馬麗娟，安永強(qiáng)，劉巍

細(xì)胞凋亡在多細(xì)胞真核生物的正常發(fā)育過程中扮演著重要角色，并參與機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持。細(xì)胞凋亡和死亡可由兩種截然不同的途徑引起，將細(xì)胞死亡具體為凋亡、壞死、自噬和有絲分裂災(zāi)難等，并提出程序性壞死（necroptosis）的概念，現(xiàn)已成為研究熱點(diǎn)。

1 程序性壞死與凋亡的區(qū)別和聯(lián)系

程序性壞死區(qū)別于凋亡，是一種半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）非依賴性的程序性細(xì)胞死亡方式，其特點(diǎn)是：①質(zhì)膜完整性嚴(yán)重破壞；②細(xì)胞及其內(nèi)容物崩解；③細(xì)胞內(nèi)容物釋放后引起顯著的炎癥反應(yīng)；④未形成凋亡小體。近年研究表明，細(xì)胞壞死同樣存在可調(diào)控的信號通路，在程序性壞死中受體相互作用蛋白（RIP）是一類重要的調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡或存活的信號分子，尤其是受體相互作用蛋白激酶1（RIP1）與受體相互作用蛋白激酶3（RIP3）在程序性壞死信號通路中發(fā)揮關(guān)鍵性調(diào)控作用，其表達(dá)水平可提示程序性壞死程度[1]。

有報(bào)道稱，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）處理后的L929細(xì)胞發(fā)生了細(xì)胞凋亡[2]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，用TNF-α處理小鼠纖維肉瘤L929細(xì)胞后，同時(shí)出現(xiàn)凋亡和壞死；使用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制劑Z-VAD-FMK（Z-VAD）抑制細(xì)胞凋亡后，凋亡抑制的同時(shí)，出現(xiàn)細(xì)胞壞死。相比之下，以Z-VAD抑制細(xì)胞凋亡，反而加速壞死。表明某些類型的細(xì)胞壞死與凋亡存在共用部分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，且壞死和凋亡的信號通路中一條通路受到抑制可影響另一通路[3]。

2 程序性壞死中重要調(diào)控分子：RIP家族

RIP家族是一種特異的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的蛋白，其在結(jié)構(gòu)上都具有一段保守的激酶結(jié)構(gòu)域，具有同源的N末端卻有不同的募集域。因此，該蛋白家族成員有共同生物學(xué)功能, 在細(xì)胞受到外界環(huán)境影響時(shí)（如：病原體感染、炎癥反應(yīng)），可被上游信號激活，引發(fā)一系列下游的級聯(lián)反應(yīng)。激活轉(zhuǎn)錄因子而有些成員被激活后則協(xié)助死亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)細(xì)胞死亡。RIP家族具有多個(gè)成員RIP1-7，雖然每個(gè)成員都有各自的功能，但目前RIP1和RIP3[4]起到關(guān)鍵的調(diào)控作用。

2.1 程序性壞死阻斷劑Necrostatin-1類似物程序性壞死抑制劑Nec-1有三種類似物：RIPK1的活性抑制劑Nec-1，無活性Nec-1變體（Nec-1i）和更穩(wěn)定的Nec-1變體（Nec-1s）。是一類合成的RIP1特異性阻斷劑，是通過阻斷RIP1和RIP3發(fā)生磷酸化，進(jìn)而阻止細(xì)胞程序性壞死的發(fā)生。在體內(nèi)，Nec-1和Nec-1i不僅是RIPK1抑制劑，而且是強(qiáng)效的吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO）抑制劑。在動(dòng)物疾病模型中，考慮到涉及RIPK1 / RIPK3依賴性壞死的病理?xiàng)l件越來越多，Nec-1已被廣泛應(yīng)用于RIPK1參與的細(xì)胞壞死和炎癥的研究中，高劑量Nec-1能夠有效避免TNF誘導(dǎo)的程序性壞死。然而，在體內(nèi)使用Nec-1逐漸出現(xiàn)一些問題：較低劑量Nec-1和Nec-1i表現(xiàn)致敏和產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。這種敏化不是因?yàn)镽IPK1靶向阻斷和程序性壞死，而是阻斷靶向目標(biāo)IDO的結(jié)果。Nec-1s不會(huì)干擾IDO，其無論是高劑量還是低劑量均具有細(xì)胞保護(hù)作用，無細(xì)胞毒性。因此，Nec-1s不僅是一種更具特異性的抑制劑，而且也是一種優(yōu)異的抑制劑，更適用于體內(nèi)應(yīng)用[5]。

