， ，

腦性癱瘓(cerebral palsy，CP)簡稱腦癱，是一種非進行性腦損傷所致的，以姿勢異常和運動障礙為主要表現(xiàn)的綜合征，多在小兒出生前至出生后1個月內(nèi)發(fā)生，常合并有感知覺障礙、智力障礙等癥狀[1]。CP不僅對患兒的生長發(fā)育及日后生活帶來巨大影響，而且給患兒家庭帶來沉重的負擔。目前臨床上尚無確切治療腦癱的方法，也無有效藥物，只能依靠綜合治療方法進行早期康復治療[2]。干細胞移植技術(shù)及基因臨床治療技術(shù)日新月異的發(fā)展，為CP患兒的治療康復提供了新途徑[3]。為了探討干細胞移植是否對CP的治療有效，本研究采用改良的HIE手術(shù)方法對Wistar大鼠進行腦癱建模，建模后行側(cè)腦室內(nèi)神經(jīng)干細胞(NSCs)移植治療，并對模型組、對照組及實驗組大鼠神經(jīng)行為學檢測結(jié)果、Morris水迷宮逃避潛伏時間以及腦室旁白質(zhì)中膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的含量進行對比分析，以探究側(cè)腦室內(nèi)NSCs移植對腦癱鼠模型的治療效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取60只7日齡健康、SPF級Wistar大鼠，體重13 g～15 g，均喂養(yǎng)于自由進食、進水，相對濕度45%～60%，室溫23℃～25℃，光照12 h的環(huán)境中；大鼠購買自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證編號：SYXK(新)2015-0004。

1.2 藥品與儀器 側(cè)腦室神經(jīng)干細胞由本實驗室自行配置[4]；兔抗神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)由漢博士德生物工程有限公司提供；生物顯微鏡BX50F4，由日本OLYPUS公司提供。

1.3 動物分組與建模 建模方法：除對照組外，對48只大鼠行改良HIE造模方法。所有大鼠麻醉后，固定在手術(shù)板上，頸前正中作切口，分離并結(jié)扎左頸總動脈，然后縫合切口；將大鼠置于37℃的水封閉缺氧箱中，氧氣含量為8%，維持2 h；對建模后的大鼠，參考Hideyuki[5]的方法進行神經(jīng)行為學及病理學檢查，選取24只建模成功大鼠。 對照組假手術(shù)后，給予等量生理鹽水。 模型組造模后回籠飼養(yǎng)，給予等量生理鹽水。 NSCs組(實驗組)建模3 d后給予NSCs移植。

1.4 治療方法 實驗組大鼠建模3 d后，麻醉并進行顱骨鉆孔。將大鼠置于立體定向儀頭架上，進行左側(cè)腦室穿刺，微量泵緩慢注入2 μLNSCs移植液。注射后留針2 min，采用骨蠟將注射針孔封閉，縫合頭皮。

1.5 病理組織觀察 心臟灌注后，進行斷頭取腦，采用4%多聚甲醛溶液進行固定。24 h后，在腦前鹵取冠狀腦組織約1 mm，作石蠟切片。經(jīng)HE染色后，固定、晾干，光鏡下觀察。

1.6 觀察指標及評估方法 對比各組大鼠在42日齡時的Morris水迷宮溺水逃避潛伏期時間差異，Morris水迷宮是英國心理學家Morris于20世紀80年(1981)代初設(shè)計并應(yīng)用于腦學習記憶機制研究的一種實驗手段。將大鼠面向池壁分別從4個入水點放入水中若干次，記錄其尋找到隱藏在水面下平臺的時間(逃避潛伏期，escape latency)。采用懸吊實驗(大鼠前腿抓住粗0.5 cm的玻璃棒，觀察其掉下的時間，<10 s得1分；10 s～30 s得2分；31 s～119 s得3分；2 min～5 min得4分；>5 min得5分)、斜坡實驗(大鼠放置于坡度為45°的斜坡上，觀察大鼠調(diào)轉(zhuǎn)頭的時間)、曠場實驗(長寬高分別為36 cm的無蓋方盒，盒底劃分成9個等大小的格子，觀察記錄大鼠活動情況，大鼠1/2以上身體部位進入相鄰方格計為1分，大鼠后肢性站立得1分，二者相加為其總分)，評定各組大鼠的神經(jīng)行為能力。

