郭 楠,韓 雪，陸成偉,劉秀芬,郝繼龍

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院 眼科中心，吉林 長(zhǎng)春130021)

真菌性角膜炎是一種嚴(yán)重?fù)p害視力的眼科疾病，常在角膜外傷、角膜手術(shù)后、慢性眼表疾病、皮質(zhì)類固醇激素局部應(yīng)用、或佩戴隱形眼鏡等條件下發(fā)生，其感染源可為絲狀真菌或酵母菌等。臨床表現(xiàn)為角膜邊緣羽狀浸潤(rùn)，伴或不伴表面隆起，角膜上皮可完整但存在深基質(zhì)浸潤(rùn)、衛(wèi)星灶、內(nèi)皮斑等，抗生素治療無(wú)效或皮質(zhì)類固醇激素治療后病情惡化等均可提示真菌性角膜炎。包括角膜病灶樣本涂片鏡檢及培養(yǎng)在內(nèi)的微生物學(xué)診斷方法仍是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，近年來發(fā)展迅猛的分子診斷學(xué)方法也逐漸地應(yīng)用于真菌性角膜炎的診斷，為早期診斷及治療爭(zhēng)取了寶貴的時(shí)機(jī)。

目前已知的可致真菌性角膜炎的病原菌有56個(gè)菌屬，105種真菌[1]。由于早期真菌性角膜炎患者有徹底治愈的可能，因此對(duì)于疑似真菌性角膜炎患者，臨床工作者應(yīng)盡早明確診斷[2]。除結(jié)合臨床特征性表現(xiàn)外，包括涂片鏡檢、培養(yǎng)基培養(yǎng)等傳統(tǒng)微生物鑒定方法仍為真菌性角膜炎診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。近年來，分子生物學(xué)診斷方法發(fā)展迅速，為真菌性角膜炎的診斷提供了新的方向，也使早期診斷、早期治療得以實(shí)現(xiàn)。以下將傳統(tǒng)及新興診斷手段均做簡(jiǎn)要闡述。

1 傳統(tǒng)檢查手段

1.1 角膜組織涂片檢查

角膜組織涂片檢查可通過觀察鏡下真菌菌絲或孢子形態(tài)特征來初步診斷真菌性角膜炎。常用染色方法包括10%KOH濕片法、革蘭染色法及姬姆薩染色法等[3]。KOH濕片法快速而廉價(jià)，是涂片檢查最常用的方法之一，它用于檢測(cè)真菌的靈敏度為61-94%，特異性為99.7%。此外，革蘭染色的敏感性在36-50%之間。乳酸酚棉蘭染色敏感性為85%，特異性為90%[4]。角膜組織涂片檢查簡(jiǎn)便、快速、廉價(jià)，對(duì)于真菌性角膜炎高發(fā)、檢查技術(shù)及設(shè)備相對(duì)落后的國(guó)家及地區(qū)，不失為一種價(jià)值較高的診斷方法。但真菌感染灶通常位于深層基質(zhì)中，易受取材方法及部位的影響，導(dǎo)致角膜刮除樣本中病原體含量較低，使漏診率明顯增加。此外，檢查人員的主觀性差異，也對(duì)檢查結(jié)果有一定影響[5]。

