宋 娟

小菌落突變株（small colony variants，SCV）是一種具有獨(dú)特表型 （生長(zhǎng)率低、菌落形態(tài)不規(guī)則以及生化特性異常）及致病特征，且生長(zhǎng)緩慢的細(xì)菌亞群。自1910年Jacobsen首次在傷寒埃伯澤菌株中發(fā)現(xiàn)SCV現(xiàn)象以來(lái)，人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)許多細(xì)菌如表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌、羊布魯桿菌、大腸埃希菌及淋病奈瑟菌等都具有形成這種SCV的能力。1957年，Jensen[1]首次報(bào)道了金黃色葡萄球菌SCV（金葡菌，SASCV）。20世紀(jì)90年代中期，人們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)臨床許多慢性和復(fù)發(fā)性感染與SASCV的獨(dú)特表型關(guān)系密切[2]，此后國(guó)外學(xué)者們對(duì)SASCV的研究越來(lái)越廣泛深入，但國(guó)內(nèi)的研究極少。本文對(duì)SASCV的形成機(jī)制、臨床相關(guān)感染、診斷和治療進(jìn)行闡述。

1 SASCV形成機(jī)制

目前研究認(rèn)為，SASCV臨床分離株多數(shù)是由于呼吸作用時(shí)合成能量不足所致，主要表現(xiàn)為與呼吸鏈相關(guān)的兩種特異營(yíng)養(yǎng)缺陷類型，即電子傳遞鏈缺陷型和胸腺嘧啶脫氧核苷合成缺陷型。前者又分為甲萘醌營(yíng)養(yǎng)缺陷型和血紅素營(yíng)養(yǎng)缺陷型，主要表現(xiàn)為甲萘醌或血紅素缺陷。該類SASCV的產(chǎn)生與氨基糖苷類抗菌藥物的使用密切相關(guān)。不論體內(nèi)外，在氨基糖苷類藥物存在的情況下，金葡菌形成SCV的概率均顯著提高。胸腺嘧啶脫氧核苷（TD）合成缺陷型SASCV（TDSASCV）是金葡菌對(duì)外源胸腺嘧啶脫氧核苷吸收受阻所致，主要見于長(zhǎng)期應(yīng)用甲氧芐啶-磺胺甲唑（SXT）等磺胺類藥物的病例，該類藥能夠阻止四氫葉酸的合成，而后者是胸腺嘧啶核苷酸合成酶的一個(gè)輔基。此外，還存在其他類型如CO2營(yíng)養(yǎng)缺陷型和營(yíng)養(yǎng)缺陷不明的SASCV分離株。而SASCV臨床分離株有時(shí)可表現(xiàn)為多種營(yíng)養(yǎng)缺陷共存。

因SASCV與其親本株可同時(shí)出現(xiàn)，而SASCV可以快速回復(fù)成野生株表型，且這種轉(zhuǎn)化在體內(nèi)外均可進(jìn)行，故近年來(lái)人們又提出SCV的發(fā)生與金葡菌發(fā)生基因突變有關(guān)。目前，已經(jīng)報(bào)道多種基因（ctaA、menB、menD、hemA、hemB、hemH、mutS、fusA、thyA）的突變均能導(dǎo)致金葡菌出現(xiàn)SASCV表型[3]。

2 SASCV相關(guān)臨床感染性疾病

早期研究發(fā)現(xiàn)，一些非特異性吞噬細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、造骨細(xì)胞、角質(zhì)化細(xì)胞可有效吞噬金葡菌。被吞噬的為正常金葡菌時(shí)，內(nèi)吞作用可迅速破壞裂解細(xì)菌胞體。近年研究發(fā)現(xiàn)[4]，SASCV比相應(yīng)的野生株更能持續(xù)存活于細(xì)胞中，同時(shí)細(xì)胞對(duì)SCV的內(nèi)吞作用可使SCV免受宿主防御系統(tǒng)和抗菌藥物的攻擊。而當(dāng)宿主細(xì)胞形成應(yīng)激的保護(hù)性環(huán)境時(shí)，SCV就會(huì)引起隱性或復(fù)發(fā)性感染。迄今為止，SASCV對(duì)慢性感染疾病的重要意義已達(dá)成共識(shí)，臨床上已報(bào)道與SASCV有關(guān)的感染多種多樣，主要見于以下幾大類疾病。

