席佳達(dá)，夏國園*，程祖勝

(1.紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 紹興 312000；2.紹興市第七人民醫(yī)院放射科，浙江 紹興 312000)

隨著超聲微泡造影劑(ultrasound contrast agent, UCA)、超聲靶向微泡破壞(ultrasound-targeted microbubble destruction, UTMD)技術(shù)與超聲微泡攜基因(ultrasound microbubble carrying gene, UMCG)技術(shù)的發(fā)展與成熟，超聲微泡的治療作用日漸突顯, 通過靶向微泡造影劑(targeted microbubbles contrast agent, TMCA)靶向傳輸基因、UTMD的空化效應(yīng)增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)染率，可靶向治療疾病。UMCG已用于治療多種疾病。本文主要圍繞UMCG治療肝臟疾病的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 概述

1.1UCA的發(fā)展 UCA的發(fā)展歷經(jīng)3個(gè)階段：第1代造影劑內(nèi)含自由氣體，無外膜包被，顆粒較大，穩(wěn)定性差；第2代造影劑外包白蛋白、脂質(zhì)、表面活性劑或聚合物等殼膜，穩(wěn)定性增加，直徑也縮小至8 μm以下，可通過靜脈注射；第3代造影劑內(nèi)含氟碳或氟硫類氣體，外有殼膜包被，可在血液中持續(xù)15 min以上，穩(wěn)定性大大提高。

1.2TMCA 與普通UCA相比，TMCA表面連接特異性的配體或抗原，經(jīng)靜脈注射后可到達(dá)感興趣區(qū)。各類藥物或基因通過共價(jià)鍵或靜電連接在靶向微泡表面或直接包裹入微泡內(nèi)，既能有效防止藥物或基因被血液中的物質(zhì)分解，又能將藥物或基因運(yùn)送至目標(biāo)區(qū)域。與傳統(tǒng)的病毒、非病毒載體相比，微泡作為基因載體具有安全、定向及有效等特點(diǎn)。

1.3UTMD 通過對(duì)目標(biāo)區(qū)域施加一定頻率的超聲使微泡破裂，定位釋放出微泡內(nèi)的藥物或基因，產(chǎn)生空化效應(yīng)，使血管內(nèi)皮細(xì)胞及靶細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性暫時(shí)增加、細(xì)胞間隙增寬，在細(xì)胞膜及核膜上產(chǎn)生聲孔，促進(jìn)細(xì)胞的內(nèi)吞作用，增加其對(duì)大分子物質(zhì)的吸收，使外源基因更易進(jìn)入目標(biāo)組織，具有安全性高及靶向性強(qiáng)的特點(diǎn)。

2 UMCG在肝臟疾病治療中的應(yīng)用

2.1肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC) 我國HCC發(fā)病率僅次于肺癌和胃癌，每年死亡人數(shù)達(dá)32.1萬[1]。研究[2]發(fā)現(xiàn)UMCG可抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、生長，或誘導(dǎo)HCC凋亡。1986年Moolten等首次報(bào)道通過將單純皰疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase, HSV-TK)轉(zhuǎn)移到腫瘤細(xì)胞，可提高核苷類似物(nucleoside analoges, NSA)殺傷腫瘤細(xì)胞的敏感度。HSV-TK自殺基因是一種前藥酶基因，可通過磷酸化作用使前藥丙氧鳥苷(ganciclovir, GCV)轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒性藥物，達(dá)到抗腫瘤作用。Zhou等[3]利用超聲靶向破壞包裹HIV-TK基因的質(zhì)粒，經(jīng)過48 h轉(zhuǎn)染后，HSV-TK+超聲+微泡+GCV組胸腺激酶(thymidine kinase, TK)蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，而TK蛋白在目標(biāo)區(qū)域的有效表達(dá)是HSV-TK/GCV治療腫瘤的基礎(chǔ)。HIFU可將超聲聚焦，瞬間產(chǎn)生高溫，使腫瘤細(xì)胞發(fā)生不可逆的壞死，療效確切，但存在腫瘤消滅不完全、術(shù)后易復(fù)發(fā)等缺點(diǎn)。謝輝等[4]采用HIFU治療裸鼠肝移植瘤，消融80%的皮下移植瘤后，再將連接磷脂酰肌醇蛋白多糖3(glypican-3, GPC3)抗體、并攜HSV-TK基因的納米級(jí)超分子探針的微泡靶向釋放于殘瘤中，記錄移植瘤中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)及微血管密度(microvessel density, MVD)的變化，發(fā)現(xiàn)微泡+HSV-TK+GPC3組的VEGR、HIF-1α mRNA的轉(zhuǎn)錄水平明顯降低；且腫瘤組織中毛細(xì)血管生成受到抑制、MVD水平明顯降低，使腫瘤血供受限，從而導(dǎo)致腫瘤缺血壞死。李炯等[5]分析超聲微泡聯(lián)合GPC3抗體及HSV-TK在體外對(duì)人肝癌細(xì)胞株增殖及侵襲能力的影響，發(fā)現(xiàn)超聲輻照孵育48 h后載基因靶向微泡組轉(zhuǎn)染率明顯增高，而肝癌細(xì)胞中增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)的表達(dá)及侵襲細(xì)胞數(shù)明顯降低，載基因靶向微泡組的細(xì)胞凋亡率達(dá)49%。