1.2 真菌培養(yǎng)法

在嚴(yán)重的真菌性角膜潰瘍和疑似真菌性角膜炎病例中，真菌培養(yǎng)仍是必要的診斷步驟。最常見的培養(yǎng)基為沙堡弱(Sabouraud dextrose agar,SDA)培養(yǎng)基、血瓊脂(BA)培養(yǎng)基，非首診真菌性角膜炎真菌培養(yǎng)法的陽(yáng)性率為58%[6]。酵母菌培養(yǎng)周期在24-48 h，而絲狀真菌培養(yǎng)周期平均在2-4 d，某些真菌培養(yǎng)周期可能較長(zhǎng)(1wk-3wk)，如鐮刀菌等。真菌培養(yǎng)具有高度專一性，培養(yǎng)結(jié)果陽(yáng)性仍是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[3]。但缺點(diǎn)是培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，敏感性較低，導(dǎo)致診斷延遲、錯(cuò)過了最佳治療時(shí)機(jī)、增加了手術(shù)幾率。此外，若在標(biāo)本獲取前，患者已接受了經(jīng)驗(yàn)性的治療，可導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)[7]?；铙w共聚焦顯微鏡(in vivo confocal microscopy,IVCM)活體共聚焦顯微鏡可在顯微結(jié)構(gòu)水平上對(duì)角膜組織進(jìn)行實(shí)時(shí)成像，分辨率為1微米，可檢測(cè)到體積為數(shù)微米或更大的微生物有機(jī)體，如真菌菌絲等[8]。目前有研究表明，針對(duì)真菌性角膜炎患者，活體共聚焦顯微鏡敏感性約94%[9]。IVCM檢查的優(yōu)點(diǎn)包括無(wú)創(chuàng)、可于早期對(duì)真菌性角膜炎進(jìn)行診斷、感染深度的確定、治療效果的評(píng)估與指導(dǎo)等。但這項(xiàng)檢查要求檢查人員具備豐富的檢查經(jīng)驗(yàn)；患者配合度不佳及運(yùn)動(dòng)偽影均會(huì)影響檢查結(jié)果；致密的角膜浸潤(rùn)灶或疤痕也會(huì)影響組織的滲透性和可視性[10]。此外，IVCM無(wú)法檢測(cè)體積較小的生物體。同時(shí)，這項(xiàng)技術(shù)的成本相對(duì)較高，在經(jīng)濟(jì)條件較差的地區(qū)，其普及應(yīng)用收到了限制，許多醫(yī)療機(jī)構(gòu)很難獲得足夠的經(jīng)驗(yàn)來使用共焦顯微鏡。

2 分子診斷學(xué)

2.1 PCR相關(guān)技術(shù)

2.1.1聚合酶鏈反應(yīng) ( Polymerase Chain Reaction,PCR)

聚合酶鏈反應(yīng)是一種能將特定的DNA片段放大擴(kuò)增的分子生物學(xué)技術(shù)手段，可在生物體外的對(duì)DNA進(jìn)行復(fù)制，將微量的DNA樣本大幅增加。由于PCR技術(shù)可在體外對(duì)待測(cè)基因進(jìn)行成倍的擴(kuò)增，目前正在越來越多地應(yīng)用于病原體感染的早期診斷[11]。相較于真菌性角膜炎傳統(tǒng)診斷方法而言，PCR技術(shù)具有反應(yīng)迅速、所需臨床樣本量小的優(yōu)勢(shì)。但是在利用PCR技術(shù)對(duì)致病性DNA進(jìn)行擴(kuò)增的同時(shí)，也可對(duì)非致病性DNA進(jìn)行擴(kuò)增，則會(huì)導(dǎo)致過度診斷發(fā)生[12]。

2.1.2多重PCR (multiplex PCR)

多重PCR，又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，是一種在同一PCR反應(yīng)體系內(nèi)加上二對(duì)或二對(duì)以上引物，以同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)。其反應(yīng)原理，反應(yīng)試劑和操作過程與一般PCR相同，但可產(chǎn)生多個(gè)PCR產(chǎn)物，用于多種病原菌的同時(shí)檢測(cè)或鑒定，或?qū)νN菌屬的分型鑒定。Dan He等人的研究中，利用多重PCR方法可同時(shí)對(duì)茄病鐮刀菌、煙曲霉菌及光滑酵母菌三種真菌進(jìn)行檢測(cè)。與真菌培養(yǎng)相比，多重PCR技術(shù)可同時(shí)對(duì)樣本中多種病原體進(jìn)行檢測(cè)，具有簡(jiǎn)單、快速、專一性強(qiáng)、穩(wěn)定性高、可重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)[11,13]。

