杜 俊，胡 靖，黃走方 (中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院血液學研究所血液病醫(yī)院,天津300020)

0 引言

2010年,一位名叫Emily的美國小女孩,患有急性淋巴細胞白血病(acute lymphoid leukemia,ALL),經(jīng)過2療程化療后疾病仍在治療3月后復發(fā)。鑒于相關毒副反應,Emily的父母拒絕了醫(yī)師建議的骨髓移植治療。Emily又經(jīng)歷了1療程加強化療,仍未獲得緩解。她父母自愿參加了Pennsylvania大學的一項CART-19的臨床研究。幸運的是,CART-19的治療使她的疾病獲得完全緩解,該患者健存至今。但值得一提的是,Emily經(jīng)歷了78%使用CART-19治療的患者皆會面臨的細胞因子釋放綜合征(cytokine releases syndrome,CRS),并伴有白介素-6(interleukin-6,IL-6)的爆發(fā)性增高,但經(jīng)過托珠單抗(tocilizumab)特異性治療,她奇跡般獲得治愈。諾華公司立即投入119 億美元開展進一步研究［1－2］。

嵌合抗原受體T細胞(chimeric antigen receptor T cells,CAR-T)是一種新型細胞免疫治療方法,其通過基因編輯技術,將針對特定靶點的嵌合抗原受體以及共刺激分子引入T細胞之中,從而在非主要組織相容性抗體(major histocompatibility complex,MHC)依賴的條件下結(jié)合表達靶抗原的腫瘤細胞,通過共刺激分子激活T細胞進行殺傷。CAR-T細胞能夠靶向識別惡性腫瘤細胞抗原,將能夠識別該抗原的結(jié)構(gòu)通過基因工程技術的手段使其在患者T細胞的表面,進而特異性地識別惡性腫瘤細胞,最終將其殺滅。

CAR由融合基因表達,該融合基因編碼單克隆抗體的單鏈可變片段(scFv)作為靶向結(jié)構(gòu)域,通過間隔區(qū)和跨膜序列與信號傳導模塊連接。常通過逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒轉(zhuǎn)導將CAR轉(zhuǎn)基因隨機引入細胞基因組中,并從構(gòu)建體中的病毒或哺乳動物啟動子轉(zhuǎn)錄。在臨床前研究中已經(jīng)實現(xiàn)CAR靶向整合到內(nèi)源啟動子元件控制下的明確基因組位點,并且可以提供更均質(zhì)的CAR表達以提高治療效果。通常,非特異性的T細胞在用促有絲分裂抗體激活后被轉(zhuǎn)導,并且在再輸注之前在IL-2中單獨或與其他g鏈細胞因子短暫擴增。因為T細胞由CD4和CD8亞群組成,每個亞群又細分為純真T(TN)、中樞和效應記憶(TCM/TEM)、組織駐留記憶和效應細胞亞群,這導致CAR細胞產(chǎn)品具有極大的異質(zhì)性。通過基因編輯技術開發(fā)的CAR-T細胞產(chǎn)品可跨越MHC屏障,但也常因殘存的TCR+細胞發(fā)生移植物抗宿主病(graftversus-host disease,GVHD),頗為棘手［3］。

CAR-T細胞治療本身即是個體化治療血液腫瘤的體現(xiàn),在分子生物學發(fā)展日新月異的今天,深入研發(fā)CAR-T技術是精準治療血液病的重要探索方向。

1 治療疾病領域

1.1 復發(fā)難治B細胞淋巴瘤/白血病

1.1.1 復發(fā)難治B細胞淋巴瘤 Neelapu等［4］開展的ZUMA-1臨床試驗及Schuster的小規(guī)模試驗均顯示出CD19 CAR-T顯著的有效性。Neelapu納入的101例復發(fā)難治B細胞淋巴瘤,其中54%獲得完全緩解；而在Schuster等［5］的試驗中,28例患者中57%病情完全緩解。CAR-T療法在B細胞淋巴瘤中的療效好,但其療效持續(xù)時間有待進一步觀察。