體外合成或基因表達(dá)產(chǎn)生的凋亡素可引導(dǎo)多種惡性腫瘤細(xì)胞凋亡，但對(duì)人體正常二倍體細(xì)胞無作用。張園等[6]通過UTMD聯(lián)合半乳糖聚乙烯亞胺(galactosylated-polyethylenimine, PEL-Gal)介導(dǎo)凋亡素基因，探討其對(duì)小鼠肝癌移植瘤的影響，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織凋亡率顯著增高，Caspase-3蛋白表達(dá)顯著增加，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的Bal-2蛋白表達(dá)明顯下降。

實(shí)驗(yàn)研究[7-8]發(fā)現(xiàn)癌胚蛋白GPC3及Hippo信號(hào)通路核心效應(yīng)因子Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein, YAP)的表達(dá)與HCC的產(chǎn)生、發(fā)展、凋亡和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。潘青云等[9]觀察超聲輻照攜帶miR-520c-3p和miR-132微泡轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)miR-520c-3p僅能抑制GPC3mRNA蛋白的翻譯過程，引起YAP蛋白及其mRNA表達(dá)減少；而miR-132僅能抑制YAP蛋白及其mRNA表達(dá)，但對(duì)GPC3無影響；以超聲輻照攜miR-520c-3p及miR-132微泡組，48 h后其細(xì)胞增殖率及凋亡率明顯低于其余各組，提示其能顯著抑制人肝癌細(xì)胞株增殖，并促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能與GPC3與YAP表達(dá)的調(diào)節(jié)有關(guān)。

轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)與HCC患者預(yù)后不良有關(guān)，而被TGF-β活化的長鏈非編碼RNA(lncRNA activated by TGF-β, lncRNA-ATB)是TGF-β信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物。同時(shí)，lncRNA-ATB還能競(jìng)爭(zhēng)性地與miR-200結(jié)合，增加E盒結(jié)合鋅指蛋白(E-box binding zinc finger protein, ZBE)1和2的表達(dá)，從而引起上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)和遷移，導(dǎo)致癌癥進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。Chen等[10]通過UTMD使lncRNA-ATB沉默RNA(siATB)轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株48 h，與對(duì)照組相比，siATB+UTMD組ZEB1及ZEB2的RNA及蛋白質(zhì)均明顯受到抑制，同時(shí)肝癌細(xì)胞的遷移與擴(kuò)散也明顯減少。而與siRNA相比，短發(fā)夾RNA(shRNA)更加穩(wěn)定。JKN信號(hào)途徑也參與某些疾病和腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，同時(shí)與肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。張宇虹等[11]通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法與UTMD技術(shù)結(jié)合，分析JKN1 shRNA對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞株的影響，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體+超聲微泡+超聲輻照組的轉(zhuǎn)染率均大于其余各組，提示肝癌細(xì)胞株JKN1表達(dá)明顯受到抑制。CD133是肝癌干細(xì)胞(Liver cancer stem cells, LCSCs)的表面標(biāo)記物，能在EMT過程中發(fā)揮作用，同時(shí)也是決定HCC發(fā)生和總生存期的重要因素。Liu等[12]通過UTMD介導(dǎo)shCD133來分析CD133和EMT在LCSCs中的調(diào)節(jié)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)通過核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear transcription factor kappa B, NF-κB)途徑抑制LSCSs中的CD133可以逆轉(zhuǎn)EMT，起到抑制腫瘤增殖轉(zhuǎn)移的作用；UTMD體外轉(zhuǎn)染CD133陽性亞群肝癌細(xì)胞組內(nèi)球狀細(xì)胞明顯減少，提示shCD133可抑制肝癌細(xì)胞自我更新。