2.1.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種可以對(duì)PCR反應(yīng)進(jìn)程實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的技術(shù)[14]，其原理是在PCR反應(yīng)體系內(nèi)加入熒光報(bào)告基團(tuán)，隨著反應(yīng)的進(jìn)行、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不斷積累，熒光信號(hào)也相應(yīng)逐漸增強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR反應(yīng)過程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析，可推斷出模板最初的含量[15]。此前董鐸等人報(bào)道了茄病鐮刀菌、尖孢鐮刀菌及串珠鐮刀菌的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，敏感性高，檢測(cè)的靈敏度可達(dá)1pg級(jí),為臨床真菌性角膜炎鐮刀菌感染的診斷提供了一種快速準(zhǔn)確的方法。相較于普通PCR技術(shù)而言，實(shí)時(shí)熒光定量PCR在反應(yīng)體系中加入了熒光基團(tuán)，通過對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，較電泳檢測(cè)靈敏度高；其次，利引物和熒光基團(tuán)同時(shí)與待測(cè)模板特異性結(jié)合，提高了PCR反應(yīng)的特異性；另外，通過對(duì)熒光信號(hào)的檢測(cè)，可對(duì)反應(yīng)進(jìn)程實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、準(zhǔn)確定量[16,17]，但該實(shí)驗(yàn)方法所需實(shí)驗(yàn)成本偏高。

2.1.4巢式PCR(nest-PCR)

巢式PCR，或稱嵌套PCR，是一種利用兩套PCR引物對(duì)，先后進(jìn)行兩輪PCR反應(yīng)，從而擴(kuò)增完整的目的基因片段的PCR手段。在第一輪反應(yīng)中，外引物用以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，此產(chǎn)物在在內(nèi)引物的存在下進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，得到小于第一次擴(kuò)增產(chǎn)物的PCR產(chǎn)物片段[7]。而半巢式PCR與巢式PCR不同之處在于，在第二輪反應(yīng)中，僅替換第一輪反應(yīng)引物對(duì)中的一個(gè)，而保留另一個(gè)引物。在Parisa Badiee等人的研究中，納入38例疑似真菌性角膜炎病例，結(jié)合角膜組織涂片檢查、真菌培養(yǎng)、PCR及對(duì)抗真菌藥的反應(yīng)，其中28例診斷為真菌性角膜炎，巢式PCR檢查結(jié)果與其匹配度(包括陽(yáng)性率及陰性率)為81.6%，而KOH濕片法、革蘭氏染色法及真菌培養(yǎng)的匹配度分別為76.3%，42.1%，68.4%。Haghani I等利用半巢式 PCR 對(duì)真菌性角膜炎進(jìn)行診斷，陽(yáng)性率可達(dá) 27.5%，而 KOH 濕涂片為10%，鈣熒光白染色為25%，真菌培養(yǎng)為17.5%；敏感性分別為：KOH濕片法為28.5%，KOH濕片法聯(lián)合鈣熒光白染色為42%，半巢式PCR為57.1%；特異性分別為：KOH濕片法為94%，鈣熒光白染色為78.7%，半巢式PCR為78.7%?？梢?，巢式PCR及半巢式PCR采用兩個(gè)引物對(duì)、兩輪PCR反應(yīng)，提高了檢測(cè)的靈敏度。但也因?yàn)閮奢喎磻?yīng)，中途需開蓋處理，增加了污染的機(jī)會(huì)[18-20]。

2.1.5直接PCR(Direct PCR)