2.1 髖假體關(guān)節(jié)感染

髖假體關(guān)節(jié)感染（PJI）是全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后一個(gè)嚴(yán)重并發(fā)癥。金葡菌是最重要的感染病原菌之一，尤其是耐甲氧西林金葡菌（MRSA）為PJI治療失敗的因素之一。有研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)和復(fù)發(fā)性的假體關(guān)節(jié)感染多與SASCV密切相關(guān)。Sendi等[5]在一項(xiàng)為期4年的研究中發(fā)現(xiàn)， 83例PJI患者中有5例（6%）在關(guān)節(jié)抽吸物和術(shù)中組織標(biāo)本中培養(yǎng)出SASCV。這些患者在檢出SCV之前存在血流感染史、長(zhǎng)期抗生素應(yīng)用史、髖關(guān)節(jié)翻修術(shù)等情況。此外，值得注意的是，1例患者外周組織的透射電鏡圖像顯示在成纖維細(xì)胞內(nèi)可見細(xì)菌。由于該例患者的SASCV是從滑膜組織標(biāo)本中培養(yǎng)出來(lái)的，故研究者推測(cè)這些細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌很有可能是SASCV，支持了上述假說(shuō)，即SCV在細(xì)胞內(nèi)隱藏，逃離宿主防御系統(tǒng)和抗生素的攻擊，從而導(dǎo)致復(fù)發(fā)性感染。Tande等[6]研究了113例葡萄球菌感染的PJI病例，發(fā)現(xiàn)38例與SCV有關(guān)，其中SASCV10例（26.3%），其他為表皮葡萄球菌SCV23例，頭狀葡萄球菌SCV2例和路鄧葡萄球菌SCV3例。與沒(méi)有SCV檢出的PJI患者相比，SCV患者有較長(zhǎng)的假體關(guān)節(jié)植入史，與上一次手術(shù)間隔時(shí)間較長(zhǎng)，且PJI的臨床癥狀持續(xù)存在。大部分患者以前因PJI做過(guò)手術(shù)，而更多的SCV患者在過(guò)去6個(gè)月內(nèi)至少接受了120 d 的抗生素治療。該研究還指出，金葡菌PJI患者出現(xiàn)治療失敗的可能性會(huì)是非金葡菌感染患者的4倍，但PJI治療失敗是否為SCV感染所致沒(méi)有發(fā)現(xiàn)不同。Sendi等[5]則指出，不管是SCV還是正常金葡菌所致的持續(xù)PJI，在基于MIC值選擇抗菌藥物治療的同時(shí)，建議盡快（6～8周以內(nèi)）移除外來(lái)裝置。

2.2 慢性骨感染

慢性骨感染具有經(jīng)久不愈的骨內(nèi)死腔、深達(dá)骨質(zhì)感染、時(shí)發(fā)時(shí)愈的慢性竇道及大量炎性瘢痕形成的特點(diǎn)，治療不易徹底、反復(fù)遷延不愈、根治困難。1995年，Proctor等[2]自5例慢性骨和/或關(guān)節(jié)感染患者的組織標(biāo)本中培養(yǎng)出了SASCV，且營(yíng)

養(yǎng)缺陷類型各不相同，涉及甲萘醌、血紅素和CO2營(yíng)養(yǎng)缺陷型。臨床數(shù)據(jù)顯示，這些患者對(duì)抗生素治療方案反應(yīng)不佳，故認(rèn)為葡萄球菌慢性骨感染與SCV的形成密切相關(guān)。就骨感染而言，局部慶大霉素治療經(jīng)常被使用，而von Eiff 等[7]在慢性骨髓炎患者局部慶大霉素治療暴露的位置發(fā)現(xiàn)了甲萘醌或血紅素營(yíng)養(yǎng)缺陷型SASCV的生長(zhǎng)，隨后又通過(guò)體外慶大霉素的誘導(dǎo)試驗(yàn)誘導(dǎo)出了SCV，從而提出甲萘醌或血紅素營(yíng)養(yǎng)缺陷型 SASCV的出現(xiàn)可能與氨基糖苷類抗菌藥物的使用有關(guān)。他們還發(fā)現(xiàn)，盡管SASCV體外慶大霉素的藥敏試驗(yàn)判讀為敏感，但其MIC值卻高于親代菌株32倍以上，提示SASCV對(duì)氨基糖苷類的敏感性在降低，Baltch等[8]和 Maduka-Ezeh等[9]研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。對(duì)慢性骨髓炎患者SASCV存在位置的研究，Kalinka等[10]指出金葡菌可以通過(guò)表達(dá)黏附素黏附在骨基質(zhì)上，或進(jìn)入成骨細(xì)胞內(nèi)，在感染的急性期借助骨組織的庇護(hù)逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)和外來(lái)抗菌藥物的攻擊，之后再逐漸形成SCV啟動(dòng)新的感染。Lew等[11]認(rèn)為SASCV存在于死骨碎片內(nèi)，指出慢性骨髓炎患者因血供不足極易形成死骨碎片，金葡菌躲藏在死骨碎片里，抗菌藥物或機(jī)體免疫系統(tǒng)很難作用到死骨碎片中的細(xì)菌，這種情況迫切需要外科手術(shù)來(lái)清除感染。而Archer等[12]和Mitchell等[13]在研究中指出，死骨碎片可能是金葡菌生物膜形成的最佳基礎(chǔ)。形成生物膜的細(xì)菌表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐藥性，其感染易慢性化并難以控制，進(jìn)而促進(jìn)了SCV的發(fā)展。

