馬燕花++楊少軍++師霞++邱曉青++徐三朋

摘要：目的 觀察慈菇消脂丸對非酒精性脂肪性肝炎（NASH）大鼠肝臟脂質(zhì)代謝及抗氧化能力的影響，探討其相關(guān)作用機(jī)制。方法 SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性藥組和中藥高、中、低劑量組。采用高脂飼料飼喂大鼠建立NASH模型，造模同時(shí)給予相應(yīng)藥物干預(yù)。造模12周，實(shí)驗(yàn)大鼠全部處死，取大鼠肝臟和血清。檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、游離脂肪酸（FFA）及肝組織勻漿T-SOD、MDA、GSH-Px、FFA，HE染色觀察肝組織病理形態(tài)，透射電鏡觀察肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，油紅O染色觀察肝細(xì)胞脂肪變性。結(jié)果 造模大鼠肝組織呈中重度脂肪變性并伴有炎癥細(xì)胞浸潤。與正常組比較，模型組大鼠肝濕重、肝指數(shù)和血清ALT、AST、TG、TC、LDL-C、MDA、FFA及肝組織勻漿MDA、FFA均明顯升高（P<0.05，P<0.01），血清及肝組織勻漿T-SOD、GSH-Px明顯降低（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，中藥高劑量組血清ALT、AST、TG、TC、LDL-C、MDA、FFA明顯降低，肝組織勻漿MDA、FFA明顯降低（P<0.05，P<0.01），血清及肝組織勻漿T-SOD、GSH-Px明顯升高（P<0.01）。病理觀察顯示，與模型組比較，中藥各劑量組大鼠肝小葉內(nèi)空泡樣變、脂肪樣變減少，炎性細(xì)胞浸潤明顯改善。結(jié)論 慈菇消脂丸能明顯改善模型大鼠肝功能及血脂水平，提高肝臟抗氧化能力，減輕脂質(zhì)過氧化損傷，達(dá)到防治NASH的目的。

關(guān)鍵詞：非酒精性脂肪性肝炎；慈菇消脂丸；脂毒性；氧化應(yīng)激；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.01.011

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）01-0048-06

Effects of Cigu Xiaozhi Pills on Lipotoxicity and Oxidative Stress

in Rats with Non-alcoholic Steatohepatitis

MA Yan-hua1， YANG Shao-jun2， SHI Xia1， QIU Xiao-qing3， XU San-peng1

1. Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China；

2. Beihai Traditional Chinese Medicine Hospital， Beihai 536000， China；

3. Affiliated Hospital of Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China

Abstract： Objective To explore the effects of Cigu Xiaozhi Pills on lipotoxicity and oxidative stress in rats with non-alcoholic steatohepatitis （NASH）； To discuss relevant mechanism of action. Methods SD rats were divided into six groups randomly： normal control group， model group， positive medicine group， Cigu Xiaozhi Pills high-， medium-， and low-dose groups. NASH model was established by feeding rats with high fat diet for 12 weeks. At the same time， the model rats were given medicine intervention. At the end of 12 weeks， all the experimental animals were killed and the liver and serum were taken. Serum samples were taken for detection of ALT， AST， TG， TC， T-SOD， LDL-C， MDA， GSH-Px and FFA. Liver tissues were taken for detection of T-SOD， MDA， GSH-Px and FFA. The liver histopathological changes were observed under microscope with HE staining. The ultrastructure of liver cells was observed by transmission electron microscope. The fatty degeneration of liver cells was observed by oil red O staining. Results Liver histopathological examination showed that the liver tissue of model group showed moderate to

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金地區(qū)基金（81560753）

severe steatosis and inflammatory cell infiltration. Compared with normal control group， rat liver wet weight， liver index， ALT， AST， TG， TC， LDL-C， MDA and FFA in serum， and FFA and MDA in liver homogenate in model group significantly increased （P<0.05， P<0.01）， while T-SOD and GSH-Px activity in serum and liver homogenate significantly decreased （P<0.05， P<0.01）. Compared with model group， Cigu Xiaozhi Pills high-dose group could significantly decrease the elevation of serum ALT， AST， TG， TC， LDL-C， MDA and FFA （P<0.05， P<0.01）， but increase T-SOD and GSH-Px activity in serum and liver tissue （P<0.01）. The pathological section showed that： compared with model group， the hepatic lobule vacuolar degeneration and fatty degeneration were significantly reduced in Cigu Xiaozhi Pills high-， medium- and low-dose groups， and the inflammatory cell infiltration was improved. Conclusion Cigu Xiaozhi Pills can obviously improve liver function and blood lipid of NASH rat model induced by high-fat diet， enhance antioxidant capacity， reduce lipid peroxidation and achieve the purpose of prevention and treatment of NASH.endprint