傳統(tǒng)PCR方法均需經(jīng)過DNA提取步驟，而DNA提取過程不僅耗費(fèi)時(shí)間，而且還受到樣本中致病病原體含量較低、提取過程中DNA模板丟失等條件的限制。而直接PCR通過將樣本加無(wú)菌水混勻后，隨后抽取部分含有樣本的溶液直接用于PCR反應(yīng)。無(wú)需提取DNA樣本而直接進(jìn)行PCR。直接PCR反應(yīng)的關(guān)鍵因素為特殊的DNA聚合酶，即使樣本背景復(fù)雜、病原體含量極低，也可獲得良好的PCR結(jié)果。Zhao等人的研究顯示，利用直接PCR方法對(duì)80份角膜刮片進(jìn)行檢測(cè)，其中66例結(jié)果陽(yáng)性，總檢測(cè)出率達(dá)82.5%。對(duì)34名高度懷疑真菌性角膜炎的患者，直接PCR的陽(yáng)性率為84.8%。將重復(fù)的角膜刮片剔除后，陽(yáng)性率增加到91.2%，顯著高于培養(yǎng)基培養(yǎng)35.3%、涂片直接鏡檢64.7%， (P<0.001)，及共聚焦顯微鏡74.1%。直接PCR和真菌培養(yǎng)診斷感染性角膜炎的敏感性分別為98.0%和47.1%(P<0.001)，而特異性分別為81.8%和100%。另外，完成整個(gè)直接PCR過程僅需3 h[21]。直接PCR方法是一種新興的診斷技術(shù)，省略了DNA提取步驟，大大縮短了檢測(cè)所需時(shí)間，且感染性角膜炎具有高度敏感性和特異性，這種診斷方法對(duì)于及時(shí)制定有效的診療方案具有非常重要的意義。

2.1.6新一代測(cè)序技術(shù)(next-generation sequencing,NGS)

第一代DNA測(cè)序技術(shù)，包括傳統(tǒng)的化學(xué)降解法、雙脫氧鏈終止法及以其為基礎(chǔ)的各種DNA測(cè)序技術(shù)，其中由于操作簡(jiǎn)便，Sanger法應(yīng)用最為廣泛。而新一代測(cè)序技術(shù)，又稱為高通量DNA測(cè)序技術(shù)，相較于第一代DNA測(cè)序技術(shù)而言，可實(shí)現(xiàn)一次性對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子序列測(cè)序。Zhi gang Li等人在一項(xiàng)回顧性研究中，利用新一代測(cè)序技術(shù)對(duì)16例感染性角膜炎患者及4個(gè)固定于福爾馬林內(nèi)的角膜樣本進(jìn)行分析，應(yīng)用了Kraken及Centrifuge兩種宏基因組學(xué)分類引擎分析基因序列，成功鑒定了大多數(shù)患者的真菌、細(xì)菌及阿米巴病原體[22]。在病原微生物的檢測(cè)方面，通過NGS技術(shù)可以獲得病原微生物的序列信息，甚至可以鑒定到種，與傳統(tǒng)真菌檢測(cè)方法相比較，大大縮短了鑒定所需的時(shí)間，為早期診斷及針對(duì)性用藥提供了可能。但由于目前Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)致病性病原菌基因序列收納尚不完整，一些基因目前仍無(wú)法比對(duì)，另外該項(xiàng)技術(shù)所需實(shí)驗(yàn)條件及設(shè)備要求均較高，對(duì)于基層醫(yī)院推廣應(yīng)用尚存在很大難度[22-24]。

2.2 DNA指紋技術(shù)(DNA Fingerprinting)

DNA指紋技術(shù)，即在分子水平上對(duì)DNA多態(tài)性進(jìn)行研究，從而對(duì)致病性病原微生物分類鑒定的技術(shù)。目前用于真菌鑒定的DNA指紋技術(shù)包括限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性分析(restricted fragment length polymorphism,RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析(randomly amplified polymorphic DNA,RAPD)、擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性分析(amplified fragment length polymorphism,AFLP)、變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)或溫度梯度凝膠電泳(temperature gradient gel electrophoresis,TGGE)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)(single-strand conformation polymorphism,SSCP)等[7]。

2.2.1RFLP技術(shù) RFLP技術(shù)是最早應(yīng)用的DNA標(biāo)記技術(shù)。對(duì)于不同來源的DNA，其特異限制性酶切位點(diǎn)分布不同，選擇合適限制性內(nèi)切酶酶切后，可得到長(zhǎng)短不等的一系列片段，進(jìn)行電泳、與標(biāo)記的探針雜交放射自顯影后，便可得到RFLP圖譜。對(duì)酶切片段大小、數(shù)量以及構(gòu)型差異進(jìn)行分析，從而揭示DNA序列水平上的多態(tài)性。RFLP技術(shù)具有穩(wěn)定性高、重復(fù)性好的特點(diǎn)，但操作過程復(fù)雜，耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，且存在放射性危害[25]。