對比各組大鼠的腦室旁白質(zhì)中膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)含量差異。免疫組化法檢測GFAP含量。斷頭取腦后制作石蠟切片；切片脫蠟脫水，微波抗原修復約20 min，3%H2O2室溫孵育10 min，BSA室溫封閉10 min，兔抗大鼠GFAP抗體處理4℃過夜。二抗37℃下孵育20 min，SABC試劑于37℃下孵育20 min。HE染色，經(jīng)脫水、透明后采用中性樹脂封片。晾干、待檢。400倍鏡下每張切片同一部位隨機選取5個不同的視野，采用數(shù)碼相機圖像采集系統(tǒng)采圖。Imageproplus6.0軟件對圖像進行分析，免疫組化檢測測量陽性細胞數(shù)，求其平均數(shù)作為最后的陽性結(jié)果，并記錄陽性細胞數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 病理切片結(jié)果分析 正常組大鼠腦室周圍組織中細胞排列規(guī)則，未發(fā)現(xiàn)炎癥細胞、軟化灶形成(見圖1A)；模型組大鼠的腦室周圍組織中可見細胞排列紊亂，細胞出現(xiàn)變性、腫脹、壞死，炎癥細胞浸潤增加，軟化灶形成(見圖1B)；NSCs組的病理嚴重程度較模型組顯著的減輕(見圖1C)。

注：A為正常組，B為模型組，C為NSCs組(100倍)。

圖1 HE染色觀察

2.2 各組大鼠Morris水迷宮逃避潛伏時間比較 42日齡時，模型組大鼠的Morris水迷宮逃避潛伏時間顯著長于NSCs組和正常組大鼠，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；NSCs組大鼠的Morris水迷宮逃避潛伏時間顯著長于正常組大鼠，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表1。

2.3 各組大鼠神經(jīng)行為能力測定 42日齡時，模型組大鼠的斜坡實驗時間顯著長于NSCs組和正常組大鼠，懸吊試驗和曠場試驗評分顯著低于NSCs組和正常組大鼠，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；NSCs組大鼠的斜坡實驗時間顯著長于正常組大鼠，懸吊試驗和曠場試驗評分顯著的低于正常組大鼠，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表2。

組別n懸吊試驗(分)斜坡實驗(s)曠場實驗(分)正常組 123．86±0．722．11±0．3713．61±2．85模型組 12 2．21±0．531)2) 4．20±0．561)2) 7．20±2．231)2)NSCs組123．18±0．671)2．95±0．421)10．42±2．501)F值8．41714．00315．928P0．037<0．001<0．001 與正常組比較，1)P<0．05，與NSCs組比較2)P<0．05。

2.4 各組大鼠腦室旁白質(zhì)中GFAP陽性細胞計數(shù) 42日齡時，模型組大鼠的腦室旁白質(zhì)中GFAP陽性細胞數(shù)目顯著高于NSCs組和正常組大鼠，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；NSCs組大鼠的腦室旁白質(zhì)中GFAP陽性細胞數(shù)顯著高于正常組大鼠，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表3、圖2。

組別nGFAP陽性細胞數(shù)(%)F值P正常組1241．3±3．2模型組1262．0±4．715．582<0．001NSCs組1247．8±4．5

注：A為正常組，B為模型組，C為NSCs組(200倍)。

3 討 論

隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，腦性癱瘓患兒的生存率逐年上升，腦性癱瘓患兒的治療康復方法亦成為臨床研究的重點。腦性癱瘓發(fā)病機制尚不明確，其發(fā)生與圍生期多因素相關(guān)，如早產(chǎn)、低體重、產(chǎn)時窒息、感染、多胎以及腦室周白質(zhì)軟化等均為腦性癱瘓的常見危險因素[6-7]。神經(jīng)干細胞具有多向分化及自我更新的能力，能夠促進損傷腦組織再生，維持神經(jīng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，近年來外源性NSCs治療腦損傷已成為臨床研究熱點[8-11]。為探討側(cè)腦室內(nèi)神經(jīng)干細胞移植對小兒腦癱的治療效果，本研究對7日齡大鼠進行腦癱造模并采用側(cè)腦室內(nèi)神經(jīng)干細胞移植治療。

