徐革鋒 牟振波 陳懷發(fā) 黃天晴 王炳謙 谷 偉戶 國(guó) 韓 英①

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所 哈爾濱 150070; 2. 西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)研究所 拉薩 850032;3. 黑龍江省水生動(dòng)物資源增殖保護(hù)站 哈爾濱 150018; 4. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院水產(chǎn)系 哈爾濱 150030)

雌雄異體魚(yú)類的性別決定是由基因(遺傳)、環(huán)境或是兩者共同作用驅(qū)動(dòng)(Devlin et al, 2002; Volff et al,2007; Penman et al, 2008)。在絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物中,雄性都是通過(guò)Y染色體遺傳的。Sry是第一個(gè)在哺乳動(dòng)物 Y染色體上發(fā)現(xiàn)的基因, 已被證明是精巢分化與發(fā)育的必要條件(Koopman et al, 1990; Sinclair et al,1990), 在該基因被確定為主要性別決定基因的同時(shí),也發(fā)現(xiàn)其他基因參與了性別分化的級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)(Brennan et al, 2004), 但Sry基因在其他物種的性別決定機(jī)制中尚未被發(fā)現(xiàn)(Capel, 2000; Graves, 2002),這表明性別決定機(jī)制在不同種類脊椎動(dòng)物間不具有明顯的進(jìn)化保守性。與性別決定相反, 決定魚(yú)類性別分化的相關(guān)基因和基因網(wǎng)絡(luò)顯示出高度的保守性,即使是不同種類(Munger et al, 2009; Herpin et al,2011; Piferrer, 2011)。與其他脊椎動(dòng)物一樣, 魚(yú)類性腺有兩大功能, 即配子發(fā)生和類固醇激素合成, 性腺主要的合成產(chǎn)物是性甾體, 雄性激素包括睪酮(T)、11B-羥雄烯二酮和 11-酮基睪酮, 雌性激素主要是雌二醇(E2)。雄性激素和雌性激素分別與雄性和雌性的性腺分化有關(guān)。但雌激素主要是性分化和保持雌性特征的必要條件, 而雄激素目前認(rèn)為是雄性分化的結(jié)果(Piferrer et al, 2012)。值得注意的是, 很多基因在兩性性腺分化中都存在, 只是表達(dá)程度不同。另外, 統(tǒng)計(jì)近些年的研究成果可知, 魚(yú)類性腺分化期大部分調(diào)控因子主要可以歸為以下幾類: 類固醇生成酶、性類固醇激素受體、轉(zhuǎn)錄因子和生長(zhǎng)因子, 但隨著研究的深入還發(fā)現(xiàn)其他因子存在(Penman et al, 2008)。這些基因中, 類固醇性腺芳香化酶(Cyp19a1a)和轉(zhuǎn)錄因子Foxl2占據(jù)顯著地位。芳香化酶可催化雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素, 該生理過(guò)程不可逆, 由此確保兩種激素的平衡。目前研究認(rèn)為, 大部分非哺乳脊椎動(dòng)物的雌性分化依賴 Cyp19a1a定向誘導(dǎo), 該反應(yīng)通過(guò)一個(gè)正反饋回路實(shí)現(xiàn), 主要調(diào)控基因?yàn)檗D(zhuǎn)錄因子 Foxl2; 而在雄性分化中 Cyp19a1a的表達(dá)會(huì)被抑制(Guiguen et al,2010)。Wang 等(2010)的研究認(rèn)為, 抑制 Cyp19a1a是通過(guò)增加Dmrt1實(shí)現(xiàn)的; 而轉(zhuǎn)錄因子在魚(yú)類種群間相對(duì)保守, 是 Cyp19a1a的調(diào)節(jié)器。大多遺傳型性別決定種類脊椎動(dòng)物具有單一性別決定機(jī)制, 而Dmrt1的增量調(diào)節(jié)主要通過(guò)以下這個(gè)途徑實(shí)現(xiàn): 包括一個(gè)雄性主要決定基因或一個(gè)聯(lián)合基因 Sox9, 或者在多因子機(jī)制中通過(guò)幾種雄性促進(jìn)基因的疊加效應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)(Piferrer et al, 2012)。