2.2.2RAPD技術(shù) 是一種以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)。其原理為利用隨機(jī)引物對(duì)DNA片段進(jìn)行非定點(diǎn)PCR擴(kuò)增[26]，隨即進(jìn)行凝膠電泳，可對(duì)擴(kuò)增片段的多態(tài)性進(jìn)行分析，進(jìn)而得知DNA基因組相應(yīng)區(qū)域的多態(tài)性。RAPD技術(shù)操作較簡(jiǎn)單，避免了RFLP技術(shù)中Southern雜交操作，且無(wú)需知曉DNA基因組序列信息，僅利用一套引物即可對(duì)不同菌種進(jìn)行鑒定，但該技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)條件及設(shè)備的依賴性較大，重復(fù)性相對(duì)較差。

2.2.3AFLP技術(shù) AFLP技術(shù)是RFLP技術(shù)及PCR技術(shù)相結(jié)合的分子標(biāo)記技術(shù)，其原理是利用一種稀有位點(diǎn)的酶及一種多切酶對(duì)DNA基因組進(jìn)行酶切，接著利用與兩種限制性內(nèi)切酶相對(duì)應(yīng)的雙鏈接頭與DNA片段連接，最后應(yīng)用與接頭識(shí)別的引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，最后利用聚丙烯凝膠電泳對(duì)得到的DNA片段進(jìn)行分離，從而得出AFLP指紋圖譜。利用AFLP技術(shù)可檢測(cè)出親緣關(guān)系較近的DNA樣品中細(xì)微的差異，具有較高的穩(wěn)定性及可靠性。同時(shí)避免了RFLP操作復(fù)雜、有放射性危害及RAPD穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)[27,28]。

2.2.4DGGE技術(shù) 是利用含有濃度線性遞增變性劑的聚丙烯酰胺凝膠電泳，將具有不同堿基序列但具有相似長(zhǎng)度的雙鏈DNA分離的分子標(biāo)記技術(shù)[29]，對(duì)于長(zhǎng)度相似或相同，而堿基組成的雙鏈DNA片段而言，其所需解鏈溫度不同，所需的變性劑濃度也不同。在由低到高濃度線性梯度的聚丙烯酰胺凝膠電泳中，隨電泳進(jìn)行，DNA雙鏈片段在所需變性劑濃度位置處解鏈但不徹底分離，解鏈程度增大導(dǎo)致遷移阻力增大，當(dāng)與電場(chǎng)力相平衡時(shí)，DNA分子不在電場(chǎng)中移動(dòng)，由此形成圖譜。借助DGGE技術(shù)，可將相同長(zhǎng)度的雙鏈DNA 片段分離，從而達(dá)到鑒別的目的。DGGE技術(shù)具有檢測(cè)率較高，結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，但其并不能確定基因組中突變的位點(diǎn)，需借助其他分子學(xué)方法進(jìn)一步分析[30]。

2.2.5SSCP技術(shù) 是利用單鏈DNA構(gòu)象的多態(tài)性分析DNA單鏈堿基突變的一種分子標(biāo)記技術(shù)。當(dāng)靶基因片段中發(fā)生堿基突變(如堿基插入、改變、缺失等)時(shí)，DNA單鏈構(gòu)象發(fā)生改變，在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，長(zhǎng)度相同但構(gòu)象不同的DNA單鏈即呈現(xiàn)出構(gòu)象多態(tài)性。該技術(shù)簡(jiǎn)單、靈敏、易于操作等特點(diǎn)，但仍需通過測(cè)序技術(shù)得知基因突變的位點(diǎn)及類別[31,32]。

