楊文艷 ，賀桂芳 ，卞美璐

（1.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部，北京 100191；2.中日友好醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京 100029）

宮頸癌是婦科常見惡性腫瘤，在宮頸癌細(xì)胞也觀察到了p97蛋白陽性表達(dá)升高。隨著近年來對其深入研究，p97蛋白成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)，研究表明，含纈氨酸蛋白p97與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)，p97蛋白參與眾多生理病理過程，主要通過清除細(xì)胞內(nèi)的異常蛋白質(zhì)，控制蛋白質(zhì)質(zhì)量，維持正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞存活[1，2]。p97抑制劑在治療婦科惡性腫瘤方面有其獨(dú)特的應(yīng)用。本文就p97蛋白與宮頸癌的相關(guān)性研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為宮頸癌的預(yù)防和治療提供更多參考。

1 含纈氨酸蛋白p97的概述

1.1 p97蛋白結(jié)構(gòu)

1982年，Moir等人首次描述了p97蛋白的酵母變異株，并認(rèn)為其失活后導(dǎo)致細(xì)胞周期停止在G2-M期，在哺乳動物體內(nèi)存在同源蛋白，因其分子量為97kDA，命名為p97蛋白或含纈氨酸蛋白[1]。隨后，在秀麗隱桿線蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)p97同源基因CDC-48.1和CDC-48.2，而在人類、鼠類和酵母等生物體內(nèi)則是單個基因，在人體內(nèi)，編碼p97蛋白的基因位于染色體9p13-p12，有報(bào)道前體B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)節(jié)p97基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子[2]。

p97蛋白是一種同質(zhì)六聚體，每個單體有1個N域和2個ATP酶域：D1域和D2域。低溫電子顯微鏡下觀察到，當(dāng)D1域與ATP結(jié)合時，N域向上旋轉(zhuǎn)形成 “上方構(gòu)象”，有利于N域與輔助因子結(jié)合，如與Ufd1/Npl4復(fù)合體形成泛素鏈底物結(jié)合位點(diǎn)，暴露的D2酶域增強(qiáng)ATP酶活性，ATP酶水解促使底物通過蛋白中心孔[3]。

1.2 p97蛋白功能

p97蛋白屬于ATP酶家族，它廣泛存在于人體各種細(xì)胞內(nèi)，具有控制蛋白質(zhì)質(zhì)量、調(diào)控基因表達(dá)、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性、介導(dǎo)膜融合、參與細(xì)胞周期控制等多種功能。p97蛋白的功能依賴于結(jié)合不同的蛋白質(zhì)輔助因子，例如，p97結(jié)合Npl4/Ufd1調(diào)節(jié)泛素蛋白酶系統(tǒng)，p97蛋白結(jié)合UBXD1主要影響溶酶體功能，p97結(jié)合p37主要發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體上[4]。

p97蛋白介導(dǎo)降解異常蛋白控制細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量：（1）p97介導(dǎo)胞內(nèi)錯誤折疊蛋白質(zhì)泛素化，并協(xié)助其通過脂質(zhì)雙分子層，由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)到蛋白酶體，完成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的蛋白降解；（2）有缺陷的mRNA翻譯產(chǎn)生異常多肽，底物泛素化，泛素化底物與p97蛋白結(jié)合，提取異常多肽至溶酶體降解；（3）p97結(jié)合線粒體外膜異常多肽，促進(jìn)線粒體相關(guān)的降解，維持線粒體內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)；（4）p97參與細(xì)胞自噬，當(dāng)線粒體受損時，p97與Ufd1/Npl4被招募到線粒體表面，通過細(xì)胞自我吞噬清除線粒體，具體機(jī)制可能與蛋白 Vmsl、Ufd3 有關(guān)[1]。

另外，p97調(diào)控基因表達(dá)，p97通過泛素蛋白酶系統(tǒng)降解小抑制蛋白質(zhì)IκB，提高NFκB活性。p97能夠從染色質(zhì)中提取不同的泛素化蛋白，協(xié)助復(fù)制，p97與Ufd1結(jié)合將Ku環(huán)從DNA鏈上移除，還與泛素連接酶RNF138協(xié)同誘導(dǎo)無錯同源重組，控制修復(fù)的精準(zhǔn)度[6]。

