曾 立，耿 歡，邢更彥

骨質(zhì)疏松癥是一種由于骨形成和骨吸收的負相平衡導致骨骼脆弱，以骨量減少與骨的微觀結構破壞為特點并增加了骨折風險為特征的疾病[1]。中國已進入老齡社會，隨著老年人口比例的增加和人均壽命的延長，骨質(zhì)疏松癥及骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)病率逐年提升。骨質(zhì)疏松性骨折是骨質(zhì)疏松癥最嚴重的后果，也是導致中老年人殘疾并喪失自理能力最常見的原因之一[2]。

骨質(zhì)疏松癥與破骨細胞數(shù)量增多和骨吸收活性的增強有密切聯(lián)系[3]，破骨細胞是骨組織中由單核巨噬細胞分化來的、特殊的，且唯一具有吞噬骨組織功能的多核巨細胞[4,5]，因此，對破骨細胞的研究非常重要。簡捷快速獲取破骨細胞是進行相關實驗的前提，然而，破骨細胞是終末分化的細胞，無法傳代，在體外存活時間短，獲取相對困難[6]。目前，科研人員主要用RAW 264.7細胞與骨髓源巨噬細胞（bone marrow-derived macrophages，BMMs）來誘導破骨細胞。RAW 264.7細胞是小鼠單核巨噬細胞白血病細胞，BMMs是骨髓來源的巨噬細胞[7]，RAW 264.7是較BMMs更晚期分化階段的破骨細胞前體細胞[8]，兩者誘導破骨細胞的效率與誘導出破骨細胞的功能是否有差異還需深入研究。本實驗旨在觀察小鼠單核巨噬細胞RAW 264.7與BMMs在核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL）的誘導下生成破骨細胞數(shù)量與骨吸收功能的差異，以研究RAW 264.7細胞是否可替代BMMs用于誘導破骨細胞。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 α-MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司，美國）；抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）染色試劑盒（Sigma公司，美國）；CD11b抗體（Abcam，英國）；RANKL、巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colonystimulating factor，M-CSF）（R&D公司，美國）；鬼筆環(huán)肽染色液（Invitrogen，美國）；25 cm2培養(yǎng)瓶、24孔骨細胞培養(yǎng)板（康寧，美國）；紅細胞裂解液（上海碧云天）；熒光倒置顯微鏡（奧林巴斯，日本）；4周雄性C57BL/6小鼠（購自北京維通利華）；RAW 264.7小鼠單核巨噬細胞（購自北京協(xié)和細胞庫）。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠BMMs的提取與培養(yǎng) 4周雄性C57BL/6小鼠麻醉后脫臼處死，75%乙醇浸泡5 min，于超凈臺中取出股骨與脛骨，剪去干骺端，用5 ml注射器抽取無菌磷酸緩沖鹽溶液（phosphate-buffered saline，PBS）沖洗骨髓腔，動作輕柔，直至沖出的PBS由淡紅色變?yōu)橥噶恋陌咨?。收集沖洗液離心（200×g，3 min），棄上清；沉淀加入5倍體積紅細胞裂解液，于冰上裂解10 min，離心（200×g，3 min），棄上清；沉淀用α-MEM培養(yǎng)基重懸，離心（200×g，3 min），棄上清；5 mlα-MEM完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，1%青鏈霉素）重懸沉淀；接種至25 cm2培養(yǎng)瓶，每毫升α-MEM完全培養(yǎng)基加入30 ng M-CSF，置于CO2培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）培養(yǎng)[9]，3 d后對貼壁細胞進行免疫熒光鑒定。實驗重復3次。

1.2.2 小鼠單核細胞的CD11b免疫熒光鑒定 將上步所得貼壁細胞懸液接種至激光共聚焦培養(yǎng)皿；加入1 ml含有30 ng/ml M-CSF的α-MEM完全培養(yǎng)基，第2天細胞貼壁良好后，去除培養(yǎng)液，PBS漂洗2遍，4%多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗2遍，0.1% Triton-100通透10 min，PBS漂洗2遍，3%牛血白蛋白（bovine serum albumin，BSA）室溫封閉1 h，PBS漂洗2遍，陽性組加入500 μl稀釋好的CD11b抗體，陰性對照組加入500 μl正常兔IgG抗體。4 ℃孵育過夜后PBS漂洗3遍，10 min/次，加入500 μl綠色熒光二抗室溫孵育2 h，PBS洗3遍，10 min/次，加入500 μl Hoechst染色10 min后，激光共聚焦顯微鏡觀察并采集圖片。實驗重復3次。