2.3 核酸分子雜交技術(shù)

是一種基于堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，在一定條件下使靶基因變性、復(fù)性，并利用特異探針與靶基因核酸單鏈雜交為雙鏈，從而對(duì)病原體進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)[33]。核酸分子雜交技術(shù)按反應(yīng)條件又分為固相、液相雜交、原位雜交。固相雜交為將待測(cè)單鏈核酸結(jié)合到固相支持物上，隨后放入含有標(biāo)記探針的雜交液體中進(jìn)行雜交，雜交雙鏈便留在固相支持物上。原位雜交技術(shù)是以已知序列的特定標(biāo)記核酸分子作為探針，與常規(guī)方法獲取標(biāo)本中病原體核酸進(jìn)行雜交，無(wú)需提取DNA即可檢測(cè)有無(wú)病原體感染的方法，但相較于其他分子診斷方法，其敏感性較低。與PCR技術(shù)相結(jié)合的反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)，即PCR-RLB技術(shù)，則大大提高了檢測(cè)的敏感性[34]。

2.4 基因芯片技術(shù)(Gene Chip)或稱DNA微陣列技術(shù)(DNA microarray)

是在反向斑點(diǎn)雜交的基礎(chǔ)上，將大量靶基因的探針有順序的、高密度的排列固定在同一固相支持物上，稱為基因芯片?？蓪?shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)大量待測(cè)片段進(jìn)行檢測(cè)，大大縮短了臨床診斷所需時(shí)間。但基因芯片制作成本較高，且所需檢測(cè)設(shè)備昂貴，使其應(yīng)用局限于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，未能廣泛應(yīng)用于臨床病原微生物檢測(cè)[11]。

2.5 質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)

近年來，質(zhì)譜技術(shù)飛速發(fā)展，其中基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)是近年來新興的一種軟電離質(zhì)譜技術(shù)，利用儀器軟件繪制菌種的蛋白質(zhì)譜峰圖譜，并與已知病原菌標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，從而達(dá)到鑒定的目的[35]。 MADLI-TOF MS技術(shù)具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、高通量等特點(diǎn)，但由于目前已知微生物蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)仍不完善，導(dǎo)致一些少見菌種的鑒定較為困難；對(duì)于樣本處理辦法的不同，并無(wú)同一的標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性不高；若為同一菌屬中較為相近的菌種，易導(dǎo)致鑒定錯(cuò)誤。因此，我們需要繼續(xù)完善數(shù)據(jù)庫(kù)，規(guī)范樣本預(yù)處理辦法，同時(shí)與其它診斷方法相結(jié)合，以最大程度地發(fā)揮質(zhì)譜技術(shù)的效用[36]。

2.6 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(loop mediated isothermal amplification,LAMP)

是一種全新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)在恒定溫度下即可特異地將DNA片段擴(kuò)增至109個(gè)拷貝，耗時(shí)多在1 h內(nèi)。 其原理為對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，利用具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶在恒溫條件下催化新鏈合成，從而保證靶基因片段高效、快速、特異地?cái)U(kuò)增[37]。雖然引物設(shè)計(jì)與選擇相對(duì)較復(fù)雜，但與常規(guī)PCR核酸擴(kuò)增方法相比，LAMP四種引物需與位點(diǎn)完全匹配才能進(jìn)行擴(kuò)增，特異性較強(qiáng)；LAMP所需擴(kuò)增模板為10拷貝或更低，靈敏度較高，但也因此非特異性擴(kuò)增導(dǎo)致的假陽(yáng)性率也隨之升高；恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)避免了PCR過程中變溫耗時(shí)，確保反應(yīng)可在較短時(shí)間內(nèi)完成；另外，LAMP反應(yīng)無(wú)需昂貴的PCR反應(yīng)儀，降低了實(shí)驗(yàn)成本；此外，LAMP產(chǎn)物檢測(cè)可通過直接觀察或熒光檢測(cè)等方法，步驟簡(jiǎn)潔。以上優(yōu)勢(shì)使LAMP擁有較廣闊的應(yīng)用前景[38,39]，但LAMP僅能對(duì)片段較小的短鏈DNA進(jìn)行擴(kuò)增，無(wú)法擴(kuò)增較長(zhǎng)的DNA片段，此外，由于該反應(yīng)靈敏度較高，過程中易受污染物的影響而呈現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果。