2.2 RIP1和RIP3在信號通路中的作用RIP1既參與程序性壞死，又參與細(xì)胞凋亡。當(dāng)受到TNF刺激時(shí)，通過死亡結(jié)構(gòu)域（DD）募集銜接蛋白TNF相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域（TRADD）、TNF受體相關(guān)蛋白2（TRAF2）、RIP1、細(xì)胞凋亡抑制蛋白（cIAP）及線性泛素鏈組合體復(fù)合物（LUBAC），形成復(fù)合體1[6]。在RIPK1上的泛素鏈作為一個(gè)支架來激活NF-κB和有絲分裂蛋白激酶途徑，并抑制壞死部分的形成，且cIAP介導(dǎo)的RIP1上的賴氨酸63（Lys63型）多聚泛素鏈修飾水平上調(diào)，從而下調(diào)RIP1與Caspase8、FADD形成復(fù)合物水平，抑制caspase級聯(lián)引起的細(xì)胞凋亡，激活I(lǐng)KK/NF-κB通路，從而抑制凋亡[7]。

不同于TNFR1誘導(dǎo)的信號通路，凋亡通路啟動(dòng)后Fas誘導(dǎo)的信號直接募集FADD、RIP3和前體caspase 8，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體，即復(fù)合體2[6,8]。復(fù)合體1和復(fù)合體2通過磷酸化的RIP1和RIP3的RHIM形成壞死復(fù)合物。壞死復(fù)合體形成后，自磷酸化的RIP3可募集混合系蛋白激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白（MLKL），磷酸化的MLKL形成低聚物，轉(zhuǎn)移到胞內(nèi)膜和質(zhì)膜，導(dǎo)致膜破裂，執(zhí)行程序性壞死[9-11]。通過抑制RIPK1/RIPK3/MLKL復(fù)合物的形成，LUBAC促進(jìn)腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）誘導(dǎo)NF-κB的激活，抑制TRAIL誘導(dǎo)的壞死[12]。

此外，Obitsu等[7]還發(fā)現(xiàn)桐油酸（ESA）所誘發(fā)的一種新的RIP1依賴的非典型的細(xì)胞凋亡是通過MEK/ERK途徑來調(diào)節(jié)的。ESA激活的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，如鈣調(diào)磷酸酶，其誘導(dǎo)RIP1脫磷酸化，激活ERK途徑。ESA介導(dǎo)的細(xì)胞死亡與AIF和RIP1、AIF和ERK1/2的核轉(zhuǎn)位及ROS產(chǎn)生有關(guān)。ROS的生成和ATP的減少會(huì)使線粒體結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

2.3 RIP1和RIP3參與程序性壞死中的作用程序性壞死可通過不同機(jī)制執(zhí)行，如：細(xì)胞能量代謝的加強(qiáng)、氧化損傷和炎癥反應(yīng)、可能參與一氧化氮（NO）介導(dǎo)的細(xì)胞壞死等作用機(jī)制。

2.3.1 參與細(xì)胞能量代謝作為一種新的程序性死亡方式，程序性壞死在許多疾病的病理過程中發(fā)揮了重要作用，特別是在急性炎癥、缺血性損傷及病毒感染等急危重癥中，由于caspase的活性有賴于一定水平的ATP，而此時(shí)細(xì)胞生成的ATP不足以支持caspase的功能，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)程序性壞死。據(jù)報(bào)道[13]，過量的RIP3導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝紊亂，過分加強(qiáng)糖原磷酸化酶谷氨酰胺合成酶（GLUL）及谷氨酸脫氫酶（GLUDl）的活性，且這些酶均為細(xì)胞能量代謝信號通路上的關(guān)鍵酶，通過加強(qiáng)細(xì)胞能量代謝，過量產(chǎn)生相關(guān)底物—磷酸化葡萄糖和酮戊二酸, 加強(qiáng)線粒體內(nèi)三梭酸循環(huán)，引起活性氧物質(zhì)ROS蓄積[7]，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)。目前普遍認(rèn)為，線粒體是細(xì)胞能量代謝的重要場所，參與多種細(xì)胞生命活動(dòng)，決定細(xì)胞的存活或凋亡。線粒體功能障礙是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要機(jī)制，其中線粒體通透性轉(zhuǎn)換（MPT）通路在該過程中發(fā)揮著重要作用，而活性氧的蓄積可使線粒體膜通透性改變，誘發(fā)細(xì)胞的程序性壞死。Northington等[14]發(fā)現(xiàn)Nec-1通過抑制DRP1蛋白的表達(dá)，減輕線粒體損傷和減少ROS的生成，進(jìn)而減輕腦缺血缺氧損傷后細(xì)胞的壞死。