Keywords： non-alcoholic steatohepatitis； Cigu Xiaozhi Pills； lipotoxicity； oxidative stress； rats

非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）作為非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的臨床病理類型之一，由于其可進(jìn)展為肝纖維化、肝硬化甚至肝癌等終末期肝病，一直備受重視。NASH發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及脂代謝紊亂、胰島素抵抗、肝脂質(zhì)過氧化增加、細(xì)胞因子異常等多個(gè)相互關(guān)聯(lián)的病理生理環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，NASH發(fā)生、發(fā)展過程中肝細(xì)胞脂毒性凋亡是其重要特征，并參與整個(gè)發(fā)病過程[1]。游離脂肪酸（FFA）在NASH的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[2]。血液循環(huán)中高濃度FFA導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)與NASH肝細(xì)胞脂毒性凋亡密切相關(guān)[3]。慈菇消脂丸經(jīng)多年臨床應(yīng)用，在治療脂肪性肝病、肝纖維化、高脂血癥及肥胖患者等方面取得較好療效[4-5]。因此，本研究通過建立NASH大鼠模型，觀察慈菇消脂丸對NASH大鼠脂毒性及氧化應(yīng)激的影響，進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物和飼料

健康雄性SD大鼠60只，SPF級，8周齡，體質(zhì)量（200±20）g，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物許可證號SCXK（甘）2015-0002。飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對濕度50%～60%環(huán)境，12 h/12 h明暗交替。高脂飼料（73.8%基礎(chǔ)飼料+10%蛋黃粉+15%豬油+1%膽固醇+0.2%膽酸鈉），北京可澳協(xié)力飼料有限公司。

1.2 藥物

慈菇消脂丸（山慈菇、澤瀉、柴胡、山楂、決明子、甘草、何首烏等15味），飲片購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，加水適量，普通方法煎煮，濃縮至所需濃度；鹽酸吡格列酮片，北京太洋藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格15 mg/片，7片/盒，批號161101。

1.3 主要試劑與儀器

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、丙二醛（MDA）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、FFA檢測試劑盒和考馬斯亮藍(lán)，南京建成生物工程研究所；油紅O，美國Sigma公司。全自動(dòng)生化分析儀（Alcyon 300），美國Abbott；OLYMPUS萬能顯微鏡（VANOXAHB-LB型），日本OLYWPUS公司；透射電鏡（日立-HS500），日本日立公司；酶聯(lián)免疫檢測儀（PG-3022A型），Amersham Bioscienee；石蠟切片機(jī)（IVS-410），北京醫(yī)訊科技有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模、分組及給藥

參照文獻(xiàn)[6]方法采用高脂飼料喂養(yǎng)制作模型。大鼠標(biāo)準(zhǔn)食水適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將其隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性藥組和中藥高、中、低劑量組，每組10只。正常組給予普通標(biāo)準(zhǔn)飼料（總熱量15.335 J/g，碳水化合物熱卡占53%，脂肪熱卡占9%，蛋白質(zhì)熱卡占20%）喂養(yǎng)，同時(shí)按10 mL/kg體質(zhì)量灌服生理鹽水；模型組給予高脂飼料喂養(yǎng)，同時(shí)按10 mL/kg體質(zhì)量灌服生理鹽水；中藥各劑量組在高脂飼料喂養(yǎng)的同時(shí)給予10 mL/kg體質(zhì)量相應(yīng)濃度藥液灌胃；陽性藥組在高脂飼料喂養(yǎng)的同時(shí)給予吡格列酮藥液10 mL/kg灌胃。每日1次，連續(xù)12周。動(dòng)物給藥劑量按人與大鼠體表面積比折算成等效劑量。中藥高劑量按人等效劑量12倍量即0.648 g/100 g體質(zhì)量；中藥中劑量按人等效劑量6倍量即0.324 g/100 g體質(zhì)量；中藥低劑量按人等效劑量3倍量即0.162 g/100 g體質(zhì)量。每日觀察大鼠進(jìn)食、飲水、行為、活動(dòng)、精神狀態(tài)、毛發(fā)及二便等情況，每周稱重1次。