雄性虹鱒的三倍體(Lincoln et al, 1984; 韓英等,2010a)與二倍體性腺有相同的功能和形態(tài), 然而, 雌性三倍體虹鱒是一個(gè)例外, 盡管它們能夠存活, 但它們卵巢滯育。與二倍體卵巢相比, 三倍體虹鱒卵巢呈線狀, 并且缺少相應(yīng)數(shù)量的初級(jí)卵母細(xì)胞(Lincoln et al, 1984; Krisfalusi et al, 1996)。這說(shuō)明三倍體虹鱒卵巢與精巢的發(fā)育存在著本質(zhì)區(qū)別。早期研究認(rèn)為, 由于第三套染色體在配子形成過(guò)程中擾亂了初始減數(shù)分裂, 阻滯了卵原細(xì)胞的發(fā)育, 因此導(dǎo)致了三倍體虹鱒卵巢發(fā)育停滯(Krisfalusi et al, 1999)。韓英等(2010b)的研究還發(fā)現(xiàn), 在 17月齡左右時(shí)三倍體雌性虹鱒呈現(xiàn)類雄性化發(fā)育趨勢(shì)(卵巢出現(xiàn)了去分化、再分化的異?，F(xiàn)象), 但該特殊現(xiàn)象與普遍認(rèn)為的魚(yú)類在性腺分化后, 其生殖細(xì)胞已失去了性別可塑性的觀點(diǎn)相悖。因此, 認(rèn)為是三倍體虹鱒的卵原細(xì)胞胞囊化擾亂了雌性生殖細(xì)胞與其體細(xì)胞之間的互作, 導(dǎo)致濾泡細(xì)胞發(fā)育及其性類固醇激素合成通路受阻, 進(jìn)而中斷了睪酮轉(zhuǎn)變?yōu)榇贫嫉姆枷慊緩? 最終由于雌激素的缺失開(kāi)啟了卵巢轉(zhuǎn)向雄性化的調(diào)控通路。然而, 對(duì)于三倍體虹鱒卵巢滯育的這種生理學(xué)解釋仍無(wú)法令人滿意, 尤其在三倍體虹鱒卵巢分化及滯育過(guò)程中, 雌性化通路的性腺特異基因與性類固醇激素間的聯(lián)合調(diào)控機(jī)制, 以及相關(guān)基因的級(jí)聯(lián)調(diào)控模式是怎么樣的, 到目前為止仍不得而知。目前, 一些與性別決定和分化相關(guān)的基因已經(jīng)在虹鱒中被鑒定出來(lái), 包括 Cyp19a1a、Foxl2、Dmrt1、Amh和Sox9等(Marchand et al, 2000; Vizziano et al, 2007, 2008a,b; Orrego et al, 2010)。盡管Xu等(2016)初步報(bào)道了不同發(fā)育階段三倍體雌性虹鱒的上述基因的級(jí)聯(lián)調(diào)控關(guān)系, 但對(duì)于其卵巢分化及早期滯育的調(diào)控機(jī)制尚未進(jìn)行報(bào)道。我們檢測(cè)了卵巢分化及其滯育早期三倍體雌性虹鱒的 Cyp19a1a、Foxl2、Dmrt1、Amh和Aox9的相對(duì)表達(dá)量, 并分析了各基因間的級(jí)聯(lián)調(diào)控模式以及在雌性化通路中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和采樣

遺傳上全雌性三倍體(XXX)虹鱒和正常雌性二倍體(XX)虹鱒從黑龍江水產(chǎn)研究所獲得。30dpf(Days post fertilization)發(fā)眼卵放置在 10℃水溫中,溶解氧為8mg/L, 然后轉(zhuǎn)入到實(shí)驗(yàn)設(shè)備中即0.3m3的水族箱內(nèi), 具有再循環(huán)給水系統(tǒng), 水溫 10±0.2℃,恒定光周期(12L︰12D)。在65—68dpf時(shí)期, 仔魚(yú)開(kāi)始集中上浮, 開(kāi)口攝食后分組(每日飽和投喂商業(yè)餌料): 實(shí)驗(yàn)組全為雌性三倍體(XXX), 對(duì)照組為雌性二倍體(XX), 各試驗(yàn)組均設(shè)三個(gè)平行組。從上浮仔魚(yú)至4月齡, 每14d采集樣本一次, 用于確定性腺分化時(shí)間, 每次采集仔魚(yú)30尾, 放于液氮罐內(nèi)凍存后,–80℃超低溫冰箱保存, 用于 RNA提取和 real time RT-PCR分析; 幼魚(yú)期(5—10月齡)每次采集樣品 10尾, 分 5尾放于液氮罐內(nèi)凍存, 用于 RNA提取和real time RT-PCR分析, 5尾分別用Bouin’s固定(用于組織學(xué)切片觀察)和2.5%戊二醛固定(用于電鏡觀察),7—10月齡采集血液。