2.3 囊性纖維化呼吸道感染

囊性纖維化（CF）是一種外分泌腺功能紊亂的遺傳性疾病， 好發(fā)于歐美白色人種，可累及呼吸、消化、內(nèi)分泌、生殖等多個(gè)系統(tǒng)。其中反復(fù)急進(jìn)性的肺部感染為其主要的致死原因。CF患者的呼吸道提供了一個(gè)獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境：嗜中性粒細(xì)胞的吞噬、缺氧、與同時(shí)感染的微生物競(jìng)爭(zhēng)，以及抗生素選擇壓力，這就導(dǎo)致了各種形式的細(xì)菌適應(yīng)，包括SCV的出現(xiàn)[14]。Sparham等[15]最早在CF患者痰標(biāo)本中檢出TD-SASCV，并提出TDSASCV感染可能與SXT的治療有關(guān)。隨后Gilligan等[16]在對(duì)200例CF患者進(jìn)行的研究中發(fā)現(xiàn)有20例（10%）培養(yǎng)出了TD-SASCV，這些患者均有長(zhǎng)期的SXT治療史（至少30.9個(gè)月），且所有TDSASCV菌株的體外藥敏試驗(yàn)顯示對(duì)SXT都耐藥。Kahl等[17]在對(duì)28例金葡菌呼吸道感染的CF患者進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，有19例患者長(zhǎng)達(dá)31個(gè)月都分離出SCV，提示SCV比同源的正常金葡菌更能持續(xù)地存在于真核細(xì)胞內(nèi)。研究亦發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的SCV都是胸苷依賴型或血紅素-胸苷依賴型，SXT的使用與TD-SASCV的出現(xiàn)之間存在關(guān)聯(lián)關(guān)系。而Besier等[18]、Schneider等[19]和Wolter等[20]在研究中除發(fā)現(xiàn)CF呼吸道感染患者SASCV流行率高，大多數(shù)SCV為胸苷依賴型，且與SXT長(zhǎng)期使用相關(guān)外，均指出相比正常金葡菌感染，SCV感染的患者年齡較大，且多與銅綠假單胞菌合并感染，患者的肺功能也會(huì)有更大的下降。Green等[21]還對(duì)SCV出現(xiàn)與CF患者阿奇霉素長(zhǎng)期使用的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了為期6個(gè)月的研究。開始時(shí)260例CF患者中4.1%發(fā)現(xiàn)了SASCV，6個(gè)月后金葡菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的耐藥率顯著增加。但并沒(méi)有新的SCV出現(xiàn)，結(jié)果似乎提示二者并無(wú)關(guān)聯(lián)。然而，以往的研究中SXT誘導(dǎo)和選擇出TD-SASCV多在使用SXT 1年之后，6個(gè)月的阿奇霉素治療似乎對(duì)于SCV的出現(xiàn)來(lái)說(shuō)太短了，可能需要進(jìn)一步延長(zhǎng)觀察時(shí)間。迄今為止，還沒(méi)有任何關(guān)于大環(huán)內(nèi)酯類藥物治療與SCV出現(xiàn)的關(guān)聯(lián)報(bào)道。

2.4 其他感染

2.4.1 心臟相關(guān)植入物的感染 與心臟相關(guān)的外來(lái)異物主要指植入電子裝置[（如永久性心臟起搏器、左心心室輔助裝置（LVAD）]和各種人工瓣膜，隨著這些植入物的使用增加，引發(fā)的感染亦呈上升趨勢(shì)。盡管葡萄球菌是導(dǎo)致這些感染最常見的的病原體，但目前關(guān)于SASCV引發(fā)相關(guān)感染報(bào)道并不多，主要見于起搏器相關(guān)感染[22]和LVAD