2.3.2 抑制氧化損傷和炎癥反應(yīng)通過影響細(xì)胞死亡、炎癥和ECM降解，以細(xì)胞凋亡、原發(fā)性或繼發(fā)（后凋亡）壞死為基礎(chǔ)，導(dǎo)致炎癥的釋放，進(jìn)而引發(fā)炎癥。痘病毒serpin Spi/B13R 可抑制caspase-1和caspase-8，因此病毒感染早期產(chǎn)生的TNF可使不同組織、細(xì)胞出現(xiàn)程序性壞死。更重要的是感染后期，由于巨噬細(xì)胞發(fā)生程序性壞死，使大量結(jié)核桿菌被釋放到胞外，從而加重感染。結(jié)核桿菌可通過誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞發(fā)生程序性壞死，促進(jìn)其自身的增殖與擴(kuò)散[15]。RIP1抑制劑Nec-1s阻斷細(xì)胞凋亡和壞死通路，間接抑制炎癥反應(yīng)[16]，Nec-1s也可通過阻止單核細(xì)胞的遷移和分化，直接抑制炎癥反應(yīng)[17]。

RIP1可作為一個(gè)死亡促進(jìn)因子，在促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的生成方面具有重要作用[13]。在蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦損傷的早期，NLRP3炎性體是炎癥反應(yīng)的一個(gè)重要組成部分。蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）導(dǎo)致RIP1、RIP3、磷酸化蛋白和NLRP3炎性體表達(dá)上調(diào)，并通過RIP1-RIP3-DRP1信號通路進(jìn)一步激活NLRP3炎性體[18]，增加細(xì)胞損傷。Northington等[14]發(fā)現(xiàn)Nec-1通過下調(diào)DRP1蛋白的表達(dá)，減輕線粒體損傷和減少ROS的生成，抑制NLRP3炎性體和減輕腦水腫和神經(jīng)功能缺損等，抑制氧化損傷和炎癥反應(yīng)。采用Nec-1或RIPK3基因敲除的方法，避免腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的致命性的全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS），表明抑制RIPK1/RIPK3信號通路可降低TNF引發(fā)的死亡率[19]。通過RIP1抑制necrostatin-1s（Nec-1s）避免了巨噬細(xì)胞因局部缺血引起的壞死，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞浸潤減少，抑制炎性免疫激活[20]。

2.3.3 NO介導(dǎo)的細(xì)胞壞死RIP1和RIP3介導(dǎo)的細(xì)胞程序性壞死是通過受體信號級聯(lián)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。然而，RIP1和RIP3介導(dǎo)的非受體依賴型程序性壞死是通過NO發(fā)揮作用[21]。在缺血再灌注損傷后，心臟發(fā)生收縮功能障礙、代謝異常和結(jié)構(gòu)改變，其中氧自由基的過量產(chǎn)生是導(dǎo)致心肌缺血/再灌注（I/R）損傷的重要原因之一。組織缺血缺氧后體內(nèi)產(chǎn)生大量的誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（iNOS）[22]、NO和O2-，巨噬細(xì)胞、心肌細(xì)胞等催化iNOS迅速結(jié)合NO產(chǎn)生大量氧自由基，參與缺血性疾病、炎癥和退行性神經(jīng)病變等病理過程。在體大鼠心肌I/R損傷過程中，氧自由基大量生成，促進(jìn)下游信號分子RIP1磷酸化，加重I/R損傷[23]。Nec-1s則通過降低iNOS水平，抑制NO大量生成，有效抑制NO介導(dǎo)的細(xì)胞壞死，對心肌具有保護(hù)作用。

2.3.4 抑制免疫反應(yīng)和促進(jìn)結(jié)締組織修復(fù)心肌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白主要由彈性蛋白和膠原蛋白構(gòu)成，膠原蛋白是ECM的主要組成成分，占ECM的80%，其中以Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白為主。彈性纖維是結(jié)締組織的重要組成成分，使所在組織保持良好彈性。心肌梗死后,距離梗死時(shí)間越長，梗死區(qū)域Ⅰ型和Ⅲ型彈力纖維成分逐漸下降，而膠原纖維含量逐漸增多，彈性蛋白和膠原蛋白比例失調(diào)是梗死后瘢痕區(qū)硬度增加、彈性下降的病理學(xué)基礎(chǔ)[24]。Nec-1s可上調(diào)LOX和彈性蛋白原表達(dá)，抑制膠原蛋白沉積，可改善彈性蛋白和膠原蛋白比例失調(diào)，促進(jìn)結(jié)締組織修復(fù)，使得心臟彈性收縮力增加，阻止心梗后心功能障礙[17]。