2 p97蛋白與宮頸癌

2.1 p97蛋白與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展

研究發(fā)現(xiàn)正常宮頸組織、CIN2/CIN3、宮頸癌組織中p97蛋白含量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，在絕大多數(shù)正常組織中低表達(dá)，在CIN2/CIN3及宮頸癌中高表達(dá)，進(jìn)一步采用免疫組化方法證實(shí)，p97蛋白在宮頸癌的陽性表達(dá)明顯高于正常組織[7]，這表明p97蛋白的表達(dá)升高可能與宮頸癌的發(fā)生有關(guān)。

有報(bào)道采用可逆性p97蛋白抑制劑N2，N4-二苯基喹唑啉-2，4-二胺（DBeQ）作用于宮頸癌細(xì)胞（HeLa），細(xì)胞中p97蛋白耗盡時，細(xì)胞核和膜豐富的區(qū)域聚集大量轉(zhuǎn)錄因子，腫瘤細(xì)胞凋亡[2]。在正常組織細(xì)胞內(nèi)，p97蛋白介導(dǎo)泛素蛋白酶系統(tǒng)及時清除異常蛋白，控制細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量，在癌細(xì)胞內(nèi)，由于細(xì)胞周期加快，蛋白質(zhì)的合成速度也非?？?，產(chǎn)生的“殘次品”也越多，癌細(xì)胞的生長和存活更加依賴p97蛋白來進(jìn)行蛋白質(zhì)的“質(zhì)量控制”，抑制p97蛋白誘發(fā)腫瘤細(xì)胞內(nèi)異常蛋白堆積，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡，提示p97蛋白對宮頸癌細(xì)胞生存有著重要作用。

2.2 p97蛋白與宮頸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移

關(guān)于p97蛋白在惡性腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移過程中的分子機(jī)制研究，有報(bào)道使用siRNA干擾p97蛋白表達(dá)或者應(yīng)用p97蛋白抑制劑EeyarestatinI（EerI）能促使細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型（epithelial-mesenchymal transition，EMT）樣改變[9]。EMT是指上皮細(xì)胞丟失表面標(biāo)記物獲得間葉細(xì)胞表面標(biāo)記物，是腫瘤發(fā)生侵襲的重要機(jī)制。細(xì)胞內(nèi)異常蛋白質(zhì)不及時清除導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可通過多種通路促使EMT，例如，在肺泡上皮細(xì)胞中的MAPK、Smad及β-連環(huán)蛋白。

p97蛋白調(diào)節(jié)NFκB活性參與細(xì)胞增殖、抗凋亡過程，NFκB正性調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-6、IL-8、VEGF，影響腫瘤血管生成，NFκB還可活化MMP9和尿激酶樣纖溶酶原激活劑，后兩者與腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

研究報(bào)道，p97蛋白與多種惡性腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)。國外報(bào)道170例肝癌組織中，p97蛋白高表達(dá)的肝癌患者具有較高的門靜脈侵犯潛能（P＜0.01），國內(nèi)13例肝細(xì)胞癌肉眼癌栓和鏡下肝細(xì)胞癌栓的病例中12例（92.3%）p97陽性表達(dá)。非小細(xì)胞肺癌浸潤轉(zhuǎn)移組中p97蛋白的陽性表達(dá)率為90%（18/20）、非轉(zhuǎn)移組52%（21/40），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002）[10～12]。14 例發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的骨肉瘤組織中p97蛋白高表達(dá)11例 （78.6%），46例無轉(zhuǎn)移的骨肉瘤組織中p97高表達(dá)15例（32.6%），二者統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著（P=0.01）[13]。檢測421例乳腺癌腫瘤組織中和正常乳腺組織p97蛋白含量，發(fā)現(xiàn)兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），隨訪結(jié)果顯示p97蛋白高表達(dá)導(dǎo)致乳腺癌患者低生存率[14]。p97蛋白低水平表達(dá)的前列腺癌患者5年生存率明顯高于p97蛋白高水平表達(dá)者，并且p97蛋白水平與血清PSA水平呈正相關(guān)，血清PSA是目前預(yù)測前列腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的主要指標(biāo)，PSA＞20ng/ml在p97蛋白低表達(dá)者占25.8%，在p97蛋白高表達(dá)者占67.7%[15]。目前，尚無p97蛋白與宮頸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的報(bào)道，其與宮頸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性有待進(jìn)一步研究。