2.2 取材

實(shí)驗(yàn)持續(xù)至12周末結(jié)束。大鼠禁食24 h，次日腹腔注射10%水合氯醛麻醉，取靜脈血，3000 r/min離心15 min，分離血清，用于測定肝功能、血脂。迅速取出肝臟，稱量后將肝組織分為3塊：1塊做新鮮冰凍切片，紅油O染色觀察肝細(xì)胞脂肪變性；1塊置于4%多聚甲醛液中固定，HE染色觀察肝臟組織學(xué)變化；1塊置于4%戊二醛中固定，透射電鏡觀察肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

2.3 一般觀察

觀察大鼠生活狀態(tài)、食欲行為、毛發(fā)、死亡情況。處死前稱重，麻醉后取出肝臟，稱量肝濕質(zhì)量，計(jì)算肝指數(shù)（肝臟濕質(zhì)量÷體質(zhì)量×100%）。

2.4 大鼠血清肝功能和血脂測定

ALT、AST、TG、TC、LDL-C均用全自動(dòng)生化分析儀測定，黃嘌呤氧化酶法測定T-SOD，硫代巴比妥酸法測定MAD，5，5-雙硫代對硝基苯甲酸（DTNB）比色法測定GSH-Px，ELISA測定FFA。

2.5 大鼠肝勻漿指標(biāo)測定

精確稱取相同部位肝組織200 mg，用預(yù)冷生理鹽水漂洗，按質(zhì)量體積（g∶mL）1∶9加入勻漿介質(zhì)1.8 mL，冰浴條件下2000 r/min勻漿3～5 min，制成10%肝組織勻漿。按試劑盒說明書操作檢測肝組織T-SOD、MAD、GSH-Px、FFA。

2.6 病理觀察

新鮮肝組織冰凍切片，油紅O染色觀察肝細(xì)胞脂質(zhì)情況，另取部分肝組織4%多聚甲醛固定，常規(guī)制備組織石蠟切片，HE染色觀察肝組織形態(tài)學(xué)變化。

2.7 電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察

取肝組織塊切成約1 mm3，固定液（用25 g/L戊二醛l mL、雙蒸餾水4 mL、0.2 mol/L PBS 5 mL配制）固定后漂洗，逐級脫水、浸透、固化，LKB型超薄切片機(jī)切片50～60 nm，枸櫞酸鉛染色，透射電鏡下觀察肝細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)的超微結(jié)構(gòu)變化。endprint

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以—x±s表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 一般狀況

正常組大鼠毛色有光澤，行動(dòng)靈活，進(jìn)食水量正常；模型量組大鼠毛色暗淡，進(jìn)食量減少，不喜活動(dòng)；與正常組比較，中藥各劑量組大鼠毛色、行為、飲食無明顯異常；與正常組比較，模型組大鼠肝濕質(zhì)量和肝指數(shù)均顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，中藥各劑量組肝濕質(zhì)量和肝指數(shù)均顯著降低（P<0.01）。結(jié)果見表1。

4.2 慈菇消脂丸對模型大鼠血清酶學(xué)及脂質(zhì)水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清ALT、AST、MDA、TC、TG、LDL-C、FFA顯著升高（P<0.05，P<0.01），GSH-Px、T-SOD活性顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，中藥高劑量組大鼠血清ALT、AST、MDA、TC、TG、LDL-C、FFA顯著降低（P<0.05，P<0.01），GSH-Px、T-SOD活性顯著升高（P<0.01），中藥中劑量組大鼠血清ALT、AST、MDA、TG、LDL-C、FFA顯著降低（P<0.05，P<0.01），GSH-Px活性顯著升高（P<0.01），中藥低劑量組大鼠血清LDL-C含量顯著降低（P<0.05），其他各項(xiàng)指標(biāo)無顯著變化，陽性藥組大鼠血清ALT、AST、MDA、TG、LDL-C、FFA顯著降低（P<0.05，P<0.01），GSH-Px、T-SOD活性顯著升高（P<0.01）。中藥各劑量組與陽性藥組比較無顯著差異。結(jié)果見表2、表3。