1.2.3 破骨細胞的誘導 BMMs細胞懸液（5×103/cm2）接種至48孔板中，每孔加入500 μlα-MEM完全培養(yǎng)基（含M-CSF，20 ng/ml；RANKL，20 ng/ml）誘導，每2 d換液，4 d后可見破骨細胞。以5×103/cm2的密度將RAW 264.7細胞接種于48孔板中，每孔加入500 μl DMEM高糖完全培養(yǎng)基（含RANKL，20 ng/ml）誘導，每2 d換液，4 d后進行TRAP染色。實驗重復3次。

1.2.4 破骨細胞的TRAP染色 BMMs及RAW 264.7細胞用上述方法誘導后，兩種細胞分別設立對照組與誘導組，對照組不加RANKL。誘導4 d后，去除原培養(yǎng)基，PBS漂洗2遍，4%多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗2遍，0.1%Triton-100通透10 min，PBS漂洗2次，加入TRAP染色液；避光37℃孵育1 h，PBS洗2遍，肉眼可見孔內(nèi)細胞被染為酒紅色，顯微鏡下觀察。實驗重復3次。

1.2.5 破骨細胞纖維肌動蛋白環(huán)的熒光染色 BMMs及RAW 264.7細胞經(jīng)RANKL誘導4 d后，去除原培養(yǎng)基，PBS漂洗2次，4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS漂洗2遍，0.1% Triton-100通透10 min，PBS漂洗2次，鬼筆環(huán)肽染色20 min，PBS漂洗2遍，Hoechst染色10 min，PBS漂洗2遍，熒光顯微鏡下采集照片。

1.2.6 破骨細胞骨吸收功能檢測 BMMs及RAW 264.7細胞以5×103/cm2的密度接種于24孔骨細胞培養(yǎng)板，均設對照組與誘導組，用上述方法誘導，對照組不加RANKL。每2 d換液，4 d后移除培養(yǎng)液，用去離子水漂洗2遍，加入4%次氯酸鈉漂洗5 min；去離子水漂洗2遍，室溫晾干，普通倒置顯微鏡下觀察。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據(jù)均為計量資料，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 BMMs表面抗原CD11b的鑒定 骨髓原始細胞經(jīng)M-CSF刺激培養(yǎng)后，表面CD11b抗體檢測顯示：陽性組幾乎所有的細胞均被染成了綠色，藍色為細胞核，陰性對照組未被染上綠色，證實原始細胞經(jīng)M-CSF刺激后所得的細胞是BMMs，見圖1。

圖1 CD11b在BMMs中的表達（標尺=10 μm）

2.2 破骨細胞的TRAP染色結果 RAW 264.7細胞與BMMs誘導4 d后出現(xiàn)大量圓形、橢圓形體積巨大細胞，行TRAP染色可見為酒紅色（TRAP陽性）的多核巨細胞，有的核可達上百個，對照組未見TRAP陽性的多核巨細胞，見圖2。即RAW 264.7細胞與BMMs均可誘導出大量TRAP陽性的破骨細胞，結果顯示，BMMs與RAW 264.7細胞誘導出的破骨細胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義。

圖2 RAW 264.7細胞與BMMsTRAP染色（標尺 =100 μm）

2.3 破骨細胞纖維肌動蛋白環(huán)的熒光染色 誘導4 d后紅色鬼筆環(huán)肽染色顯示，RAW 264.7細胞與BMMs經(jīng)過誘導均出現(xiàn)形成纖維肌動蛋白環(huán)的成熟破骨細胞，復染Hoechst可見細胞內(nèi)有大量的藍色細胞核，有的可達上百個，統(tǒng)計分析后兩種細胞誘導出的具有纖維肌動蛋白環(huán)結構的細胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義，見圖3。