1.2 RNA提取與轉(zhuǎn)錄

用TRIzol試劑提取RNA。RNA數(shù)量和質(zhì)量是通過(guò)紫外吸光度在260和280nm的Evolution 260 BIO分光光度計(jì)(Thermo, 美國(guó))測(cè)定。吸光度比值為260/280nm, 超出 1.7—2.1范圍的樣品將被排除。樣品RNA的完整性通過(guò)生物分析儀2100專家系統(tǒng)(安捷倫科技公司, 圣克拉拉, 美國(guó))驗(yàn)證, 所有的樣本RIN 值都在 8—10。根據(jù)制造商的說(shuō)明, 500ng, 總RNA 30μL反應(yīng)體系, 使用反向轉(zhuǎn)錄核心工具酶(98℃, 10s; 52℃, 30s; 72℃, 1min), 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA,用10倍的核酸酶自由水將cDNA稀釋。

1.3 實(shí)時(shí)PCR

根據(jù)二倍體虹鱒的Cyp19a1a、Foxl2、Dmrt1、sox9和Amh序列作為模板, 利用Primer 5.0軟件分別設(shè)計(jì)特異引物(表 1), 檢測(cè)二倍體虹鱒和雌性三倍體虹鱒性腺組織中基因的表達(dá)量情況, 并根據(jù)GenBank中二倍體虹鱒的 β-actin基因序列設(shè)計(jì)內(nèi)參引物(表1)。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(ddCt法)結(jié)果測(cè)定, 用 ABI 7500 Realtime PCR 儀(Applied Biosystems, USA)進(jìn)行相對(duì)定量分析。使用 SYBR?Premix Ex TaqTMII(TaKaRa, Japan)試劑盒, 依照說(shuō)明書(shū)反應(yīng)為 20μL體系, 包括: SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(2×), 10μL; PCR Forward Primer (10μmol/L), 0.4μL; PCR Reverse Primer (10μmol/L), 0.4μL; ROX Reference Dye Ⅱ(50×)×3, 0.4μL; cDNA 模板, 2.0μL; dH2O, 6.8μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 30s; 95℃ 5s, 60℃ 34s, 40個(gè)循環(huán); 95℃ 15s, 60℃ 1min, 95℃ 15s。每個(gè)引物的效率(Baronet al, 2005a, b, c), 由cDNA樣本(RNA反轉(zhuǎn)錄得到)連續(xù)稀釋測(cè)得, 重復(fù)3次。各基因轉(zhuǎn)錄水平通過(guò)β-actin(內(nèi)參)的表達(dá)量進(jìn)行評(píng)定。將熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果導(dǎo)出, 采用 2–ΔΔCt法計(jì)算得到基因定量表達(dá)結(jié)果(Bogerdet al, 2001)。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列Tab.1 The nucleotide sequences of the real-time PCR primers

1.4 性激素測(cè)定

尾椎靜脈采血, 制備血清, –80℃保存待測(cè)。根據(jù)解剖和切片結(jié)果, 對(duì)照標(biāo)記, 選取雌性血樣, 采用放射免疫法測(cè)定 Estradiol-17β (E2)和 Testosterone (T)含量, 放免試劑盒為北京華英生物技術(shù)研究所生產(chǎn)(125I-Na為英國(guó)Amersham公司生產(chǎn), 17β-E2和T抗原及抗體為美國(guó)SIGMA公司生產(chǎn))。