Xue等[13]使用effectene轉(zhuǎn)染劑結(jié)合UTMD介導(dǎo)shRNA-Sox9轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)effectene+shRNA-SOX9+UTMD組轉(zhuǎn)染率明顯高于其余組，Sox9的表達(dá)明顯減少，提示其能顯著抑制肝癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。

2.2肝纖維化(hepatic fibrosis, HF) 肝細(xì)胞受到慢性損傷時(shí)，肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell, HSC)是激活HF的中心環(huán)節(jié)。HF長期持續(xù)可轉(zhuǎn)變?yōu)楦斡不?liver cirrhosis, LC)，其發(fā)病率和死亡率均較高[14]。微泡介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移可為治療HF提供新的可能[15]。

2.2.1基質(zhì)蛋白金屬酶(Matrix metalloproteinases, MMPs) MMPs可降解細(xì)胞外多數(shù)基質(zhì)成分，有效緩解HF。田力等[16]通過RNAi技術(shù)構(gòu)建定點(diǎn)干擾基質(zhì)蛋白酶抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1, TIMP-1)表達(dá)的病毒表達(dá)載體，并用超聲微泡攜TIMP-1 siRNA，以UTMD技術(shù)轉(zhuǎn)染后，實(shí)驗(yàn)組肝組織內(nèi)TIMP-1、TIMP mRNA含量明顯低于模型對(duì)照組，MMP含量顯著上升，大鼠HF得到一定緩解。

2.2.2肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF) HGF能調(diào)節(jié)膠原纖維合成與炎性反應(yīng)，抑制HSC活性，從而阻止HF發(fā)展[17]。Jiang等[18]通過超聲微泡介導(dǎo)HGF基因轉(zhuǎn)染肝臟，發(fā)現(xiàn)超聲-微泡-HGF組丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)及谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST)含量明顯降低，而總蛋白(total protein, TP)含量明顯升高，提示大鼠HF受到抑制，肝臟功能得到改善，蛋白質(zhì)合成增加。夏國園等[19]研究報(bào)道，在一定范圍內(nèi)，HGF對(duì)肝纖維化的抑制作用隨治療劑量加大而增加。李文艷等[20]制備出質(zhì)微泡-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物(LMB-CNLP)，使其攜HGF基因，并給予超聲輻照，探討其對(duì)處于對(duì)數(shù)生長期的HSC株的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染24 h后熒光顯微鏡下可觀察到LMB-CNLP組熒光較多，轉(zhuǎn)染144 h后LMB-CNLP組轉(zhuǎn)染率為41.29%，HSC-T6凋亡率達(dá)32.81%，可為治療HF提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2.2.3結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF) CTGF被認(rèn)為是基因干擾HF的潛在靶點(diǎn)[21-22]。楊丹等[23]采用搭載CTGF-miRNA的陽離子脂質(zhì)體微泡，轉(zhuǎn)染24 h后熒光顯微鏡下已可見較多綠色熒光；載基因陽離子脂質(zhì)體-微泡聯(lián)合超聲組的細(xì)胞活性與其他組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而轉(zhuǎn)染效率明顯高于其他組，表明該基因轉(zhuǎn)染方法具有安全性，也為基因干擾治療HF提供了新思路。

2.3乙型肝炎 我國每年約有100萬人死于由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)所致肝衰竭、LC和肝癌[24]?？桂げ《镜鞍譇(myxovirus resistant A, MxA)對(duì)HBV等的抗病毒活性較敏感[25]。劉愛平等[26]以超聲輻照在小白鼠肝臟處靶向表達(dá)MxA基因，與其余組相比，超聲+微泡+質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組肝組織內(nèi)可見大量MxA表達(dá)陽性細(xì)胞。Ndc80是細(xì)胞分裂的相關(guān)基因，Ndc80高表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖。Liu等[27]發(fā)現(xiàn)Ndc80在HCC組織中的表達(dá)增加，而在由HBV引起的HCC中增加更為顯著；進(jìn)一步研究顯示，與對(duì)照組相比，敲除Ndc80基因的細(xì)胞可有效抑制HBV復(fù)制，同時(shí)也能抑制與HBV相關(guān)HCC。

3 小結(jié)與展望

UMCG安全性高，靶向性好，轉(zhuǎn)染率高，應(yīng)用前景十分廣闊，可為診療許多疾病提供新的思路和方法。但目前多數(shù)研究仍處于實(shí)驗(yàn)階段，且許多基因治療疾病的機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步觀察。