2.7 滾環(huán)擴(kuò)增(Roiling Circle Amplification,RCA)

是一種近年來新興的核酸擴(kuò)增技術(shù)，其本質(zhì)為以連接酶連接、引物延伸與鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)為基礎(chǔ)的一種恒溫核酸擴(kuò)增方法。其原理為以環(huán)狀DNA為模板，在DNA聚合酶的催化作用下，使一個(gè)較短DNA引物沿模板鏈延伸、擴(kuò)增，將dNTPs結(jié)合為包含大量重復(fù)的模板互補(bǔ)片段的單鏈DNA。這種方法可以通過簡(jiǎn)單、有效的過程實(shí)現(xiàn)對(duì)靶核酸的信號(hào)放大，不失為一種核酸檢測(cè)的理想手段。除此以外，通過RCA技術(shù)，還可實(shí)現(xiàn)對(duì)包括RNA、SNP、蛋白質(zhì)、病原體及病變細(xì)胞等目標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)[40,41]。具有高度特異性，操作簡(jiǎn)便及靈敏度較高的優(yōu)點(diǎn)。但RCA技術(shù)也存在一定的制約，如鎖式探針連接效率、背景信號(hào)干擾、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的制約等等，仍需進(jìn)一步解決[42]。

2.8 重組酶聚合酶擴(kuò)增術(shù)(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)

被稱為可以替代PCR的核酸擴(kuò)增技術(shù)。RPA作為另一種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，通過模擬DNA體內(nèi)擴(kuò)增的過程，在37℃-42℃條件下，利用重組酶和單鏈結(jié)合蛋白協(xié)同實(shí)現(xiàn)引物和模板的特異性結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)核酸片段成指數(shù)擴(kuò)增。作為一種新興的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)具有快速、成本低、操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，已逐漸應(yīng)用于病原體檢測(cè)領(lǐng)域，但仍存在一些不足，如其應(yīng)用的探針及引物較特殊，使得RPA技術(shù)僅適用于長(zhǎng)序列核酸分析等[43,44]。

上述分子診斷方法各有其優(yōu)勢(shì)，但大多需提前進(jìn)行DNA模板提取。因此，實(shí)驗(yàn)室環(huán)境污染、操作不當(dāng)則導(dǎo)致假陽(yáng)性問題出現(xiàn)；此外，真菌性角膜炎組織樣本內(nèi)病原體量較少，若刮除方法不當(dāng)、運(yùn)輸措施不當(dāng)，經(jīng)過DNA提取，則極易出現(xiàn)假陰性問題。實(shí)驗(yàn)所需儀器、設(shè)備以及有經(jīng)驗(yàn)的操作人員，均給分子診斷方法在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)的普及帶來了障礙。因此，我們?nèi)孕枳鞒龈蟮呐?，使其朝著無(wú)需提取DNA模板、簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作步驟及所需條件、檢測(cè)結(jié)果的可視化等方向發(fā)展。

真菌性角膜炎是一種全球分布的致盲性眼病。就診斷方法而言，雖然直接鏡檢及培養(yǎng)的敏感性不高，但仍為診斷真菌性角膜炎的金標(biāo)準(zhǔn)，除此以外，例如共聚焦顯微鏡、各式各樣的分子診斷學(xué)方法如PCR相關(guān)技術(shù)、新一代測(cè)序技術(shù)、DNA指紋技術(shù)、核酸分子雜交技術(shù)、基因芯片技術(shù)、質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)、LAMP、RCA、RPA等也為診斷提供了新的方向，節(jié)約了診斷時(shí)間，提高了檢出率，有望使真菌性角膜炎得到早期診斷和及時(shí)治療。