4.3 慈菇消脂丸對模型大鼠肝組織酶學(xué)及脂質(zhì)水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠肝勻漿FFA、MDA含量顯著升高（P<0.01），T-SOD、GSH-Px活性顯著降低（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，中藥高劑量組大鼠肝勻漿FFA、MDA顯著降低（P<0.01），T-SOD、GSH-Px活性顯著升高（P<0.01），中藥中劑量組大鼠肝勻漿T-SOD、GSH-Px活性顯著升高（P<0.05），MDA含量顯著降低（P<0.01），F(xiàn)FA含量無顯著變化；中藥低劑量組大鼠肝勻漿MDA含量顯著降低（P<0.05），其余各項(xiàng)指標(biāo)無顯著變化，陽性藥組大鼠肝勻漿FFA、MDA含量顯著降低（P<0.05，P<0.01），GSH-Px、T-SOD活性顯著升高（P<0.05，P<0.01）；與陽性藥組比較，中藥低劑量組FFA含量顯著升高（P<0.05），其余各項(xiàng)指標(biāo)與陽性藥組比較無顯著差異。結(jié)果見表4。

4.4 肝組織病理變化

HE染色及油紅O染色光鏡觀察顯示，正常組大鼠肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索、肝竇分布如常，肝細(xì)胞形態(tài)一致，未見明顯變性壞死，小葉內(nèi)及匯管區(qū)未見明顯淋巴細(xì)胞浸潤；模型組大鼠肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索明顯增寬，肝竇融合，可見肝細(xì)胞彌漫性脂肪變，部分區(qū)域匯管區(qū)及小葉內(nèi)少量淋巴細(xì)胞浸潤。與模型組比較，中藥各劑量組大鼠肝細(xì)胞脂肪變性及炎癥反應(yīng)不同程度減輕。中藥高劑量組大鼠肝組織僅少數(shù)區(qū)域肝細(xì)胞內(nèi)見極少量大小不等脂肪空泡，匯管區(qū)及小葉內(nèi)未見明顯淋巴細(xì)胞浸潤；中藥中劑量組大鼠肝小葉中央部分區(qū)域肝細(xì)胞內(nèi)見少量脂肪空泡，匯管區(qū)及小葉內(nèi)未見明顯淋巴細(xì)胞浸潤；中藥低劑量組大鼠肝小葉中央部分區(qū)域肝細(xì)胞內(nèi)見數(shù)量較多的脂肪空泡，匯管區(qū)及小葉內(nèi)少量炎性細(xì)胞浸潤。結(jié)果見圖1、圖2。

4.5 電鏡超微結(jié)構(gòu)變化

正常組肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，膜界限清晰，Disse隙正常，血竇面和膽小管面可見微絨毛伸入腔內(nèi)，肝細(xì)胞連接面連接緊密，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見數(shù)量豐富且形態(tài)正常的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體復(fù)合體、核糖體，以及糖原顆粒、微小脂滴等內(nèi)含物，未見脂滴分布；細(xì)胞核形狀規(guī)則且居中，核仁明顯。模型組肝細(xì)胞腫脹，胞漿中布滿眾多大小不一的脂滴空泡，Disse隙擴(kuò)大且部分區(qū)域可見微絨毛和膠原纖維增生現(xiàn)象，偶見部分細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，線粒體變形、糖原顆粒大量聚集；細(xì)胞核固縮，可見異性染色質(zhì)。與模型組比較，中藥各劑量組均可見肝細(xì)胞內(nèi)脂滴空泡不同程度減少，各種細(xì)胞器和細(xì)胞內(nèi)含物均未出現(xiàn)異常，其中，中藥高劑量組肝細(xì)胞只含極少數(shù)脂滴，中藥中劑量組肝細(xì)胞內(nèi)含少數(shù)脂滴，中藥低劑量組肝細(xì)胞所含脂滴較多，但未見膠原纖維有增生現(xiàn)象。結(jié)果見圖3。

