孫延文，謝文兵，劉秀霞，常 宇，潘利華，于 庭*

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130041；2.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所，吉林 長(zhǎng)春130022)

標(biāo)記免疫分析是將高度靈敏的標(biāo)記示蹤技術(shù)與高度特異性的抗原抗體反應(yīng)相結(jié)合的分析技術(shù)。其中時(shí)間分辨熒光免疫分析結(jié)合能量共振轉(zhuǎn)移理論構(gòu)成了均相時(shí)間分辨熒光免疫分析(HTRF)。與異相免疫分析相比，均相免疫分析不需要繁瑣的分離步驟，更符合現(xiàn)代自動(dòng)化快速檢測(cè)的要求。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、臨床診斷、藥物篩查等領(lǐng)域[1,2]。

為了建立HTRF，通過一系列反應(yīng)合成銪螯合劑(Eu3+?2,6-{N,N’,N,N’-[二(2,2’-聯(lián)吡啶-6,6’-二甲基)]二(氨甲基)}-吡啶-二羧酸)，標(biāo)記甲胎蛋白單克隆抗體(AFP-McAb)，并對(duì)標(biāo)記抗體的標(biāo)記效果進(jìn)行研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

高效HTRF分析儀(BMG RUBYstar)、MK3型酶標(biāo)儀(Thermo)、超微量分光光度計(jì)(Thermo)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)(Thermo)、AFP-McAb M0110(南京京達(dá)生物公司)、HRP標(biāo)記羊抗鼠抗體(Jackson)。

1.2抗體標(biāo)記過程

1.2.1配制溶液 稱取銪螯合劑、EDC和NHS,配制成濃度分別為0.5、25、7.5 mg/ml的水溶液。

1.2.2銪螯合劑的活化 將99 μl EDC溶液加入到99 μl NHS溶液中混勻，再加入到238 μl的銪螯合劑溶液中，間隔混勻數(shù)次，室溫反應(yīng)24 h。

1.2.3偶聯(lián)抗體 加入PH7.4 10 mM PBS，調(diào)節(jié)PH為7，將400 μg AFP-McAb分三次加入到活化的銪螯合劑中，間隔混勻數(shù)次，4℃反應(yīng)24 h。

1.2.4透析 將標(biāo)記的AFP-McAb在PH7.4 10 mM PBS中進(jìn)行透析，每隔4 h換液一次，次日將透析后的標(biāo)記抗體移取至EP管中，經(jīng)超微量分光光度計(jì)測(cè)定抗體濃度并保存。

1.3熒光強(qiáng)度的測(cè)定

銪螯合劑溶液濃度調(diào)至5×10-4mg/ml，進(jìn)行2倍系列稀釋，標(biāo)記抗體按照1∶10、100、1 000進(jìn)行稀釋，50 μl/孔，加入到96孔全白酶標(biāo)板中，設(shè)定復(fù)孔，在高效HTRF分析儀上測(cè)定620 nm處熒光強(qiáng)度。

1.4免疫活性的測(cè)定

用PH9.6 50mM碳酸鹽緩沖溶液分別配制濃度為1.5、1.0、0.5 μg /ml的AFP溶液，加入到96孔酶標(biāo)板中，100 μl/孔包被，4℃過夜。次日，用0.01 M PBST溶液，250 μl/孔，沖洗3次，拍干；加入封閉液200 μl/孔，37℃封閉2 h ；棄掉孔內(nèi)液體，拍干備用。

標(biāo)記抗體與未標(biāo)記抗體的起始濃度調(diào)整一致，分別1∶1 000稀釋，再依次3倍梯度稀釋；分別加入到包被板中，100 μl/孔，設(shè)定對(duì)照，37℃孵育0.5 h；棄掉孔內(nèi)液體，加0.01 M PBST溶液250 μl/孔，沖洗3次，拍干；加入酶標(biāo)二抗100 μl /孔，37℃孵育0.5 h；棄掉孔內(nèi)液體，用0.01M PBST溶液250 μl/孔，沖洗5次，拍干；加顯色液100 μl/孔，37℃孵育10 min；加入終止液50 μl/孔；在酶標(biāo)儀上進(jìn)行檢測(cè)，讀取OD值。

2 結(jié)果

2.1銪螯合劑的特點(diǎn)

銪螯合劑的結(jié)構(gòu)式如圖1所示，它是雙功能穴狀螯合劑。該銪螯合劑含有吡啶-2,2-聯(lián)吡啶結(jié)構(gòu)，通過共價(jià)形式將銪離子包繞在內(nèi)，當(dāng)受到激發(fā)時(shí)，該結(jié)構(gòu)可俘獲能量，通過分子結(jié)構(gòu)內(nèi)能量轉(zhuǎn)移將部分能量轉(zhuǎn)移給銪離子，使其發(fā)出相應(yīng)的熒光。該銪螯合劑的激發(fā)光譜是250-340 nm，發(fā)射光譜是620±10 nm，斯托克斯位移達(dá)290 nm，熒光壽命達(dá)900 μs。它帶有兩個(gè)羧基基團(tuán)，在偶聯(lián)劑的作用下偶聯(lián)抗體上的氨基，標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上。

圖1 銪螯合劑結(jié)構(gòu)式

2.2銪螯合劑的熒光強(qiáng)度

銪螯合劑溶液系列稀釋測(cè)定熒光強(qiáng)度，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合，如表1和圖2所示，隨著銪螯合劑濃度的減小，熒光強(qiáng)度也隨之減小，線性方程為Y=5.05×108X-475(R2=0.999 3)。

