李樹民,鮑文華,趙艷景,馬雪梅,楊曉東,梁姍姍

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯154002)

肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是一種病因復雜，發(fā)病機制尚不十分明確的肺部間質(zhì)性疾病，近年來發(fā)病率、死亡率均逐年增高。其主要病理改變呈現(xiàn)為彌漫性肺泡炎及肺成纖維細胞灶形成、細胞外基質(zhì)過度沉積[1]。前期試驗中針對CCR6-CCL20軸、Th9細胞相關因子與肺纖維化發(fā)生機制的關系已有所研究[2，3]，而近年來有關Th17/Treg失衡的研究備受關注。相關文獻[4]指出自身免疫性疾病發(fā)生的重要原因之一為Th17/Treg比例失衡，Th17 與Treg之間保持動態(tài)平衡對于機體內(nèi)環(huán)境的維持意義重大。本研究擬通過建立大鼠肺纖維化模型，觀察CCR6、Th9相關因子及Th17/Treg失衡在大鼠肺纖維化模型的肺組織中變化特點，探究CCR6、Th9相關因子和Th17/Treg比例失衡與肺纖維化發(fā)病機制的關系和意義，為臨床治療肺纖維化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物與試劑63只SD大鼠(健康雄性清潔級)，體重約( 220±30) g，購買于大連醫(yī)科大學實驗動物中心，清潔級標準飼養(yǎng)(合格證號:scxle(黑) 2013007)；鹽酸博來霉素(美國Invitrogen公司)；地塞米松注射液(購置于輝瑞制藥有限公司)；10%水合氯醛、乙醇、蒸餾水等(天津化學試劑三廠生產(chǎn))；Anti-CCR6 antibody一抗、SP二抗(美國abcam公司)；IL-9抗體(Abcam公司提供)； PE-Cy5 anti-Rat CD4(大鼠抗小鼠 CD4單克隆流式抗體，美國BDP harmingen);PE anti-mouse IL-17及同型對照(大鼠抗小鼠 IL-17單克隆抗體，美國 BDPharmingen )；PE anti-rat Foxp3(大鼠抗小鼠Foxp3 單克隆抗體)及同型對照(美國ebioscience)；Cat15596-026(Invitrogen)；Trizol溶液，DNA純化試劑盒:引物(TaKaRa合成)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Cat K1622 購自Fermentas公司)；RT-PCR試劑盒、Trizol試劑、SYBR Green熒光定量 PCR試劑盒( Hai Gene);DAB顯色試劑盒(中杉金橋)。

1.2動物分組按隨機數(shù)字表將63只雄性SD大鼠分為三組:生理鹽水對照組(N組)、肺纖維化模型組(F組)、地塞米松治療組(D組)，每組各21只。

1.3制作模型及標本采集以10%水合氯醛溶液(0.30 ml/100 g)腹腔注射麻醉，將大鼠以仰臥姿勢固定在鼠板上后，頸部備皮消毒，沿正中線剪開頸部皮膚，分離組織充分暴露氣管，F(xiàn)、D組快速推入BLM(0.50 mg/100 g)于大鼠氣管分叉處，N組注入同體積等滲生理鹽水。然后將大鼠直立，以及迅速順逆時針旋轉(zhuǎn)鼠板，皮膚縫合，清潔級飼養(yǎng)。從第2 d開始，D組大鼠每日給予腹腔內(nèi)注射地塞米松( 0.3 mg/100 g)，N、F組注入同體積生理鹽水。分別在造模后第 7、14及28 d,采用隨機方式從三組大鼠中各抽取7只，處死后留取肺組織。

1.4肺組織病理改變對留取的各組肺組織行HE染色，觀察肺組織炎癥程度及纖維化程度變化。

1.5檢測肺組織CCR6、IL-9表達水平采用免疫組化法檢測各組肺組織CCR6、IL-9表達水平，肺組織胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒提示切片陽性結果；胞質(zhì)中無棕黃色反應物提示陰性結果(細胞核染色為藍色)。據(jù)Hwang I等學者[5]研究標準，400倍顯微鏡下取景，使用image proplus系統(tǒng)( 細胞圖像分析) 方法對陽性結果的平均灰度值行數(shù)值評分。

