvialis

2.4 河流弧菌 LAMP-LFD重復(fù)性分析

為分析河流弧菌 LAMP-LFD方法的重復(fù)性, 同時(shí)評(píng)價(jià)依托于恒溫水浴鍋等普通儀器的 LAMP-LFD的穩(wěn)定性, 重新取河流弧菌的新鮮培養(yǎng)液, 進(jìn)行倍比稀釋后, 將濃度調(diào)至1.0×102CFU/mL后, 提取基因組DNA, 進(jìn)行有生物素標(biāo)記的 LAMP反應(yīng), 反應(yīng)條件為 63°C 溫育 25min。結(jié)果表明, 以最低檢測(cè)濃度1.0×102CFU/mL的河流弧菌基因組DNA為模板獲得的LAMP產(chǎn)物, 經(jīng)LFD試紙條、瓊脂糖凝膠電泳, 以及添加SYBR Green I的方法均能穩(wěn)定獲得陽(yáng)性結(jié)果;以蒸餾水為模板時(shí), 檢測(cè)結(jié)果呈陰性, 說(shuō)明依托于簡(jiǎn)單儀器的LAMP-LFD具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2.5 采用 LAMP-LFD方法檢測(cè)哈維氏弧菌污染大黃魚(yú)組織的靈敏度和適用性分析

將不同濃度河流弧菌對(duì)大黃魚(yú)的組織進(jìn)行等體積污染后, 提取混合勻漿液的基因組 DNA, 經(jīng)LAMP-LFD和 PCR分別檢測(cè), 結(jié)果顯示當(dāng)污染組織的菌液濃度達(dá)到 1.0×103CFU/mL時(shí), 利用 LAMPLFD即可從污染的肝臟組織中穩(wěn)定檢測(cè)到病原, 靈敏度為5×102CFU/mL或20 CFU/反應(yīng)(表2); 當(dāng)污染組織的菌液濃度達(dá)到1.0×104CFU/mL時(shí), 利用PCR方法即可從污染的肝臟組織中穩(wěn)定地檢測(cè)出病原,達(dá)到 5×103CFU/mL或 200CFU/反應(yīng)的靈敏度, 結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

圖4 檢測(cè)河流弧菌的不同方法靈敏度比較Fig.4 Comparison in detection limit to V. fluvialis by different motheds

表2 利用河流弧菌人工污染大黃魚(yú)組織樣品后本研究的LAMP-LFD檢測(cè)和PCR檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Detection of V. fluvialis from artificial-contaminated tissue samples of Pseudosciaena crocea by both LAMP-LFD and PCR assays

圖5 LAMP (a, c)和LAMP-LFD (b)的重復(fù)性試驗(yàn)Fig.5 Reproducibility of LAMP-LFD (a, c) and LAMP (b) of detection for V. fluvialis

河流弧菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中的一種重要病原菌, 隨著海鮮產(chǎn)品在飲食結(jié)構(gòu)比重中的逐漸增加, 由河流弧菌引發(fā)的人體疾病也越來(lái)越受到重視(Chowdhuryet al, 2012; Ramamurthyet al, 2014)。在我國(guó), 河流弧菌已在牙鲆、石斑魚(yú)、大黃魚(yú)等主要養(yǎng)殖動(dòng)物中檢出(鄢慶枇等, 2006; 王曉露等, 2008; 朱蘇琴等, 2012),成為嚴(yán)重威脅人體健康的潛在因素之一(周妍妍等,2016)。因此, 如何實(shí)現(xiàn)該病原的快速診斷和準(zhǔn)確鑒定,切斷該病原在養(yǎng)殖、流通, 以及餐桌等環(huán)節(jié)的傳播,對(duì)于維護(hù)公共衛(wèi)生健康具有重要意義?；诖? 本研究選擇河流弧菌的外膜蛋白o(hù)mpU基因作為檢測(cè)靶標(biāo),建立了便捷易操作的 LAMP-LFD技術(shù), 特異性地應(yīng)用于組織樣品中河流弧菌的檢測(cè)。

