楊麗麗

現(xiàn)有研究已經(jīng)證實(shí)細(xì)胞凋亡過(guò)程與凋亡基因表達(dá)關(guān)系密切［1-3］, 測(cè)定細(xì)胞凋亡基因表達(dá)具有重要意義。XIAP作為新型細(xì)胞凋亡抑制蛋白(IAP)家族的成員, 能夠與Caspase-3、Caspase-9等直接發(fā)生相互作用, 對(duì)細(xì)胞凋亡具有顯著抑制效果。本研究通過(guò)分析總結(jié)胃癌組織XIAP和基因的表達(dá)特點(diǎn), 為胃癌診治提供新思路, 現(xiàn)總結(jié)如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年6月～2016年8月因胃癌而于本院接受手術(shù)治療的76例患者, 將術(shù)中獲取的76份胃癌組織作為胃癌組, 50份癌旁正常組織作為正常組。入選標(biāo)準(zhǔn)：①病理檢查證實(shí)為胃部惡性腫瘤；②患者知情同意；③腫瘤組織保存完整；④排除拒絕參加實(shí)驗(yàn)者；⑤排除有其他不適宜因素者。其中男48例, 女28例；年齡35～76歲, 平均年齡(61.35±6.07)歲；組織學(xué)分化等級(jí)為低分化35例, 中分化21例, 高分化20例。選取同期資料相仿、病例檢查確診為胃部良性病變的60例患者, 活檢獲取的60份胃良性病變組織作為胃良性病變組, 其中男41例, 女19, 年齡34～78歲,平均年齡(58.62±6.46)歲。

1.2 試劑和儀器 兔抗人XIAP單克隆抗體(一抗)、SP檢測(cè)試劑盒、DAB顯色試劑、顯微鏡電泳儀、其他免疫組化檢測(cè)相關(guān)試劑、RT-PCR檢測(cè)相關(guān)試劑、PCR分析軟件等。

1.3 方法

1.3.1 XIAP測(cè)定方法 組織脫蠟水化后用過(guò)氧化物酶阻滯劑在避光條件孵育15 min, 取出蒸餾水沖洗后用磷酸緩沖鹽(PBS)溶液浸泡并濕盒；加入一抗1000 ml于組織上, 再次孵育30 min, 取出后再用PBS溶液浸泡并濕盒, 添加100 ml體積Chem MateTMEnvusion/HRP溶液在組織上后再孵育30 min, 取出后再用PBS溶液浸泡并濕盒, 向組織表面滴加DAB顯色劑100 ml, 完全顯色之后, 用蒸餾水將顯色劑沖洗干凈以終止顯色反應(yīng), 對(duì)顯色成功的標(biāo)本進(jìn)行梯度酒精脫水(從70%酒精開始至100%酒精結(jié)束), 將標(biāo)本放置到二甲苯溶液中浸泡3次后, 取出再次脫水并用中樹膠封片后行鏡下染色結(jié)果觀察。

1.3.2 XIAP mRNA測(cè)定方法 以逆轉(zhuǎn)錄方式分別提取總RNA后, 通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶、相應(yīng)六聚體引物將RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄, 利用XIAP特異性引物對(duì)樣本進(jìn)行PCR反應(yīng)獲取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以得到 XIAP mRNA。用瓊脂糖膠將擴(kuò)增產(chǎn)物分離后, 將待測(cè)物質(zhì)放置于EB溶液中進(jìn)行顯色反應(yīng), 在紫外燈照射條件下, PCR擴(kuò)增產(chǎn)物放置到電泳儀中完成電泳掃描, 從而對(duì)各組的目的基因、β-actin光密度值進(jìn)行測(cè)定, 將電泳結(jié)果輸入PCR分析系統(tǒng)進(jìn)行分析, 計(jì)算 XIAP灰度積分、條帶背景灰度積分及β-actin灰度積分, 其中目的基因相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度=(目的基因灰度積分-條帶背景灰度積分)÷(βactin灰度積分-條帶背景灰度積分)×100%。