2 結(jié)果與分析

2.1 三倍體虹鱒卵巢分化

在 98dpf時(shí)期, 三倍體虹鱒已分化出卵巢結(jié)構(gòu)(圖1a), 其中具有明顯的卵原細(xì)胞(圖1b, 細(xì)胞核: 三角符號(hào))和鞘膜細(xì)胞(圖1a, 箭頭); 卵原細(xì)胞胞質(zhì)中具有大量圓形和帶形的線粒體, 偶見(jiàn)高爾基體(圖 1c),且細(xì)胞核較小, 具有2個(gè)核仁。在 84dpf時(shí)期, 二倍體虹鱒卵巢分化速度較快, 卵巢中具有大量典型的卵泡結(jié)構(gòu)(圖 1d), 卵原細(xì)胞大量增殖, 且具有多個(gè)核仁(圖 1e), 胞質(zhì)細(xì)胞器大量增殖, 高爾基體較為發(fā)達(dá)(箭頭), 線粒體多位長(zhǎng)帶狀(圖1f, 三角形)。但隨后的發(fā)育對(duì)三倍體虹鱒卵泡形成和卵細(xì)胞增殖均非常不利, 在 154dpf(4月齡), 雌性三倍體虹鱒性腺整體表現(xiàn)為Ⅰ期卵巢結(jié)構(gòu)(圖 1g), 卵泡結(jié)構(gòu)明顯(圖 1h, 箭頭), 但卵巢組織間存在大量空隙, 絕大部分區(qū)域?yàn)闊o(wú)法區(qū)分的體細(xì)胞組織。在4月齡時(shí)期, 二倍體虹鱒卵巢已進(jìn)入到卵母細(xì)胞發(fā)育時(shí)期(Ⅱ—Ⅲ時(shí)期卵巢),細(xì)胞核變小(圖 1i, 三角形), 核仁清晰(圖 1i, 箭頭),濾泡層內(nèi)層為扁平的濾泡細(xì)胞(圖 1j, 三角形), 外層為鞘膜細(xì)胞(圖1j, 箭頭)。

2.2 三倍體虹鱒滯育期卵巢

圖1 二倍體和三倍體虹鱒卵巢分化期結(jié)構(gòu)Fig.1 The gonadal morphology of diploid and triploid female rainbow trout in developmental period

在 5—7月齡時(shí)期, 三倍體雌性虹鱒卵巢組織發(fā)育停滯(圖 2a), 卵細(xì)胞始終停留在卵原細(xì)胞時(shí)期, 且核仁數(shù)量較少, 細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則, 卵巢組織間隙充滿了大量鞘膜細(xì)胞。8—9月齡時(shí)期, 三倍體虹鱒卵巢結(jié)構(gòu)開(kāi)始疏松化, 有大面積的空隙出現(xiàn)(圖 2b), 超微結(jié)構(gòu)顯示, 個(gè)別的空隙存有大量微絨毛, 而有些空隙間有膜狀物存在(圖2c)。10月齡時(shí)期, 三倍體虹鱒卵巢發(fā)生了退化, 卵巢結(jié)構(gòu)空泡化更加明顯, 間質(zhì)空隙較大(圖2d, 箭頭)、卵原細(xì)胞開(kāi)始重吸收(圖2e, 箭頭),胞質(zhì)內(nèi)線粒體大量瓦解, 鞘膜細(xì)胞不斷萎縮(圖 2e,三角形), 甚至消失, 卵巢組織進(jìn)入衰敗期, 結(jié)締組織發(fā)達(dá), 出現(xiàn)了大量不能區(qū)分性質(zhì)的生殖細(xì)胞群。該時(shí)期后期, 絕大部分空隙均被微絨毛所占據(jù)(圖 2f), 卵巢組織內(nèi)存在龐大的膜系統(tǒng)(圖 2g, 三角形), 具有大量深染致密顆粒(圖 2g, 箭頭), 類似于蛋白物質(zhì)在性腺外周聚集。在5—10月齡時(shí)期, 二倍體虹鱒卵巢具有典型的產(chǎn)卵小板結(jié)構(gòu), 每個(gè)產(chǎn)卵板上分布有數(shù)量不等的卵原細(xì)胞, 其數(shù)量在短時(shí)期內(nèi)大量增殖(圖2h),并不斷發(fā)育成初級(jí)卵母細(xì)胞和次級(jí)卵母細(xì)胞(Ⅲ實(shí)相卵母細(xì)胞)(圖2i)。該時(shí)期的最主要特征——卵母細(xì)胞發(fā)育及其濾泡細(xì)胞層的形成。

圖2 三倍體虹鱒滯育期卵巢形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig.2 The gonadal morphology of triploid female rainbow trout in development arrest period