自 LAMP技術(shù)問(wèn)世以來(lái), 憑借其檢測(cè)的高靈敏度、高便捷性、低設(shè)備依賴(lài)性等優(yōu)點(diǎn), 在微生物檢測(cè)領(lǐng)域取得了巨大應(yīng)用。本研究公布的LAMP-LFD技術(shù), 保留了LAMP方法自有特點(diǎn)的基礎(chǔ)上, 在檢測(cè)便捷性、設(shè)備低依賴(lài)性等方面有了進(jìn)一步提高。LAMP技術(shù)涉及的關(guān)鍵因素Bst DNA聚合酶可在單一溫度下實(shí)現(xiàn)核酸的幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng), 極大地降低了反應(yīng)過(guò)程儀器設(shè)備的復(fù)雜度, 使得諸如恒溫金屬浴等簡(jiǎn)單設(shè)備都可成為反應(yīng)容器, 大幅度降低儀器成本的同時(shí), 也增加了操作的便捷性。而在LAMP產(chǎn)物的檢測(cè)方面, 通常借助于凝膠成像系統(tǒng)、濁度儀, 以及熒光定量PCR儀等完成, 在儀器成本、操作便捷性方面有諸多限制; 通過(guò)添加SYBR Green I等核酸染料的方式雖然便捷, 但假陽(yáng)性較高(Borstet al, 2004)。本研究將LFD試紙條引入到LAMP產(chǎn)物的檢測(cè)過(guò)程, 產(chǎn)物經(jīng)約5min的探針雜交和3—5min的LFD顯色, 即可判讀結(jié)果, 此過(guò)程中僅需一把移液器即可完成操作, 摒棄了對(duì)于昂貴儀器的依賴(lài), 整個(gè)產(chǎn)物檢測(cè)在10min內(nèi)即可完成, 大幅度提高了檢測(cè)的便捷性和流動(dòng)性, 尤其適用于基層或現(xiàn)場(chǎng)疫源地的快速檢測(cè)。針對(duì)河流弧菌分子生物學(xué)檢測(cè)的方法多數(shù)基于 PCR的的反應(yīng)原理, 從核酸擴(kuò)增到利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行判讀, 根據(jù)檢測(cè)靶標(biāo)的片段大小, 檢測(cè)時(shí)程約在3h左右, 甚至更長(zhǎng)(Chakrabortyet al, 2006;文萬(wàn)僥等, 2009; Vinothkumaret al, 2013); 鄢慶枇等(2006)建立的熒光抗體技術(shù)檢測(cè)牙鲆體內(nèi)河流弧菌的感染時(shí), 整個(gè)耗時(shí)也需 3h左右; 而本研究提供的LAMP-LFD技術(shù), LAMP反應(yīng) 25min, 所得產(chǎn)物經(jīng)10min左右的 LFD顯色過(guò)程, 整個(gè)檢測(cè)時(shí)程約需35min, 耗時(shí)更短。

靈敏度是衡量核酸檢測(cè)類(lèi)方法的重要技術(shù)指標(biāo)。文萬(wàn)僥等(2009)將河流弧菌的 toxR基因作為檢測(cè)靶標(biāo), 建立了可特異性檢測(cè)河流弧菌的PCR方法, 可從低至 9.3×103CFU/mL的菌液樣品中檢測(cè)到病原;Vinothkumar等(2013)針對(duì)河流弧菌、霍亂弧菌和副溶血弧菌等3種弧菌屬致病菌建立了多重PCR技術(shù),針對(duì)單一菌種的靈敏度為10個(gè)CFU; 鄢慶枇等(2006)公布的熒光抗體技術(shù)能夠從注射河流弧菌(107CFU)24h后的牙鲆臟器中檢測(cè)到該病原。本研究使用的河流弧菌LAMP-LFD技術(shù)能夠從1.0×102CFU/mL的細(xì)菌菌液或5×102CFU/mL感染強(qiáng)度的組織樣品中穩(wěn)定檢測(cè)到病原, 體現(xiàn)出良好的方法靈敏度。

4 結(jié)論

作者在本文中以河流弧菌外膜蛋白的 ompU基因?yàn)闄z測(cè)靶標(biāo)建立了 LAMP-LFD方法, 可特異性地應(yīng)用于河流弧菌的檢測(cè), 并對(duì)創(chuàng)傷弧菌等常見(jiàn)的水產(chǎn)病原菌沒(méi)有交叉反應(yīng)。該方法檢測(cè)用時(shí)較短, 核酸擴(kuò)增僅需25min, 加之探針雜交和LFD顯色, 整個(gè)時(shí)程僅需 35min。該方法仍具有較高的檢測(cè)靈敏度, 可達(dá) 1.0×102CFU/mL或者 4CFU/反應(yīng)。同時(shí), 該方法從核酸擴(kuò)增到結(jié)果展示的整個(gè)檢測(cè)過(guò)程對(duì)儀器要求極其簡(jiǎn)單, 在河流弧菌的基層檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)快檢等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用潛力。