1.6檢測PU.1mRNA離心BALF，留取沉淀,Trizol法提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，熒光PCR法檢測PU.1mRNA表達水平，引物序列：PU.1:(上游)5′-TGCTTCCCTTATCCACCCTTG-3′(下游) 5′-TCTTCTTGCTGCCTGTCTCC-3′；GAPDH:(上游)5′-AACTCCCATTCTTCCACCTTT-3 ′(下游)5 ′-CTCTTGCTCTCAGTATCCTTG -3′。

1.7肺組織Th17、Treg細胞表達檢測采用流式細胞術方法檢查分析肺組織Th17、Treg細胞表達情況。

2 結果

2.1顯微鏡下觀察HE染色肺組織病理改變N 組大鼠呈現(xiàn)正常肺泡及肺間質(zhì)結構，無炎癥細胞及纖維蛋白沉積。F組、D組鏡下病理改變基本相似，與N組對比，B組大鼠第7 d肺組織出現(xiàn)顯著炎癥細胞浸潤，如中性粒細胞、單核巨噬細胞等，肺間質(zhì)充血、水腫，成纖維細胞計數(shù)增多；第14 d、第21 d肺組織炎癥逐漸吸收，成纖維細胞逐漸增多，膠原纖維逐漸增生、沉積，肺泡間隔逐漸增寬，肺泡逐漸萎縮、消失。但無論是肺組織炎癥浸潤程度，還是纖維蛋白沉積程度，同一時間點，D組較F組肺組織病變嚴重程度有所減輕。

2.2檢測各組大鼠肺組織中CCR6、Th9相關因子、Th17及Treg細胞表達水平

與N組相比，F(xiàn)、D組各時間點檢測指標CCR6、PU.1mRNA、IL-9蛋白質(zhì)含量、Th17細胞百分率結果明顯增高(P<0.05)，具有統(tǒng)計學意義。檢測結果于第 7 d時達到最高值，第14 d、第28 d呈現(xiàn)逐漸降低趨勢，但總體上仍高于N組。D組、F 組兩組變化趨勢相似，但D組檢測結果低于同時間點F組值、明顯高于N組值，差異存在統(tǒng)計學意義(P<0.05)。F、D組各時間點Treg細胞百分比與N組相比結果降低(P<0.05)，有統(tǒng)計學意義，并且結果呈現(xiàn)逐漸降低。見表1。

表1 不同時期三組大鼠肺組織各指標表達情況

注：與N組比較，&P<0.05；與F組比較，@P<0.05

2.3CCR6細胞表達量與IL-9、Th17、Treg細胞計數(shù)、Th17/Treg比例相關性的分析CCR6、Th9、PU.1mRNA表達水平與Th17有顯著正相關性，與Treg有顯著負相關(P均<0.01),見表2。

表2 相關r值

3 討論

PF好發(fā)人群多為老年人，作為一種慢性呼吸道疾病間質(zhì)性改變，早期以肺部炎癥性改變，晚期以纖維蛋白沉積、肺組織纖維化病理表現(xiàn)為主，患者多以呼吸困難、干咳為主要癥狀，活動后加重，晚期嚴重乏氧，心肺功能降低，嚴重影響生活質(zhì)量，被稱為不死的癌癥。目前發(fā)病機制尚未完全明確。本研究以Th17/Treg 失衡為切入點，分析前期研究中趨化因子受體CCR6、Th9相關因子與Th17/Treg 失衡在肺纖維化發(fā)病機制中的關系。

2005年,Harrington[6]等人提出Th17(CD4+-IL-17+輔助性T細胞)細胞是一種CD4+效應性T細胞亞群在介導炎癥反應中起到重要的作用，在炎癥狀態(tài)下CCR6可趨化Thl7細胞至肺部、皮膚等其他組織[7]；Th17細胞，由TGF-β和IL-6、IL-23介導下激活STAT3通路誘導高表達特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt，從而分泌IL-17,通過CCR6/CCL20趨化軸，被誘導至病變組織部位，激發(fā)炎癥反應[8,9]，本次研究中發(fā)現(xiàn)，與N組相比，F(xiàn)、D兩組各時期CCR6、Th17指標結果明顯增高，由于第7 d時大鼠肺纖維化模型炎癥反應最明顯，故檢測結果在此時達到最高值，并且CCR6與Th17呈正相關，說明Th17可能通過與趨化因子受體CCR6相互作用參與肺纖維化發(fā)病過程。與鮑文華[10-11、2]等人關于Th17細胞對肺纖維化大鼠模型中的表達及意義研究一致。

CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)是對炎癥反應起拮抗作用的另一特殊類型T細胞，在維護免疫平衡及調(diào)節(jié)機體炎癥反應中起到重要作用。Sayour EJ等[12,13]學者認為Treg與特發(fā)性肺纖維化以及化學因素誘導的肺纖維化密切相關。大量實驗研究證實多種疾病例如自身免疫性疾病、腫瘤、炎癥反應以及移植排斥等的發(fā)生發(fā)展與Th17、TH1/TH2及Treg細胞亞群之間相互作用有關。正常機體內(nèi)存在著Th17/Treg動態(tài)平衡，Th17/Treg失衡可促進自身免疫性疾病炎癥反應的發(fā)生[14]。而關于Th17/Treg 失衡與肺纖維化發(fā)病機制的研究甚少。賴小映，鐘小寧[15]認為Th17/Treg失衡可能加重肺纖維化免疫炎癥，促進肺部膠原纖維的沉積。CCR6主要由朗漢斯細胞，記憶性T細胞、B細胞、CD+25CD+4調(diào)節(jié)T細胞表達，CCR6與CCL20結合后，可募集未成熟樹突狀細胞(DCs)、專職的抗原提呈細胞(APCs)、成熟DCs至炎癥反應部位[16]。本研究結果顯示F、D兩組相對于N組各時期Treg細胞百分比降低、Th17/Treg比值結果增高，并且CCR6與Treg相關性分析呈負相關、與Th17/Treg呈正相關，推斷CCR6可能參與Th17/Treg細胞失衡致大鼠肺纖維化的形成過程。

TH9細胞是以分泌IL-9、IL-10細胞因子為主的新型 CD4+T 細胞亞群，VeldhoenM,、DardalhonV[17,18]等人證實了“Th9”細胞，為已有的包括輔助性T細胞1型(Thelpercell1,Th1)、2型(Th2)、Th17和Treg在內(nèi)的Th細胞亞群添加新成員。PU.1作為Th9細胞特異的轉(zhuǎn)錄因子，通過IL-9 基因組蛋白乙酰化從而促進 Th9 細胞表達[19]。TH9細胞參與機體多種炎癥反應性疾病，如支氣管哮喘、過敏性鼻炎、潰瘍性結腸炎、多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等。本研究指出B、D兩組相對于N組各時期IL-9、Th17/Treg比值結果明顯增高，并且IL-9與Th17/Treg相關性分析呈正相關，提示TH9細胞可能參與肺纖維化Th17/Treg失衡理論的調(diào)節(jié)機制。Veldhoen M[20]等在研究Th9細胞的功能時發(fā)現(xiàn)，存在RAG-1缺陷小鼠，即便缺失Treg細胞,也可通過來源于Th9細胞的IL-9作用于Treg細胞，同時發(fā)揮促炎功能使組織炎性反應更加嚴重。與本實驗研究結果相似。

總之，與對照組比較，CCR6、Th9相關因子、Th17、Th17/Treg在大鼠肺纖維化模型組中肺組織表達量顯著增高，與肺部炎癥、纖維化程度密切正相關,Treg細胞百分率降低；CCR6、Th9相關因子與Th17相關性分析為正相關，與Treg細胞相關性分析呈負相關；故如何通過抑制CCR6細胞、Th9相關因子分泌及有效調(diào)節(jié)Th17/Treg細胞平衡，從而控制炎癥反應，調(diào)節(jié)機體的免疫狀態(tài)，將為肺纖維化臨床治療提供新的研究方向。

[1]King TJ,Pardo A,Selman M.Idiopathic pulmonary fibrosis[J].Lancet,2011,378(9807):1949．

[2]李樹民,鮑文華,王鳳玲,等.CCR6-CCL20趨化軸在TH17細胞介導的肺纖維化大鼠肺組織中作用機制的研究[J].臨床肺科雜志,2015,20(12):2177．

[3]鮑文華,王瑾,李樹民,等.Th9細胞相關因子在肺纖維化大鼠中的作用[J].中國呼吸與危重監(jiān)護雜志,2016,15(3):227.