2.3 三倍體(XXX)虹鱒卵巢 Cyp19a1a、Foxl2、Dmrt1、Amh和Sox9的表達(dá)分析

Foxl2和Cyp19a1a在二倍體虹鱒卵巢和精巢中均有表達(dá), 它們?cè)诼殉仓斜磉_(dá)量均呈逐漸升高趨勢(shì),但精巢中的表達(dá)量非常低(圖3a, 圖3b); 這兩個(gè)基因在雌性三倍體虹鱒性腺中的表達(dá)呈先升高后降低趨勢(shì), 其表達(dá)量均在 8月齡時(shí)期達(dá)到最大(圖 3a,圖 3b)。Dmrt1、Amh和Sox9在二倍體精巢和雌性三倍體性腺中的表達(dá)均呈不斷上調(diào)的趨勢(shì), 但這些基因在二倍體精巢中的表達(dá)量顯著高于在雌性三倍體中的表達(dá)(圖 3c, 圖 3d, 圖 3e), 這三個(gè)基因在二倍體虹鱒卵巢中的表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì)(圖3c, 圖3d,圖 3e)。

2.4 三倍體(XXX)虹鱒性類固醇激素(E2和T)的變化趨勢(shì)

在 10月齡時(shí)期, 雌性二倍體與三倍體虹鱒的血液E2差異不顯著(P>0.05), 但雄性二倍體血液E2顯著低于前兩者(P<0.05); 雄性二倍體虹鱒顯著高于雌性三倍體虹鱒的血液T含量, 且雌性二倍體虹鱒的血液T含量顯著低于前兩者(P<0.05)(圖4a, 圖4b)。

圖3 雌性3n體(XXX)虹鱒和2n體(XX, XY)虹鱒不同月齡的基因表達(dá)結(jié)果Fig.3 The gene expression profiles in gonads of 3n (XXX) and 2n (XX, XY) rainbow trout

圖4 10月齡雌性3n體(XXX)虹鱒和2n體(XX, XY)虹鱒血液E2和T含量對(duì)照結(jié)果Fig.4 Sex steroid levels of 3n (XXX) and 2n (XX, XY) rainbow trout at 334dpf

3 討論

眾所周知, 虹鱒的性別分化由性染色體所決定,其自仔魚(yú)首次接受外源性食物之時(shí)即開(kāi)始進(jìn)入性腺分化時(shí)期(Thorgaardet al, 1979; Van Den Hurket al,1981)。但魚(yú)類與哺乳動(dòng)物的性別決定機(jī)制存在極大不同, 而且具有重塑機(jī)制, 因?yàn)樵缙诖罅垦芯勘砻?性類固醇激素對(duì)于鮭科魚(yú)類性別分化及性腺發(fā)育起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用, 外源性類固醇激素能將性分化期魚(yú)類的遺傳性別表型所逆轉(zhuǎn)(Johnstoneet al, 1978;Goetzet al, 1979; Donaldsonet al, 1982; Yamazaki,1983)。本研究發(fā)現(xiàn), 虹鱒的二倍體與三倍體卵巢分化時(shí)間前后相差不大, 但分化速度存在差異, 三倍體虹鱒卵巢分化速度較慢, 其卵細(xì)胞及其濾泡細(xì)胞的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于二倍體的, 且三倍體的卵細(xì)胞及其濾泡細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則。盡管三倍體雌性虹鱒能夠分化出典型卵巢結(jié)構(gòu), 但卵原細(xì)胞及其濾泡細(xì)胞數(shù)量有限。早期研究認(rèn)為, 雌性三倍體虹鱒卵巢分化失常與第三套染色體干擾了初級(jí)卵母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂有關(guān)(Thorgaard et al, 1979; Chourrout et al, 1986)。顯然這個(gè)結(jié)果無(wú)法令人滿意, 盡管在三倍體卵巢敗育過(guò)程中確實(shí)發(fā)生了生殖細(xì)胞與性腺體細(xì)胞互作機(jī)制失常的情況, 但在該過(guò)程性腺特異基因的調(diào)控以及與性類固醇激素的協(xié)同作用并未被考慮到, 可能基因調(diào)控在發(fā)生性逆轉(zhuǎn)過(guò)程中起到了更為關(guān)鍵作用。