2.3 p97蛋白與人乳頭瘤病毒（HPV）感染

高危型HPV持續(xù)感染并整合到宿主細(xì)胞染色體上是宮頸癌發(fā)生的關(guān)鍵，當(dāng)病毒入侵時，宿主細(xì)胞通過啟動凋亡程序抑制病毒增殖。HPV E6蛋白與泛素連接酶結(jié)合，誘導(dǎo)p53泛素化并被溶酶體降解，抑制細(xì)胞凋亡；HPV E7蛋白與Rb結(jié)合，促進(jìn)宿主細(xì)胞進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂。有研究報(bào)道[16]，p97啟動子與HPV的轉(zhuǎn)化有關(guān)，在宮頸癌細(xì)胞中，p97啟動子上調(diào)HPV16 E6/E7 mRNA和蛋白的表達(dá)，并且p97通過E6-E6 APPTPN3通路調(diào)控HPV E6基因表達(dá)。

有學(xué)者采用RT-qPCR技術(shù)[17]，研究23例CIN2和CIN3、16例子宮頸鱗癌標(biāo)本p97與p14轉(zhuǎn)錄差異，證實(shí)在宮頸癌和高級別上皮內(nèi)瘤變組織中，P14轉(zhuǎn)錄明顯低于p97轉(zhuǎn)錄，但兩者在上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌組織中的表達(dá)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示p97啟動子控制大部分HPV病毒早期基因的轉(zhuǎn)錄。另一項(xiàng)研究利用免疫組化的方法，分析p97蛋白在口咽鱗癌組織中表達(dá)差異性，發(fā)現(xiàn)p97蛋白高表達(dá)的HPV陰性患者的5年生存率明顯高于p97蛋白低表達(dá)者，而HPV陽性患者5年生存率與p97蛋白表達(dá)不相關(guān)。進(jìn)一步采用qPCR分析15例HPV陰性口咽癌細(xì)胞，具有9p13-p12區(qū)域的細(xì)胞p97表達(dá)明顯高于缺失此區(qū)域的細(xì)胞，而HPV陽性口咽癌患者中，9號染色體的缺失與較好的預(yù)后相關(guān)，在HPV陰性患者中9號染色體的缺失預(yù)后更差[18]，而p97基因位于9號染色體上。提示9p13-p12區(qū)域的丟失、p97 mRNA轉(zhuǎn)錄減少、蛋白表達(dá)降低和HPV陰性口咽癌不良預(yù)后有直接相關(guān)性。

3 p97蛋白抑制劑與惡性腫瘤治療

3.1 p97蛋白抑制劑的研究

p97蛋白參與多種病理生理過程，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后相關(guān)[19]，p97蛋白抑制劑作為抗腫瘤藥物具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。人工合成p97蛋白抑制劑EerI，它主要針對p97蛋白D1域ATP水解功能，但不具有特異性。研究證實(shí)EerI主要通過聚集多泛素化蛋白、抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的蛋白降解、誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等途徑抑制p97蛋白功能，在體外，EerI有明顯的腫瘤殺傷活性，它能增強(qiáng)蛋白酶體抑制劑Bortezomib的殺傷宮頸癌細(xì)胞作用[20]，這提示我們p97蛋白有望成為新的抗腫瘤靶點(diǎn)。

近年來，對p97蛋白抑制劑的研究更加深入，DBeQ是一種可逆性抑制p97蛋白化學(xué)制劑，它特異性作用于p97蛋白D2域，具有較高的殺傷宮頸癌細(xì)胞活性[8]。其中最有名的可逆性p97蛋白抑制劑是CB-5083，它選擇性作用于D2域，競爭性抑制ATP酶活性，具有良好的口服生物利用率。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，無論是實(shí)體細(xì)胞腫瘤還是血液系統(tǒng)腫瘤，在異種腫瘤移植的小鼠體內(nèi)，CB-5083能持續(xù)發(fā)揮抗腫瘤活性，目前，CB-5083的研究已經(jīng)進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn)階段[21]。