相關(guān)感染[23]，而近期關(guān)于金葡菌引發(fā)人工瓣膜感染性心內(nèi)膜炎的多中心報(bào)道并沒(méi)有提到SCV的流行[24]。因金葡菌容易黏附在醫(yī)療植入物或組織表面形成生物膜而致生物膜相關(guān)性疾病，故無(wú)論是何種金葡菌感染，盡快手術(shù)移除感染的外來(lái)裝置才是控制感染的關(guān)鍵所在。

2.4.2 皮膚、黏膜和軟組織感染 關(guān)于葡萄球菌SCV可能是皮膚或黏膜感染病原菌的研究近年來(lái)亦有報(bào)道。von Eiff等[25]在28個(gè)月的時(shí)間內(nèi)反復(fù)從1例毛囊角化病（一種基因性皮膚?。┗颊叩钠つw標(biāo)本中檢出SASCV，且發(fā)現(xiàn)，分離出的SASCV能被體外培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞（一種角質(zhì)形成細(xì)胞）吞噬且持續(xù)存在，抗菌藥物很難清除。另一例疝修補(bǔ)術(shù)患者，術(shù)后13個(gè)月出現(xiàn)了皮下膿腫破潰，竇道形成等慢性肉芽腫性炎癥表現(xiàn)，病原學(xué)培養(yǎng)出一種甲萘醌-血紅素營(yíng)養(yǎng)缺陷型SASCV[26]。1例AIDS患者因車禍導(dǎo)致偏癱后反復(fù)發(fā)作髖部膿腫，病原學(xué)檢出了MRSA-SCV，在采取肌內(nèi)注射治療髖部膿腫2個(gè)月后，仍從血培養(yǎng)、膿腫液培養(yǎng)中檢出SCV。最后患者死亡，尸檢標(biāo)本也檢出SCV，最終確定為TD-SASCV菌株[27]。von Eiff等[28]對(duì)125例AIDS患者進(jìn)行了鼻腔黏膜金葡菌攜帶情況的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)32%患者（40例）鼻腔攜帶金葡菌。盡管40例中只有3例（2.4%）是SASCV，但研究指出AIDS患者鼻腔內(nèi)SCV的定植極有可能是嚴(yán)重感染的來(lái)源，這有待進(jìn)一步研究。

3 SASCV感染的診斷

對(duì)于普通臨床實(shí)驗(yàn)室而言，SCV不尋常的生理、代謝和形態(tài)特征的鑒別具有難度，不但難以識(shí)別，而且更難復(fù)原和存儲(chǔ)。但是，發(fā)現(xiàn)和報(bào)告SCV對(duì)于臨床醫(yī)師來(lái)說(shuō)非常重要。因?yàn)樗鼈兪且环N慢性感染的指示，作為特定治療依據(jù)。對(duì)SASCV感染診斷可從以下幾方面入手。

3.1 選擇高質(zhì)量標(biāo)本

對(duì)于CF患者來(lái)說(shuō)，可使用合格痰標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)；對(duì)于其他相關(guān)感染，建議送檢關(guān)節(jié)抽出物、術(shù)中組織樣本、活檢標(biāo)本或液體標(biāo)本等，應(yīng)杜絕拭子標(biāo)本。如果假體裝置或骨骼被移除，對(duì)其進(jìn)行超聲震蕩處理則能提高SCV的檢出率[29]。

3.2 培養(yǎng)和鑒定

仔細(xì)處理標(biāo)本和選擇合適的瓊脂平皿進(jìn)行培養(yǎng)是SCV診斷的先決條件。葡萄球菌SCV在哥倫比亞血平皿上空氣和二氧化碳環(huán)境中均能生長(zhǎng)，使用葡萄球菌選擇性培養(yǎng)基或顯色培養(yǎng)基反而不生長(zhǎng)或生長(zhǎng)不良，故首選哥倫比亞血平皿。SCV通常在24 h以后，大約48～72 h才能在固體培養(yǎng)基上肉眼可見。其菌落細(xì)小，約為親代正常菌株的1/10，多呈針尖樣（TD-SCV可表現(xiàn)出一種不同尋常的“荷包蛋”樣菌落），無(wú)色素或色素生成明顯減少，缺失或β-溶血能力下降，容易被誤認(rèn)為是生長(zhǎng)緩慢的棒狀桿菌或非溶血性的鏈球菌。此外，它們經(jīng)常與親代菌株混合生長(zhǎng)，表型并不穩(wěn)定，極易恢復(fù)正常表型。由于SCV生長(zhǎng)緩慢，代謝變化大，經(jīng)典生化反應(yīng)缺失或減少，過(guò)氧化氫酶、凝固因子、凝血酶反應(yīng)或其他用于識(shí)別的反應(yīng)也被延遲或缺如，因此，所有基于生化過(guò)程的鑒定方法在SCV中都不可靠，目前主要依靠PCR和基因測(cè)序技術(shù)。已被證實(shí)為金葡菌識(shí)別的分子指標(biāo)如nuc、clfA、eap、coa、sodM等也能很好地識(shí)別SASCV[30]。對(duì)于正常的葡萄球菌表型，16S rRNA特別是rpoB基因序列，對(duì)于最終確定種和亞種非常有用。然而，鑒定葡萄球菌SCV，必須考慮已知公共序列數(shù)據(jù)庫(kù)的局限性[31]。