虹鱒即便多出一套染色體也能夠生存和繁殖,這一點(diǎn)是其他脊椎動(dòng)物做不到的, 四倍體(Carrasco et al, 1998)和三倍體(Lincoln et al, 1984; Benfey et al,1986)虹鱒精巢與二倍體虹鱒的有相同功能和形態(tài),然而, 三倍體雌性虹鱒是一個(gè)例外, 盡管它們能夠存活, 且卵巢可以正常分化, 但幼魚(yú)發(fā)育至 5—7月齡時(shí), 三倍體虹鱒卵巢仍停滯在Ⅰ期, 形態(tài)呈線狀, 顏色透明; 而同時(shí)期二倍體卵巢已經(jīng)發(fā)育至Ⅱ—Ⅲ期,卵巢中聚集這大量卵母細(xì)胞和濾泡細(xì)胞。該時(shí)期三倍虹鱒卵巢中缺乏卵母細(xì)胞, 鞘膜細(xì)胞不斷減少, 且形態(tài)不規(guī)則, 卵巢組織間隙出現(xiàn)大量微絨毛, 個(gè)別卵泡開(kāi)始空泡化。本研究通過(guò)大量觀察中發(fā)現(xiàn), 從仔魚(yú)上浮開(kāi)始至5月齡階段, 三倍體卵巢發(fā)育非常緩慢, 幾乎維持在分化末期形態(tài), 但卵原細(xì)胞及其附屬濾泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)退化嚴(yán)重, 這與Krisfalusi等(1999)關(guān)于三倍體雌性虹鱒性腺發(fā)育的研究結(jié)果相一致。虹鱒三倍體與二倍體卵巢形態(tài)相比, 三倍體卵巢呈線狀, 并且缺少初級(jí)卵母細(xì)胞, 這與早期研究結(jié)果相一致(Thorgaard et al, 1979; Lincoln et al, 1984; Krisfalusi et al, 1996)。本研究發(fā)現(xiàn), 在4月齡之前, 三倍體雌性虹鱒卵巢就未見(jiàn)清晰可辨認(rèn)的濾泡細(xì)胞層, 這說(shuō)明卵巢組織只有鞘膜細(xì)胞在發(fā)揮功能, 由于缺少濾泡細(xì)胞, 導(dǎo)致卵細(xì)胞與腦垂體性腺軸的聯(lián)系被切斷,因而使得其卵巢始終停滯在早期發(fā)育階段。