然而，上述人工合成的p97蛋白抑制劑作為抗腫瘤藥物進(jìn)入臨床帶來了新的問題：腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抗藥。學(xué)者探討腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抗CB-5083的分子機(jī)制[22]，采用卵巢癌細(xì)胞接受較高濃度CB-5083處理方法，獲得抗藥性比母系高5～6倍的卵巢癌細(xì)胞，分析p97編碼序列的基因組和互補(bǔ)DNA序列發(fā)現(xiàn)：（1）密碼子470的錯義突變導(dǎo)致p97蛋白ATP酶活性增強(qiáng)；（2）密碼子606或密碼子616的無義突變或者移碼突變導(dǎo)致特異等位基因沉默。這些與卵巢癌細(xì)胞抵抗p97蛋白抑制劑有關(guān)的突變可能有利于臨床試驗(yàn)中尋找潛在的輔助標(biāo)記物，針對p97突變點(diǎn)的靶向治療有助于提高p97抑制劑抗腫瘤效果，p97蛋白抑制劑有望成為抗腫瘤治療方案之一。

研究發(fā)現(xiàn)，長期持續(xù)服用戒酒藥雙硫侖的乳腺癌患者，相比于沒有使用雙硫侖的患者，死亡率降低了34%[23]。臨床隨機(jī)對照研究發(fā)現(xiàn)，加用雙硫侖藥物治療晚期非小細(xì)胞肺癌相比單純化療，患者生存時間延長10～7.1個月[24]。最近，Nature雜志首次揭示了雙硫侖代謝產(chǎn)物二硫代氨基甲酸酯-銅復(fù)合體（diethyldithiocarbamate-copper complex，CuET）是發(fā)揮抗腫瘤作用的主要物質(zhì)，CuET主要作用于p97-NPL4介導(dǎo)的泛素蛋白酶體降解途徑，抑制p97蛋白功能，使癌細(xì)胞內(nèi)積累大量的殘次蛋白，誘發(fā)熱休克反應(yīng)，最終導(dǎo)致癌細(xì)胞的凋亡[25]。p97蛋白成為抗腫瘤研究的熱點(diǎn)。

3.2 p97蛋白抑制劑在宮頸癌治療中的應(yīng)用

目前，宮頸癌的治療主要是手術(shù)治療和放射治療，手術(shù)治療僅適用于Ⅰa～Ⅱa期患者，其效果受患者臨床分期、年齡、全身情況、設(shè)備條件及醫(yī)療技術(shù)水平影響，手術(shù)屬于有創(chuàng)操作，術(shù)中術(shù)后并發(fā)癥多，如臟器損傷、出血、輸尿管瘺、膀胱陰道瘺、淋巴囊腫及術(shù)后感染等，嚴(yán)重影響患者婚姻質(zhì)量和生命質(zhì)量。放療是治療婦科惡性腫瘤的常用手段之一，當(dāng)手術(shù)切除范圍不夠、手術(shù)有可疑局部殘存且該腫瘤具有放療敏感性時，可行術(shù)后輔助性放療，放療的不良反應(yīng)多，包括骨髓抑制、納差、腹瀉、泌尿系不適等，降低患者生命質(zhì)量，影響患者依從性?；陔p硫侖具有抗腫瘤作用的研究，有學(xué)者研制含有雙硫侖藥物的陰道環(huán)劑治療宮頸癌[26]，采用乙烯-醋酸乙烯酯共聚物材料，雙硫侖穩(wěn)定性良好，并且能可控性地釋放使其維持在宮頸癌HeLa細(xì)胞半抑制率以上的濃度進(jìn)一步。也有學(xué)者研制雙硫侖陰道片，雙腔陰道片在體外釋放持續(xù)釋放雙硫侖，Elvax 40陰道制劑超過14天仍每天釋放15.4μM雙硫侖，使其濃度達(dá)宮頸癌細(xì)胞半抑制率的2500至3500倍[27]。提示p97蛋白抑制劑可能為宮頸癌的治療提供新的途徑。

4 展望

p97蛋白是細(xì)胞眾多病理生理過程中重要的調(diào)控分子，與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、預(yù)后密切相關(guān)，目前對p97蛋白作用機(jī)制的研究取得了很大進(jìn)展，但其對宮頸癌病情發(fā)展、預(yù)后評估的作用機(jī)制尚不清晰，仍需進(jìn)一步研究。對p97蛋白的清除細(xì)胞內(nèi)異常蛋白控制細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量及細(xì)胞凋亡作用、參與HPV早期感染的深入研究，有助于推動p97蛋白抗宮頸癌靶點(diǎn)作用機(jī)制的研究，在基因靶向治療宮頸癌方面具有良好前景。