1.1.2 中樞神經(jīng)系統(tǒng)彌漫大B細胞淋巴瘤（central nervous system-diffuse large B cell lymphoma，CNS-DLBCL） Abramson 等［6］報道了 CD19 CAR-T 治療CNS-DLBCL的有效性。該患者為68歲女性,診斷為DLBCL(GC型 伴有BCL-2基因重排及MYC、BCL-6復制),經(jīng)過5個療程DA-EPOCH-R方案化療,并接受了全相合的無關供者異基因造血干細胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT),仍未治愈。CD19 CAR-T的治療使該患者獲得完全緩解,取得顯著療效。研究人員進一步在患者腦脊液中檢驗出CD19 CAR-T細胞的存在,也證明CAR-T細胞可通過血腦屏障發(fā)揮其治療作用。

1.1.3 復發(fā)難治B細胞急性淋巴細胞白血病（B-ALL）Memorial Sloan Kettering癌癥中心的一項隨訪研究［7］顯示：CART-19在復發(fā)難治B-ALL中療效明顯。該隊列研究納入53名受試者,均為復發(fā)難治B-ALL患者。在這組患者中,完全緩解率為83%,中位生存時間為12.9月。分層研究顯示,治療前疾病負擔是生存時間及緩解率的有效預測因子。腫瘤負荷低的患者,其無事件生存率(event free survival,EFS)及總生存率(overall survival,OS)均顯著高于腫瘤負荷高的患者。

有研究［8］將CART-19療法應用于30例復發(fā)/難治B-ALL患者,27例(90%)獲完全緩解。隨訪6月,其EFS為67%,OS為78%。隨訪24月,仍有19例患者處于疾病緩解狀態(tài)。但即使CART-19療法存在頗高的近期臨床緩解率,若無法及時橋接造血干細胞移植,其長期緩解率仍不如人意。

國內(nèi)燕達陸道培醫(yī)院亦有相應嘗試。該中心納入52例B-ALL患者,其中42例為復發(fā)/難治患者,經(jīng)輸注劑量為1×105cells/kg的CART-19治療后,36例(90%)獲得完全緩解。中位隨訪230天發(fā)現(xiàn),82.5%的患者橋接造血干細胞移植未出現(xiàn)疾病復發(fā)。根據(jù)該中心經(jīng)驗,減低劑量的CAR-T治療可能縮減了CRS的發(fā)生率,同時減少了造血干細胞移植后復發(fā)率［9］。

1.2 難治性慢性淋巴細胞白血?。╟hronic lymphocytic leukemia， CLL）Porter等［10］將 CAR-T 技術用于治療難治性CLL。該患者為男性,1996年診斷CLLⅠ期,疾病觀察6年后患者因淋巴細胞增多及淋巴結(jié)腫大接受2療程利妥昔單抗+氟達拉濱治療,獲得疾病完全緩解。2006年患者因疾病進展再次使用4療程利妥昔單抗+氟達拉濱治療,同樣獲得完全緩解。2009年,患者疾病迅速進展,淋巴細胞增多及淋巴結(jié)增大明顯,分子生物學檢測發(fā)現(xiàn)TP53基因突變、17p染色體缺失,預后不良。患者再次接受1療程利妥昔單抗+苯達莫司汀,以及3療程苯達莫司汀治療,疾病未緩解。Porter使用 CD19聯(lián)合 CD137 CAR-T細胞治療,采用1.5×105/m2的低劑量輸注,而在體內(nèi)擴增達1000倍,疾病終獲完全緩解,隨訪10月未發(fā)現(xiàn)疾病復發(fā)進展跡象。同樣納入該試驗的另2例患者,亦獲得疾病完全緩解。CAR-T細胞治療在CLL領域不失為有益的嘗試。

1.3 多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）雖然CD19并非常規(guī)表達于漿細胞表面,但CD19 CART細胞療法治療MM頗具前景。Garfall等［11］報道的10例患者中,有2例在使用CTL019后,疾病緩解,無進展生存期(progression free survival,PFS)延長。另外,Ramos等［12］將 κ.CAR-T 治療 MM,4/7獲得疾病緩解,病情穩(wěn)定,該反應甚至優(yōu)于NHL及CLL。雖然CD138高表達于漿細胞表面,初步試驗卻顯示CD138 CAR-T療效不佳。 Guo等［13］將 CD138 CAR-T用于治療5例MM患者,也僅有3例病情穩(wěn)定(stable disease,SD),表明目前的CD138 CAR-T治療MM尚無滿意療效。B細胞成熟抗原(B cell maturation antigen,BCMA)CAR-T治療MM是新的嘗試,Ali等［14］報道9例使用BCMA-CART的患者,1例獲得sCR(嚴格意義上的完全緩解),2例獲得VGPR(非常好的部分緩解),相關臨床試驗正進一步開展。嘗試新靶點的CAR-T細胞療法正成為治療MM的新手段,療效突出。而CAR-T聯(lián)合傳統(tǒng)化療、免疫化療或造血干細胞移植,有望使MM患者獲得更好的臨床緩解,甚至治愈。