圖3 RAW 264.7細胞與BMMs紅色鬼筆環(huán)肽染色（標尺 =100 μm）

2.4 破骨細胞的骨板吸收結果 RAW 264.7細胞與BMMs在24孔骨細胞培養(yǎng)板中誘導4 d后，可見大量圓形、橢圓形、不規(guī)則形的白色吸收瘢痕，對照組未見吸收瘢痕；RAW 264.7細胞與BMMs誘導出的破骨細胞在骨細胞培養(yǎng)板上的吸收瘢痕差異無統(tǒng)計學意義，見圖4。

3 討 論

圖4 RAW 264.7細胞與BMMs經(jīng)RANKL誘導后的骨吸收結果（標尺=100 μm）

長期以來多數(shù)研究人員認為骨的生理平衡主要是通過內(nèi)分泌系統(tǒng)來調(diào)節(jié)的，但研究表明，免疫系統(tǒng)與神經(jīng)系統(tǒng)在骨生理平衡的調(diào)節(jié)過程中起著重要作用[10,11]。成骨細胞的骨形成與破骨細胞的骨吸收維持著骨組織的穩(wěn)態(tài)，打破這種穩(wěn)態(tài)會導致骨代謝性紊亂疾病如骨質(zhì)疏松癥[12]、骨硬化病等。破骨細胞是由單核巨噬細胞融合而來[13]，是骨組織中唯一具有骨吸收功能的細胞，研究破骨細胞對發(fā)現(xiàn)藥物的新靶點具有重要意義。M-CSF與RANKL是破骨細胞分化與成熟過程中最重要的兩個細胞因子[4]，用M-CSF與RANKL可誘導單核細胞分化為破骨細胞[14]。M-CSF促進單核細胞的增殖與細胞骨架的形成，RANKL是破骨細胞分化的關鍵細胞因子，其與破骨細胞前體細胞上RANK受體結合后，募集下游的腫瘤壞死因子受體相關因子6結合到RANK在胞內(nèi)的特殊結構域[14,15]，激活向破骨細胞分化的信號通路，如MAPKs與NF-κB信號通路[16]，激活轉錄因子NFATC1，最終引起破骨細胞分化[17]。

BMMs是骨髓源巨噬細胞，CD11b是巨噬細胞的特殊表面標記[18]，表達CD11b的巨噬細胞可經(jīng)RANKL誘導分化為破骨細胞[7]，通過CD11b免疫熒光鑒定骨髓原始細胞經(jīng)M-CSF刺激獲得的貼壁細胞為巨噬細胞。研究證實，BMMs可經(jīng)M-CSF與RANKL誘導為成熟的破骨細胞[15]，而RAW 264.7細胞是小鼠單核巨噬細胞系，只需RANKL刺激即可分化為破骨細胞[3]。二者是體外誘導破骨細胞的主要細胞來源，但在破骨分化的效率及破骨細胞的活性差異方面研究較少。

RAW 264.7細胞與BMMs誘導破骨細胞需要4 d[19]，且在誘導破骨細胞生成的過程中，影響其生成效率的最關鍵因素不是RANKL的濃度，而是破骨細胞前體細胞的接種密度[13,19]。本實驗結果顯示，RAW 264.7細胞與BMMs經(jīng)20 ng/ml RANKL誘導4 d后均出現(xiàn)TRAP陽性與纖維肌動蛋白環(huán)形成的成熟多核破骨細胞，同時兩種細胞誘導出的破骨細胞骨吸收活性均較好。RAW 264.7細胞與BMMs誘導破骨細胞效率與時間無差異，且破骨細胞的骨吸收能力也無統(tǒng)計學差異。但BMMs獲取繁瑣，純化困難且需M-CSF刺激，耗時費力，RAW 264.7細胞培養(yǎng)簡單且只需要RANKL就可誘導出大量的破骨細胞。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)RAW 264.7細胞與BMMs向破骨細胞分化的特性無明顯差異，但鑒于RAW 264.7細胞培養(yǎng)簡單且易于誘導出大量破骨細胞，筆者認為可以用其替代BMMs誘導破骨細胞。

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