5 討論

NASH的發(fā)病機(jī)制目前廣泛接受的觀點(diǎn)是Day和James于1998年提出的“二次打擊”學(xué)說[7]。第一次打擊主要由于胰島素抵抗造成脂代謝紊亂，引起肝細(xì)胞脂肪變性，形成單純性脂肪肝；第二次打擊核心為氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，造成肝細(xì)胞凋亡甚至壞死。NASH患者有明顯的胰島素抵抗[8]，當(dāng)其發(fā)生時(shí)，脂肪組織分解釋放的FFA增多，導(dǎo)致血液循環(huán)中FFA增加，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、線粒體的功能紊亂、溶酶體細(xì)胞膜的變化、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)活性氧的形成、蛋白激酶的激活、炎癥途徑的激活，造成肝細(xì)胞功能障礙。作為第二次打擊的核心，氧化應(yīng)激介導(dǎo)了單純性脂肪肝向脂肪性肝炎、肝纖維化甚至肝硬化的進(jìn)展[9-10]。

目前對于NASH治療暫無特效藥物。NASH屬中醫(yī)“癥積”“痰濁”“脅痛”等范疇。臨床所見證型頗多，2011年中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)脾胃病分會(huì)就NAFLD提出中醫(yī)診療共識意見，將NAFLD的證候分為濕濁內(nèi)停證、肝郁脾虛證、濕熱蘊(yùn)結(jié)證和痰瘀互結(jié)證[11]。從中可以部分歸納出NAFLD的中醫(yī)主要病機(jī)為肝郁脾虛、濕熱濁毒內(nèi)蘊(yùn)、氣滯血瘀。由此說明濁毒壅滯是NAFLD的主要病機(jī)之一。筆者認(rèn)為“痰濕、濁脂（毒）”可能在NAFLD發(fā)病中起著關(guān)鍵作用，故提出以解毒化痰為主要治法的慈菇消脂丸對其進(jìn)行干預(yù)。慈菇消脂丸為本課題組自擬方，方中山慈菇有化痰解毒、消脂散結(jié)之功效，澤瀉、山楂祛脂化濁，丹參、土鱉蟲逐瘀通絡(luò)，柴胡、黃芩、法半夏疏肝理脾，決明子清肝降脂。全方立法以解毒化痰、消降濁脂為主。endprint

本研究采用高脂飼料喂養(yǎng)成功建立NASH大鼠模型，運(yùn)用慈菇消脂丸高、中、低劑量進(jìn)行干預(yù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，慈菇消脂丸能顯著降低高脂飲食誘導(dǎo)的NASH大鼠血清ALT、AST、TG、TC、LDL-C、MDA、FFA及肝勻漿MDA、FFA含量；升高大鼠血清及肝勻漿T-SOD、GSH-Px活性，有效改善NASH大鼠的肝功、血脂，抑制活性氧的生成，提高抗氧化能力。光鏡及電鏡下病理組織學(xué)觀察顯示，慈菇消脂丸明顯改善NASH大鼠肝臟脂肪變性和炎癥反應(yīng)。

綜上，胰島素抵抗使血液循環(huán)中FFA過高，當(dāng)其濃度超過正常水平上限時(shí)，導(dǎo)致多種引起脂毒性的應(yīng)激反應(yīng)，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[12]、氧化應(yīng)激[13]、凋亡及炎癥。生成過多的活性氧，攻擊生物膜而發(fā)生肝細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，同時(shí)耗竭肝細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化酶，使氧化物與抗氧化物之間的動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)，MDA含量升高，T-SOD、GSH-Px活性降低；同時(shí)抑制肝臟向外輸送脂肪酸，造成脂肪堆積嚴(yán)重[14-15]，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞的損傷。而慈菇消脂丸對NASH具有防治作用，其機(jī)制可能與降低脂毒性、提高抗氧化作用有關(guān)。

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（收稿日期：2017-03-09）

（修回日期：2017-04-12；編輯：華強(qiáng)）

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