[4] Eastaff-Leung N,Mabarrack N,Barbour A,et al.Foxp3+regula-tory T cells,Th17 effector cells,and cytokine environment in in-flammatory bowel disease[J].J Clin Immunol,2010,30 (1):80．

[5]Hwang I,An BS,Yang H,et al.Tissue-specific expression of oc-cludin，zona occludens-1,and junction adhesion molecule A inthe duodenum，ielum，colon，kidney，liver,lung,brain,andskeletal muscle of C57BL mice[J].J Physiol Pharmacol，2013,64(1):11．

[6]Harrington LE,Hatton RD,Mangan PR,et al.Interleukin 17-producing CD4+ effector T c- ells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages[J].Nat Immuno,l 2005,6(11):1123.

[7]Singh SP,Zhang HH,Foley JF,et al.Human T cells that are able to produce IL-17 express the chemokine receptor CCR6[J].J Immunol,2008,180(1):214.

[8]Stockinger B,Veldhoen M,Martin B.Thl7 T cells:Linking innate and adaptive immunity[J].Semin Immunol,2007,19(6):353.

[9]Hirota K,Yoshitomi H,Hashimoto M.Preferential recruitment of CCR6-expressing Thl7 cells to inflamed joints via CCL20 in rheumatoid arthritis and its animal model[J].J Exp Med,2007,204(12):2803.

[10]于永江,李樹民,鮑文華,等.TH17細胞、IL-21因子在鼠肺纖維化中的表達及意義[J].中國實驗診斷學,2013,17(7):1176．

[11]李樹民,鮑文華,穆曉春,等.TH17細胞在肺纖維化大鼠模型中的表達[J].重慶醫(yī)科大學學報,2013,38(7):780．

[12]Sayour EJ,Mc Lendon P,Mc Lendon R,et al.Increased proportion of Fox P3+ regulatory T cells in tumor infiltrating lymphocytes is associated with tumor recurrence and reduced survival in patients with glioblastoma[J].Cancer Immunol Immunother， 2015，64(4):419.

[13] Lo Re S,Lison D,Huaux F.CD4+ T lymphocytes in lung fibrosis:diverse subsets,diverse functions[J].J Leukoc Biol，2013，93(4):499.

[14]Afzali B,Lombardi G,Lechler RI,et al.The role of T helper 17(Th17) and regulatory T cells(Treg) in human organ transplanta-tion and autoimmune disease[J].Clinical Exp Immunol,2007,148(1):32．

[15]賴小映,鐘小寧.Th17、Treg 在肺纖維化小鼠外周血、肺組織中的表達及意義[J].山東醫(yī)藥,2013,53(19):1．

[16]Rumbo M，Sierro F，Debard N，et al．Lymphotoxin beta receptor sig-naling inducers the chemokine CCL20 in intestinal epitheliu [J].Gastroenterology,2004,127(1):213．

[17]VeldhoenM,UyttenhoveC,SnickVJ,et al.Transforminggrowthfac-tor-beta`reprograms' thedifferentiationofThelper 2cellsandpro-motesaninterleukin 9-producingsubset[J].Natimmunol,2008,9(12):1341.

[18]DardalhonV,AwasthiA,KwonH,et al.IL-4inhibitsTGF-beta-in-ducedFoxp3+ Tcellsand,togetherwithTGF-beta,generatesIL-9+IL-10+ Foxp3(-)effectorT cells[J].NatImmunol,2008,9(12):1347.

[19]Goswami R，Kaplan MH.Gcn5 is required for PU.1-dependentIL-9 induction in Th9 cells[J]．J Immunol，2012，189:3026．

[20] Veldhoen M,Uyttenhove C,van Snick J,et al.Transforminggrowth factor-beta reprograms the differentiation of T helper 2cells and promotes an interleukin 9-producing subset[J].Nat Im-munol,2008,9(12):1341.