1.4 T細胞淋巴瘤將CAR-T技術用于T細胞淋巴瘤技術難度頗大,因為治療靶向的抗原也常表達于正常T細胞表面。通過CRISPR/Cas9基因編輯技術靶向CD7的CAR-T技術嘗試用于T細胞淋巴瘤,在臨床前期研究中顯示有效,可發(fā)揮抗腫瘤效應［15］。Maciocia等［16］進一步研發(fā)出可特異性結(jié)合TCRBC1的scFv,這使得CAR-T技術可靶向T細胞亞群而非整個T細胞結(jié)構(gòu)域,這將帶來T細胞淋巴瘤治療的新突破。

1.5 急性髓系白血?。╝cute myelogenous leukemia，AML）AML較ALL更為常見,且年齡大于60歲的患者對化療反應差。CAR-T技術治療ALL的顯著療效,啟示臨床醫(yī)師將該技術應用于AML。目前,Lewis Y抗原(LeY)、CD33、CD123及CLL1均作為CAR-T治療AML的靶點用于臨床試驗,但遺憾的是,這些抗原亦表達于正常造血前體細胞,且AML的免疫表型異質(zhì)性限制了這些靶點的功效［17］。靶向LeY的CAR-T治療收效甚微,而靶向CD123的臨床試驗正在開展。整合scFvs的CAR-T靶向HLA-A2/WT1正處于研發(fā)狀態(tài)［18］。但CAR-T技術治療AML的靶點應共表達于AML的表面分子,否則臨床有效性將受到限制。

2 主要不良事件

2.1 CRSCRS是CAR-T體內(nèi)激活和殺傷腫瘤細胞過程中釋放大量炎癥因子導致一系列臨床表現(xiàn)的綜合征。CRS的發(fā)生頗為常見,臨床癥狀常包括發(fā)熱、低氧血癥、低血壓。在ZUMA-1試驗中,CRS發(fā)生率為 93%；而在 Schuster的試驗中,其發(fā)生率為57%［5］。由于CAR-T對不同腫瘤作用靶點的差異,CRS的出現(xiàn)時間和強度均有所不同,臨床預測模型及治療手段均為基于大型醫(yī)療中心的經(jīng)驗,相關指南和規(guī)范仍在研究中。

2.2 神經(jīng)系統(tǒng)毒副反應神經(jīng)系統(tǒng)毒副反應常見為腦病、昏迷及震顫。ZUMA-1試驗中,其發(fā)生率為64%；而在Schuster的試驗中,其發(fā)生率為39%［5］。T細胞的直接毒性或釋放的細胞因子可能為其發(fā)病機制。遺憾的是,目前尚未找到合適的神經(jīng)系統(tǒng)毒副反應預測因子。Abramson等將CART-19治療中樞DLBCL,發(fā)現(xiàn)CART-19細胞可穿透血腦屏障［6］。因此,CART-19 T細胞可能直接損害顱內(nèi)臟器,有待進一步研究［3－4］。

2.3 感染風險驟然增加Budde等［19］觀察到,在CAR-T細胞輸注的前28天內(nèi),患者感染的發(fā)生率高達21%。結(jié)合Hay等的研究,Budde等總結(jié)其發(fā)生機制為循環(huán)血液中血管生成素-2和VWF因子造成內(nèi)皮細胞損傷,使得病原微生物更易侵襲人體。在免疫調(diào)節(jié)功能紊亂的惡性血液病患者中,該侵襲功能進一步增強,從而使得CAR-T療法治療的患者感染率上升。因此,治療前充分評估患者感染風險是十分必要的。相關研究數(shù)據(jù)仍然偏少,尚需進一步總結(jié)經(jīng)驗。