3.3 藥敏試驗(yàn)

由于SCV的低生長(zhǎng)率和低代謝率，各種常規(guī)方法檢測(cè)其對(duì)抗生素的敏感性存在困難或不能完成。因此，盡管傳統(tǒng)的方法（瓊脂擴(kuò)散法或E 試驗(yàn)）可以提供SCV對(duì)抗生素敏感與否的證據(jù)，但應(yīng)保證細(xì)菌必須在瓊脂平皿上生長(zhǎng)足夠的時(shí)間（3～5 d），更要謹(jǐn)慎地評(píng)估其MIC數(shù)據(jù)。因SCV是在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中被誘導(dǎo)和選擇的，故一些體外細(xì)胞培養(yǎng)模型被用來(lái)進(jìn)一步研究SCV在細(xì)胞內(nèi)的抗藥性[32]。綜合起來(lái)，這些模型結(jié)果顯示，所有抗菌藥物在細(xì)胞內(nèi)對(duì)正常菌株的活性都比對(duì)SCV菌株高，提示在宿主細(xì)胞內(nèi)，SCV對(duì)藥物治療具有更高的耐受性，臨床在治療SCV感染時(shí)要充分考慮到這些因素。

4 SASCV感染的治療

目前對(duì)葡萄球菌SCV感染的最佳治療方法尚不清楚，但臨床在選擇治療方案時(shí)應(yīng)綜合考慮以下問(wèn)題：①SCV營(yíng)養(yǎng)缺陷的類型；②SCV在宿主細(xì)胞內(nèi)的位置；③SCV和∕或親代菌株藥敏試驗(yàn)的結(jié)果。此外，還必須考慮各感染部位的藥動(dòng)學(xué) /藥效學(xué)（PK/PD）數(shù)據(jù)等[33]。而理想的抗SCV藥物，不但要具有能夠穿透細(xì)胞膜進(jìn)入SCV所在宿主細(xì)胞內(nèi)的能力，還能在胞內(nèi)保持殺滅這種緩慢生長(zhǎng)表型細(xì)菌的抗菌活性。利福平是能夠滿足這些要求的抗葡萄球菌藥物，但利福平單藥使用將很快出現(xiàn)高水平耐藥，故建議聯(lián)合其他一種或多種敏感的抗生素共同治療SCV。Baltch等[8]的報(bào)道指出，將達(dá)托霉素、利福平及慶大霉素三者合用或達(dá)托霉素-利福平或慶大霉素-利福平二者配伍使用對(duì)清除人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞內(nèi)的SASCV效果最為明顯。Sendi等[5]則將左氧氟沙星與利福平聯(lián)合使用，成功治愈了5例由SASCV引起的髖關(guān)節(jié)假體感染患者。而對(duì)于MRSA-SCV感染，糖肽類藥物萬(wàn)古霉素原則上應(yīng)是首選，但Garcia 等[34]指出萬(wàn)古霉素不能殺死SCV ，Lenhard等[35]的實(shí)驗(yàn)研究也表明萬(wàn)古霉素有利于SCV亞群的形成。因此，在已證實(shí)或可能發(fā)生MRSA-SCV的持續(xù)感染時(shí)，建議使用具有抗MRSA活性的其他替代藥物。

總之，SASCV所致的慢性感染極為棘手，給微生物室和臨床均帶來(lái)了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。實(shí)驗(yàn)室人員要加強(qiáng)學(xué)習(xí)，不斷提高對(duì)SCV菌株的分離、鑒定及藥敏能力；臨床醫(yī)師不但要對(duì)已發(fā)生的SASCV感染采取積極的治療（如盡快移除感染的植入裝置、選擇敏感抗菌藥物持續(xù)治療等），還要對(duì)潛在的感染進(jìn)行有效的預(yù)防，從而減少SASCV感染的發(fā)生。