1.4 觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn) 觀察比較三組XIAP和XIAP mRNA表達(dá)水平。本研究中陽(yáng)性對(duì)照為用已知陽(yáng)性胃癌切片,陰性對(duì)照用PBS溶液對(duì)一抗進(jìn)行替代。XIAP陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)［3］：在顯微鏡下觀察到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)特異性黃色或棕黃色顆粒、且細(xì)胞核未見著色。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、染色程度, 參照文獻(xiàn)［4］客觀評(píng)價(jià)XIAP陽(yáng)性強(qiáng)度并計(jì)算陽(yáng)性率, 染色程度計(jì)分方法為：無(wú)色：0分, 為陰性, 淺黃色：1分, 棕黃色：2分,棕褐色：3分；根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率(每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞, 計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞所占比例, 每張標(biāo)本均計(jì)數(shù)5個(gè)視野,取平均值為結(jié)果, 分?jǐn)?shù)越高, 陽(yáng)性細(xì)胞百分率越大。無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞：0分, 0＜陽(yáng)性細(xì)胞百分率≤10%：1分；10%＜陽(yáng)性細(xì)胞百分率≤50%：2分；50%＜陽(yáng)性細(xì)胞百分率≤75%：3分；陽(yáng)性細(xì)胞百分率＞75%：4分)；染色強(qiáng)度評(píng)分乘以陽(yáng)性細(xì)胞百分率所獲得乘積為評(píng)價(jià)標(biāo)本陽(yáng)性結(jié)果的依據(jù), 乘積＞3分為陽(yáng)性, 乘積≤3分為陰性。本實(shí)驗(yàn)采取雙盲法閱片。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示, 采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

胃癌組XIAP免疫組化評(píng)分(6.54±1.08)分, 56份標(biāo)本XIAP陽(yáng)性, 陽(yáng)性率為73.68%, XIAP mRNA表達(dá)量為(3.16±0.27)；正常組XIAP免疫組化評(píng)分為(2.61±0.34)分, 11份標(biāo)本XIAP陽(yáng)性, 陽(yáng)性率為22.00%, XIAP mRNA表達(dá)量為(1.09±0.18)；胃良性病變組XIAP免疫組化評(píng)分為(2.56±0.41)分,8份標(biāo)本XIAP陽(yáng)性, 陽(yáng)性率為13.33%, XIAP mRNA表達(dá)量為(1.15±0.16)；胃癌組XIAP免疫組化評(píng)分、XIAP陽(yáng)性率、XIAP mRNA表達(dá)量顯著高于其他兩組, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；正常組、胃良性病變組XIAP免疫組化評(píng)分、XIAP陽(yáng)性率、XIAP mRNA表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討論

XIAP屬于IAP家族之一, 在1996年被有關(guān)學(xué)者等首次從人胚胎腦細(xì)胞中成功克隆, 人體中僅有外周血淋巴細(xì)胞未見明顯XIAP表達(dá), 其他組織中均可檢測(cè)到XIAP。細(xì)胞學(xué)研究表明XIAP能夠參與細(xì)胞增殖過(guò)程, 對(duì)細(xì)胞分裂速度產(chǎn)生直接影響。現(xiàn)有研究中關(guān)于胃癌XIAP的研究并不少見［5-7］,但是目前仍無(wú)相關(guān)大樣本研究明確胃癌XIAP表達(dá)在胃癌診治中的價(jià)值。本研究結(jié)果顯示, 胃癌組織中XIAP、XIAP mNRA表達(dá)顯著高于正常組織和胃良性病變組織, 且正常組織與胃良性病變組織中XIAP、XIAP mNRA表達(dá)水平相近,說(shuō)明XIAP作為抗凋亡因子在胃癌中具有異常高表達(dá)特性,其可能與胃癌細(xì)胞存在凋亡障礙有關(guān)［8-10］, 其能夠通過(guò)抑制胃癌細(xì)胞凋亡而延長(zhǎng)胃癌細(xì)胞存活時(shí)間, 從而加速胃癌惡化。不同病理特征胃癌組織中XIAP表達(dá)水平分析結(jié)果發(fā)現(xiàn), 臨床分期越晚, 胃癌組織中的XIAP陽(yáng)性率越高, 證實(shí)XIAP參與胃癌惡化進(jìn)展。由于研究時(shí)間、樣本數(shù)目等限制, 未能對(duì)XIAP在胃癌惡化中的具體機(jī)制進(jìn)行明確。

綜上所述, XIAP可能參與胃癌發(fā)生及惡化進(jìn)程, 測(cè)定XIAP水平對(duì)惡性腫瘤診治準(zhǔn)確性的提升有重要價(jià)值。

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