2.4 治療相關死亡率ZUMA-1試驗中,治療相關死亡率為3.0%；而在Schuster的臨床試驗中,治療相關死亡率為3.6%。該死亡率并不低,但考慮到難治性B-ALL疾病本身的死亡率,亦在接受范圍。但減低劑量及支持治療,包括毒副反應的控制仍至關重要［5］。

2.5 脫靶效應CAR-T細胞并非總能與腫瘤抗原特異性結(jié)合,當其與正常細胞組織表達的腫瘤相關抗原結(jié)合后,可對正常組織產(chǎn)生毒性反應,謂之脫靶效應。預防脫靶效應,可采取如下方法：①降低單次CAR-T細胞治療量；②應用抗體封閉正常組織上的腫瘤相關抗原；③構(gòu)建自凋亡基因系統(tǒng)。

Ruella等［20］近期報道1例因脫靶效應致嚴重不良事件的案例。研究者在給一名復發(fā)/難治性B-ALL的患者制備CAR-T細胞時,因為脫靶,CAR意外地被加到患者癌變的B細胞上,形成了“CAR-癌細胞”。更意外的是,加到癌細胞上的CAR與癌細胞表面的CD19結(jié)合,使CAR-T細胞失去了識別癌細胞的靶標。該患者在接受CAR-T治療的261天之后,由于“CAR-癌細胞”大量增殖,癌癥復發(fā),最終死于白血病相關并發(fā)癥。

3 討論與結(jié)語

盡管CAR-T療法有著較高的治療有效性,但半數(shù)患者無法獲得長期緩解,疾病復發(fā)率高,這也使其臨床應用受限。研究人員亦采用不同靶點或多靶點聯(lián)合的CAR-T療法,如CD22等,可避免腫瘤逃逸,增強CART療法的有效性。通過CRISPR-Cas9基因編輯技術,在動物模型中CAR-T的抗腫瘤效應得以增強［21］。聯(lián)合作用于不同信號通路的藥物臨床研究也在開展,并顯示BTK抑制劑及PD-1抑制劑可能增強CAR-T療法的治療作用。但這些藥物的潛在不良反應尚未完全揭曉,多靶點聯(lián)合用藥有可能進一步增加不良反應事件發(fā)生率［22］。

第一代CAR-T細胞治療局限于單一T細胞靶向效應,植入率較低,故而臨床治療有效率偏低。而第二代(甚至三、四代)CAR-T細胞治療則部分克服了這種缺陷,因其為多靶點聯(lián)合治療,其中CD28及CD4-1BB常為共刺激域,這對CAR-T細胞的存活與增殖 是 有 益 的［23－25］。 聯(lián) 合 雙 靶 點 CD19/CD20、CD19/CD123、CD19/CD22的CAR-T技術正在研發(fā),臨床試驗初見成效［26－28］。

上述特異性的CAR-T細胞產(chǎn)品制備價格昂貴,工序復雜,探索“通用型”CAR-T細胞技術也是具有潛力的研究方向。如果有更佳的手段克服MHC屏障,那么“通用型”T細胞可能較自體T細胞發(fā)揮更好的療效。源自健康供體的通用型CAR-T細胞具有克服與腫瘤治療相關的免疫缺陷的潛力。此外,通用CAR-T細胞產(chǎn)品可簡化工程細胞制造程序,甚至允許規(guī)?；a(chǎn)。與患者自體特異性T細胞相比,或可取得快速及高性價比的療效。然而,目前CAR-T細胞是否能單用發(fā)揮療效,結(jié)論尚未知。迄今為止,CAR-T療法常橋接造血干細胞移植治療。是否將CAR-T療法作為血液腫瘤常規(guī)治療整體策略的組成部分,需更多臨床數(shù)據(jù)證實。

CAR-T細胞療法作為新興治療手段,前景雖好,但仍處于探索階段。在倫理及法律程序上,亟待完善CAR-T細胞治療相關流程。其適用范圍、回輸時機、治療劑量、毒副反應及處理存在爭議,不宜作為一線治療,更不應盲目推廣。當化療、抗體治療或者造血干細胞移植后療效不佳的患者,可考慮CAR-T細胞治療。另外,將CAR-T療法用于治療實體腫瘤也有潛在的研究價值,這方面的探索正處于重大發(fā)現(xiàn)期［29］。