梁新強，寧淑芳，劉海洲，王海燕，唐亞梅，張力圖，崔 英，利基林*

（廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，1.實驗研究部；2.教務(wù)科，廣西 南寧 530021）

原發(fā)性肝癌（primary liver cancer，PLC）是我國甚至全世界最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)我國2010年腫瘤登記資料統(tǒng)計，廣西肝癌的發(fā)病率和死亡率分別為43.76/10萬和38.52/10萬，均高于全國的28.71/10萬和26.04/10萬水平[1]，肝癌的發(fā)生是多因素、多步驟的過程，其最主要的生物危險因素是乙型肝炎病毒（HBV）感染[2-3]。在廣西肝癌高發(fā)區(qū)，我們應(yīng)用流式細胞術(shù)（FCM）檢測715例人員外周血淋巴細胞亞群的表達水平和NK細胞活性，同時以100例健康人作為對照，以了解高發(fā)區(qū)人群的免疫狀態(tài)，對肝癌的防治提供參考依據(jù)，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

715例肝癌高發(fā)區(qū)人員為廣西扶綏縣城鄉(xiāng)居民，男459例，女256例，28～61歲，平均45.1±8.2歲，其中有HBV感染者574例，無HBV感染者141例。100例健康對照者為同期獻血人員，男61例，女39例，25～55歲，平均42.5±7.9歲。組間性別構(gòu)成比和年齡，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 儀器與試劑

流式細胞儀為Epics XL型，COULTERQ-PREP型自動溶血儀，ABC溶血素，鼠抗人單克隆抗體CD 45/CD4/CD8/CD3、CD45/CD（16+56）/CD19/CD3，上述儀器與試劑均為美國Beckman coulter公司生產(chǎn)；血清HBsAg檢測使用上海科華生物有限公司生產(chǎn)的試劑盒。

1.3 方法

分別于清晨空腹抽取肘靜脈血5 mL，其中2.5 mL置于含乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）的抗凝管中，另外2.5 mL置于普通生化管中。從抗凝管中吸取100 μl全血分別與熒光素標記的鼠抗人單克隆抗體CD45/CD4/CD8/CD3、CD45/CD（16+56）/CD 19/CD3 20μl混勻、同型對照IgG各20 μL混勻，避光反應(yīng)（室溫）30 min，溶血后1 h內(nèi)上機完成檢測。上機后圈出擬測定的淋巴細胞群，每次捕獲取10000個細胞，雙參數(shù)分析淋巴細胞表面標記，計算出CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、NK和CD3+CD19+細胞的百分比含量；分離出生化管中的血清，用于檢測HBsAg，嚴格按說明書操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理，計量資料以“±s”表示，采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肝癌高發(fā)區(qū)人員外周血淋巴細胞亞群表達水平和NK細胞活性與健康人比較

與健康人比較，高發(fā)區(qū)人員外周血CD3+/CD8+升高，CD3+/CD19+下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；CD3+、CD3+/CD4+和NK細胞活性，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 肝癌高發(fā)區(qū)人員外周血淋巴細胞亞群表達水平和NK細胞活性與健康人比較（±s，%）

表1 肝癌高發(fā)區(qū)人員外周血淋巴細胞亞群表達水平和NK細胞活性與健康人比較（±s，%）

組別nCD3+CD3+/CD4+CD3+/CD8+NKCD3+/CD19+高發(fā)區(qū)人員71569.31±11.8935.11±10.2329.28±11.6015.70±8.303.02±2.68健康人對照10069.63±10.5335.70±7.2924.69±6.0616.97±5.2213.62±3.90 t 0.25550.55713.8821.4894.967 P 0.79840.57760.0010.13690.0000

2.2 肝癌高發(fā)區(qū)人員有無HBV感染者外周血淋巴細胞亞群的表達水平和NK細胞活性比較

在高發(fā)區(qū)人群中，有感染乙型肝炎者和無感染乙型肝炎者比較，各項指標的，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 肝癌高發(fā)區(qū)人員有無HBV感染者外周血淋巴細胞亞群的表達水平和NK細胞活性比較（x±s，%）

3 討 論

肝癌的發(fā)生是多因素、多基因、多階段作用的結(jié)果，至今病因尚未完全確認。有研究[2-3]表明，HBV、黃曲霉毒素B1攝入和飲用水源污染等是肝癌的主要危險因素，HBV感染人員患肝癌的危險性是陰性人員的25～37倍，肝癌高發(fā)區(qū)人群HBsAg陽性率高達17.83%，遠高于全國9.09%的平均水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

乙型肝炎免疫應(yīng)答的主要途徑是以CD8淋巴細胞為主導(dǎo)的細胞免疫，T細胞清除實驗數(shù)據(jù)表明，CD8 T細胞是與病毒清除直接有關(guān)的細胞亞群，在清除病毒過程中起到關(guān)鍵的作用，慢性乙型肝炎患者CD3+/CD8+T細胞百分率顯著上升，與肝炎病毒的復(fù)制密切相關(guān)。本研究顯示，肝癌高發(fā)區(qū)人群外周血CD3+/CD8+升高，CD3+/CD19+下降，表面機體感染HBV后，由于病毒復(fù)制，從而導(dǎo)致CD3+/CD8+T細胞百分率上升，而對血液中HBV的殺滅，又使得CD3+/CD19+下降。但CD3+/CD8+升高和CD3+/CD19+下降卻與機體是否感染HBV無關(guān)，對非HBV感染者如何解析？是什么因素導(dǎo)致該地區(qū)人群外周血普遍CD3+/CD8+升高，值得我們進一步研究。

[1] 左婷婷,鄭榮壽,曾紅梅,等.中國肝癌發(fā)病狀況與趨勢分析[J].中華腫瘤雜志,2015,37(9):691-696.

[2] 高 蕊,劉中景,陳 菲,等.乙型肝炎相關(guān)性原發(fā)性肝癌相關(guān)危險因素的Logistic回歸分析[J].臨床肝膽病雜志,2014,30(4):370-372.

[3] 薛萬江,馮 盈,李 鵬,等.肝細胞癌組織中Ras相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族1A基因甲基化與環(huán)境因素的關(guān)系[J].中華實驗外科雜志,2012,29(4):650-652.