3 RIP1和RIP3與心血管疾病

3.1 RIP1和RIP3與冠心病在小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型中，RIP3基因敲除小鼠晚期粥樣斑塊的面積明顯減小，且病灶中發(fā)生程序性壞死的巨噬細(xì)胞較野生型小鼠顯著減少，但凋亡細(xì)胞數(shù)量無顯著差異，提示RIP3依賴性壞死即程序性壞死與動(dòng)脈粥樣硬化晚期的發(fā)展密切相關(guān)[25]。Liu等[26]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠心肌梗死后RIP1和RIP3 mRNA顯著增加，而低劑量和高劑量組RIP1和RIP3 mRNA水平顯著下降，高劑量組更為顯著。進(jìn)一步試驗(yàn)證明，梗死區(qū)內(nèi)纖維組織的反應(yīng)性增生明顯，但實(shí)驗(yàn)組的梗死面積明顯小于對照組。由此得出，Nec-1可明顯抑制心肌缺血大鼠的心肌壞死，具有心肌保護(hù)作用[27]。受體相互作用蛋白3（RIP3）觸發(fā)心肌壞死，除了炎癥和細(xì)胞凋亡，是通過激活Ca2+-鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶（CaMKII）而不是通過RIP1、RIP3和 MLKL。RIP3誘導(dǎo)激活CaMKII，通過磷酸化或氧化或兩者引起線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放和心肌壞死[28]。

3.2 RIP1和RIP3與心肌再灌注損傷在轉(zhuǎn)基因小鼠心臟中發(fā)現(xiàn)，RIP1/RIP3/MLKL信號通路及炎癥反應(yīng)被抑制，而此通路在pre-miR-223轉(zhuǎn)基因的小鼠心臟缺血再灌注中被激活[29]。Nec-1抑制該通路用于治療pre-miR-223轉(zhuǎn)基因小鼠因缺血再灌注引起的心肌組織損傷，顯著降低缺血再灌注觸發(fā)的心肌壞死和功能障礙?？偟膩碚f，目前最主要的necroptosis是由TNF-α/TNFR1誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)復(fù)合體RIP1/3，此外還有CypD、NLRP3、RIP3及其RIP1、MLKL和CaMKII[28]。且確定了兩個(gè)關(guān)鍵的細(xì)胞死亡受體TNFR1和DR6，其均為mir-223-5p直接目標(biāo)，而mir-223-3p直接抑制NLRP3和IkappaB激酶α兩個(gè)重要的媒介的表達(dá)，參與I/R誘導(dǎo)的炎癥和細(xì)胞壞死。

3.3 RIP1和RIP3與病毒性心肌炎病毒感染對心肌組織的持續(xù)損害可能是病毒性心肌炎重要致病原因和機(jī)制，其主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞變性壞死、心肌纖維間和血管周圍結(jié)締組織中的炎性細(xì)胞浸潤及間質(zhì)纖維化引起的心肌重構(gòu)等，最終導(dǎo)致左室擴(kuò)張和心功能障礙。在柯薩奇病毒B3（CVB3）誘導(dǎo)的急性病毒性心肌炎中對心臟標(biāo)本RIP1和RIP3壞死體進(jìn)行檢測，并在光鏡及電鏡下觀察Nec-1對小鼠心肌損傷的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)Nec-1組較CVB3組明顯降低了RIP1和RIP3的陽性著色，Nec-1組小鼠心肌組織病變程度明顯改善[30]。

4 總結(jié)和展望

RIP1和RIP3通過不同的作用機(jī)制，作用于各種疾病的發(fā)生和發(fā)展中。程序性壞死在炎癥驅(qū)動(dòng)和疾病病理學(xué)的基礎(chǔ)上，逐漸被證實(shí)是治療動(dòng)脈粥樣硬化、全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）和缺血性損傷等疾病的治療靶點(diǎn)。除上述作用機(jī)制外，尚有研究表明，NADPH氧化酶4（NOX4）和NOX4相關(guān)的氧化還原信號與心臟肥大有關(guān)。由此推測，通過RIP1和RIP3抑制劑可能延緩心肌纖維化進(jìn)展，這可能是心肌纖維化治療中的有益發(fā)現(xiàn)。