王曉露, 鄒文政, 鄢慶枇等, 2008. 病原性河流弧菌對(duì)青石斑魚(yú)體表黏液黏附特性的研究. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 32(3): 441—447

王瑞娜, 周前進(jìn), 陳 炯, 2014. 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增聯(lián)合橫向流動(dòng)試紙條可視化檢測(cè)海豚鏈球菌方法的建立. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 22(12): 1584—1594

文萬(wàn)僥, 謝珍玉, 徐先棟等, 2009. 基于toxR基因的河流弧菌PCR快速檢測(cè)方法的建立. 水產(chǎn)科學(xué), 28(10): 575—578

朱蘇琴, 紀(jì)榮興, 蘇永全等, 2012. 河流弧菌(Vibrio fluvialis)對(duì)大黃魚(yú)(Pseudosciaena crocea)鰓黏液黏附特性研究. 海洋與湖沼, 43(2): 389—393

周妍妍, 閆東輝, 蘇建榮, 2016. 臨床分離河流弧菌毒力及藥敏表型特征分析. 臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 15(5): 492—495

曹際娟, 趙 昕, 孫哲平等, 2008. PCR結(jié)合變性高效液相色譜快速檢測(cè)水產(chǎn)品中河流弧菌. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,18(11): 2187—2189

鄢慶枇, 鄒文政, 紀(jì)榮興等, 2006. 應(yīng)用熒光抗體技術(shù)檢測(cè)牙鲆體內(nèi)的河流弧菌. 海洋科學(xué), 30(4): 16—19

Baffone W, Citterio B, Vittoria E et al, 2001. Determination of several potential virulence factors in Vibrio spp. isolated from sea water. Food Microbiology, 18(5): 479—488

Bellet J, Klein B, Altieri M et al, 1989. Vibrio fluvialis, an unusual pediatric enteric pathogen. Pediatric Emergency Care, 5(1): 27—28

Borst A, Box A T A, Fluit A C, 2004. False-positive results and contamination in nucleic acid amplification assays:suggestions for a prevent and destroy strategy. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases,23(4): 289—299

Chakraborty R, Sinha S, Mukhopadhyay A K et al, 2006.Species-specific identification of Vibrio fluvialis by PCR targeted to the conserved transcriptional activation and variable membrane tether regions of the toxR gene. Journal of Medical Microbiology, 55(6): 805—808

Chowdhury G, Pazhani G P, Dutta D et al, 2012. Vibrio fluvialis in patients with diarrhea, Kolkata, India. Emerging Infectious Diseases, 18(11): 1868—1871

Ding W C, Chen J, Shi Y H et al, 2010. Rapid and sensitive detection of infectious spleen and kidney necrosis virus by loop-mediated isothermal amplification combined with a lateral flow dipstick. Archives of Virology, 155(3):385—389

Mori Y, Kanda H, Notomi T, 2013. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): recent progress in research and development. Journal of Infection and Chemotherapy, 19(3):404—411

Niemz A, Ferguson T M, Boyle D S, 2011. Point-of-care nucleic acid testing for infectious diseases. Trends in Biotechnology,29(5): 240—250

Puthawibool T, Senapin S, Kiatpathomchai W et al, 2009.Detection of shrimp infectious myonecrosis virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification combined with a lateral flow dipstick. Journal of Virological Methods, 156(1—2): 27—31

Ramamurthy T, Chowdhury G, Pazhani G P et al, 2014. Vibrio fluvialis: an emerging human pathogen. Frontiers in Microbiology, 5: 91

Vinothkumar K, Bhardwaj A K, Ramamurthy T et al, 2013.Triplex PCR assay for the rapid identification of 3 major Vibrio species, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus,and Vibrio fluvialis. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 76(4): 526—528

Zhou Q J, Wang L, Chen J et al, 2014. Development and evaluation of a real-time fluorogenic loop-mediated isothermal amplification assay integrated on a microfluidic disc chip (on-chip LAMP) for rapid and simultaneous detection of ten pathogenic bacteria in aquatic animals.Journal of Microbiological Methods, 104: 26—35