3組病理組織觀察：正常組大鼠腦室周圍組織中細胞排列規(guī)則，未發(fā)現(xiàn)炎癥細胞、軟化灶形成；模型組大鼠的腦室周圍組織中可見細胞排列紊亂，細胞出現(xiàn)變性、腫脹、壞死，炎癥細胞浸潤增加，軟化灶形成；NSCs組的病理嚴重程度較模型組顯著減輕。說明神經(jīng)干細胞干預治療能夠減輕損傷部位炎性反應(yīng)，減緩炎癥浸潤，保護腦室周圍組織細胞。

3.1 NSCs移植對腦癱鼠Morris水迷宮逃避潛伏時間的影響 Morris水迷宮實驗具有視頻攝像跟蹤技術(shù)，能夠避免人為干擾，結(jié)果真實可靠，被廣泛用于動物的空間學習記憶能力的研究。本研究采用Morris水迷宮對3組大鼠學習記憶能力進行檢測，結(jié)果顯示：42日齡時，模型組大鼠的Morris水迷宮逃避潛伏時間顯著長于NSCs組和正常組大鼠；NSCs組大鼠的Morris水迷宮逃避潛伏時間顯著長于正常組大鼠。說明NSCs移植能夠改善腦癱鼠的智力水平，提升空間學習記憶能力，對腦癱鼠治療具有積極意義。

3.2 NSCs移植對腦癱鼠神經(jīng)行為能力的影響 42日齡時，模型組大鼠的斜坡實驗時間顯著長于NSCs組和正常組大鼠，懸吊試驗和曠場試驗評分顯著低于NSCs組和正常組大鼠；NSCs組大鼠的斜坡實驗時間顯著長于正常組大鼠，懸吊試驗和曠場試驗評分顯著低于正常組大鼠。NSCs組的神經(jīng)行為能力明顯高于模型組，說明NSCs移植干預治療后腦癱鼠的神經(jīng)行為能力得到提升。

3.3 NSCs移植對腦癱鼠腦室旁白質(zhì)中GFAP陽性細胞數(shù)量的影響 星形膠質(zhì)細胞(AS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要細胞之一，具有維持神經(jīng)細胞微環(huán)境穩(wěn)定以及調(diào)節(jié)代謝過程的作用，膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibillary acidic protein GFAP)是AS中間纖維所特有一種細胞骨架蛋白，可作為AS的特征性標記物[12-13]。本研究通過對3組大鼠腦室旁白質(zhì)中GFAP陽性細胞數(shù)量的檢測，結(jié)果顯示：42日齡時，模型組大鼠的腦室旁白質(zhì)中GFAP陽性細胞數(shù)目顯著高于NSCs組和正常組大鼠；NSCs組大鼠的腦室旁白質(zhì)中GFAP陽性細胞數(shù)顯著高于正常組大鼠。星形膠質(zhì)細胞具有保護及抑制神經(jīng)元的雙重作用：神經(jīng)損傷后AS激活，產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)因子及大量GFAP用于損傷修復；大量GFAP堆積以及AS過度膠質(zhì)化，可形成機械阻斷屏障，影響髓殼等的再生。本研究中NSCs組大鼠GFAP數(shù)量大于對照組，說明AS激活，機體修復神經(jīng)損傷，但其數(shù)量小于模型組，可以減少AS細胞過度膠質(zhì)造成的負面作用。

腦癱鼠模型采用側(cè)腦室內(nèi)NSCs移植治療，能夠顯著的改善其神經(jīng)行為及學習能力，值得臨床對此方法進一步研究使用。

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