有研究報(bào)道, 在尼羅羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus) (Ijiri et al, 2008)、虹鱒(Baron et al, 2005a, b,c; Vizziano et al, 2007, 2008b)、鯽(Gobiocypris rarus)(Cao et al, 2012)和大西洋鱈(Gadus morhua) (Haugen et al, 2012)卵巢分化過(guò)程中, Cyp19a1a、Foxl2和Bmp4(Baron et al, 2005c; Vizziano et al, 2007)等基因表達(dá)量顯著上調(diào), 但在誘導(dǎo)雌性虹鱒雄性化過(guò)程中這些基因被強(qiáng)烈抑制(Baron et al, 2007, 2008;Vizziano et al, 2008a), 尤其是 Foxl2a, 在鳥(niǎo)類(Hudson et al, 2005)和魚(yú)類(Baron et al, 2004;Nakamoto et al, 2006; Wang et al, 2007)卵巢分化中該基因具有高度保守特征。本研究發(fā)現(xiàn), 在幼年期, 三倍體雌性虹鱒血清雌二醇含量與二倍體雌性的無(wú)顯著性差異(P>0.05), 但前者同時(shí)期Cyp19a1a和Foxl2的表達(dá)量顯著低于后者, 這可能與卵巢體細(xì)胞與卵細(xì)胞間的互作關(guān)系被切斷有關(guān)。已有大量研究表明,魚(yú)類的雌激素能夠強(qiáng)烈誘導(dǎo)Foxl2表達(dá)(Vizziano et al,2007), 而且 FOXL2/Foxl2能夠上調(diào) CYP19a/Cyp19a1a的表達(dá)(Baron et al, 2004; Wang et al, 2007),因此這兩個(gè)基因形成了一個(gè)正反饋回路。Baron等(2005c)的研究結(jié)果很好地證明了上述觀點(diǎn), 即一些雌魚(yú)性腺特異候選基因(如 Foxl2a、Foxl2b和Cyp19a1a等)在雄激素處理時(shí)都快速、強(qiáng)烈的被抑制。魚(yú)類雌激素調(diào)節(jié)Foxl2的表達(dá)以及FOXL2/Foxl2正向調(diào)節(jié) CYP19/Cyp19a1a, 這強(qiáng)有力的支持了 Foxl2和雌激素之間具有一個(gè)短的正反饋回路的假說(shuō)(Wang et al, 2007; Yamaguchi et al, 2007)。Dmrt1被認(rèn)為是與硬骨魚(yú)類(Koopman et al, 2003; Raghuveer et al, 2009;Herpin et al, 2011)精巢分化密切相關(guān)的基因, 在魚(yú)類性別分化及發(fā)育過(guò)程中起著重要作用。Vizziano等(2007, 2008a)和 Baron等(2008)的研究表明, 雄性化處理除了早期下調(diào)雌性相關(guān)特異基因, 還包括誘導(dǎo)精巢支持細(xì)胞中Amh、Sox9和Dmrt1等雄性特異基因表達(dá)上調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn), Dmrt1、Amh和Sox9在雌性三倍體虹鱒幼魚(yú)階段呈逐漸上調(diào)趨勢(shì), 且隨著睪酮含量的增加, 這三個(gè)基因的表達(dá)顯著高于同期在雌性二倍體虹鱒中的表達(dá)。在雌性三倍體虹鱒幼魚(yú)早期Amh和Sox9表達(dá)量低, 可能與該時(shí)期的雌激素和Cyp19a1a對(duì)它們的抑制有關(guān)。Guan等(2000)和Baron等(2008)在利用雄激素處理雌性虹鱒逆轉(zhuǎn)為雄性的研究中也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果, 他們認(rèn)為, 雄激素處理能有效誘導(dǎo)Amh和Sox9持續(xù)高表達(dá)。在使用外源性雄激素處理雌性虹鱒向雄性轉(zhuǎn)變過(guò)程中, 雄激素顯著抑制,并下調(diào)了 Cyp19a1a的表達(dá), 從而導(dǎo)致了內(nèi)源性雌激素含量降低, 進(jìn)而使得性腺向雄性化轉(zhuǎn)變。而在雌性三倍體中, Foxl2和Cyp19a1a表達(dá)量下調(diào)的誘因不是內(nèi)源性雌激素含量降低, 而是不斷升高的雄激素(睪酮), 并且睪酮顯著上調(diào)了雄性特異基因表達(dá), 尤其與精巢發(fā)育密切相關(guān)的基因 Amh和 Sox9。因此, 說(shuō)明性類固醇激素在雌性三倍體虹鱒性腺過(guò)程中可能都扮演著重要角色。

總之, 在所有脊椎動(dòng)物研究中, CYP19a是一種典型體細(xì)胞酶, 且維持著性腺中 Cyp19a1a表達(dá)和內(nèi)源性血清雌二醇合成, 并與體細(xì)胞分化狀態(tài)直接相關(guān)。而影響體細(xì)胞分化狀態(tài)的因素可能也依次調(diào)控了雌激素合成和卵巢分化結(jié)果。在對(duì)老鼠卵巢分化的研究發(fā)現(xiàn), 雌激素是維持卵巢體細(xì)胞分化的必要條件(Britt et al, 2003)。因此, 維持卵巢分化需要持續(xù)高水平的雌激素, 這可能是脊椎動(dòng)物進(jìn)化過(guò)程中的一個(gè)保守特征?？梢酝茢啻菩匀扼w虹鱒卵巢滯育將導(dǎo)致其體細(xì)胞去分化, 這對(duì)于 Cyp19a1a表達(dá)及雌二醇的合成存在抑制作用。因?yàn)檫@些雌激素是用來(lái)維持它們分化和繼續(xù)發(fā)育的, 這可能產(chǎn)生一個(gè)負(fù)反饋圈, 之后去分化會(huì)增強(qiáng)。最近有研究表明, 通過(guò)芳香化酶抑制劑(ATD)處理雌魚(yú), 可使已經(jīng)分化成雌性的魚(yú)發(fā)生雄性化逆轉(zhuǎn)(Nakamura et al, 2003; Bhandari et al, 2006;Ogawa et al, 2008), 這清楚的表明持續(xù)高水平雌激素對(duì)于維持卵巢分化所起到的決定性作用(或妨礙自生的精巢分化)。

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