表1 銪螯合劑系列稀釋溶液的熒光強(qiáng)度

圖2 銪螯合劑溶液濃度與其熒光強(qiáng)度的關(guān)系

2.3標(biāo)記抗體的熒光強(qiáng)度

標(biāo)記前后AFP-McAb的濃度，如表2所示。根據(jù)標(biāo)記抗體的熒光強(qiáng)度計(jì)算回收率和標(biāo)記率，如表3所示。回收率=標(biāo)記抗體(mg/ml)×標(biāo)記后體積(ml)÷抗體投入量(mg) 。標(biāo)記率=標(biāo)記抗體上銪螯合劑的摩爾濃度÷標(biāo)記抗體的摩爾濃度。AFP-McAb的回收率為94%，標(biāo)記率為15。

表2 標(biāo)記前后抗體的量

表3 標(biāo)記抗體的熒光強(qiáng)度

2.4標(biāo)記抗體免疫活性

探究銪螯合劑標(biāo)記對(duì)AFP-McAb免疫活性的影響，首先確定最佳包被濃度。如圖3所示，不同濃度的AFP溶液分別進(jìn)行包被，隨著抗體濃度的增加，OD值逐漸增大，當(dāng)抗體濃度大于6.9×10-6mg/ml時(shí)，OD值逐漸達(dá)最大值；同濃度抗體反應(yīng)時(shí)，隨著包被抗原濃度的增加，OD值也相應(yīng)增大。結(jié)果表明最小包被濃度0.5 μg /ml可滿足抗體免疫活性的檢測(cè)。

圖3 甲胎蛋白最佳包被濃度的確定

圖4 標(biāo)記抗體與未標(biāo)記抗體免疫活性的比較

結(jié)合以上數(shù)據(jù)，調(diào)整AFP包被濃度和稀釋比例重新測(cè)定并作圖。如圖4所示，隨著抗體濃度的減小，OD值逐漸減??；同濃度的標(biāo)記抗體與未標(biāo)記抗體相比，OD值未見明顯變化。

3 討論

稀土螯合劑的標(biāo)記是建立HTRF方法的關(guān)鍵部分。與傳統(tǒng)的熒光標(biāo)記物質(zhì)相比，稀土螯合劑的激發(fā)光譜寬，發(fā)射光譜窄而尖銳，斯托克斯位移大，而且其熒光壽命長(zhǎng)，是傳統(tǒng)熒光的1000多倍，利用時(shí)間分辨技術(shù)可有效地消除激發(fā)光及本底自發(fā)熒光的干擾，提高了檢測(cè)的靈敏度。

稀土螯合劑作為重要的標(biāo)記示蹤物質(zhì)，廣泛應(yīng)用于HTRF中。在細(xì)胞凋亡領(lǐng)域，利用鋱螯合劑標(biāo)記組氨酸抗體作為能量供體，熒光素標(biāo)記Smac蛋白作為能量受體，研究X連鎖凋亡抑制蛋白的作用機(jī)制[3]。在疾病感染方面，利用銪螯合劑和Alexa Fluor647熒光染料，結(jié)合protein L的特點(diǎn)建立HTRF的方法，用于急性漢坦病毒感染[4]和布氏桿菌感染的血清學(xué)檢測(cè)。還有研究利用銪螯合劑檢測(cè)絲氨酸/蘇氨酸在蛋白質(zhì)磷酸化過程中的作用機(jī)制[5]。

甲胎蛋白是一種分子量約為70 kD的糖蛋白，主要在胎兒的卵黃囊和肝臟細(xì)胞內(nèi)合成。在一些惡性腫瘤患者的血清中，AFP含量升高，尤其在原發(fā)性肝癌患者血清中，其含量升高更為顯著。目前，AFP已成為早期輔助診斷原發(fā)性肝癌的重要血清標(biāo)志物，對(duì)疾病的監(jiān)測(cè)以及治療具有指導(dǎo)作用。

臨床檢測(cè)AFP的方法有放射免疫分析、酶聯(lián)免疫分析、膠體金法、化學(xué)發(fā)光免疫分析等。傳統(tǒng)的熒光、放射以及酶聯(lián)免疫分析并未達(dá)到靈敏度高、試劑穩(wěn)定、線性范圍寬等要求，化學(xué)發(fā)光免疫分析雖具有以上優(yōu)點(diǎn)，但其發(fā)光時(shí)間短、受反應(yīng)環(huán)境的影響，而HTRF由于結(jié)合了時(shí)間分辨和能量共振轉(zhuǎn)移理論，除具有以上優(yōu)點(diǎn)外，還具有操作簡(jiǎn)便、可重復(fù)檢測(cè)、不受環(huán)境影響等特點(diǎn)。

該銪螯合劑對(duì)AFP-McAb標(biāo)記的過程中，根據(jù)銪螯合劑溶液濃度與其熒光強(qiáng)度之間的線性關(guān)系(R2=0.9993)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算標(biāo)記抗體中銪螯合劑的摩爾濃度，再依公式計(jì)算出標(biāo)記率。標(biāo)記率的高低會(huì)影響檢測(cè)的靈敏度。通常抗體的標(biāo)記率Eu3+/IgG在5-15個(gè)較為理想[6]。標(biāo)記過程中，偶聯(lián)反應(yīng)的比例、時(shí)間、酸堿度等都可能會(huì)影響抗體的標(biāo)記率。但是，抗體的標(biāo)記率并不是越高越好，其值越高，熒光強(qiáng)度越高，會(huì)造成本底的升高，降低檢測(cè)的靈敏度，也會(huì)影響抗體的免疫活性。低標(biāo)記率抗體可能更有利于HTRF的建立，這還需進(jìn)一步的研究。

AFP-McAb是免疫球蛋白，作為有機(jī)分子的稀土螯合劑標(biāo)記在抗體上會(huì)改變抗體的結(jié)構(gòu)，造成抗體之間的交聯(lián)，從而影響抗體的免疫學(xué)活性。而該銪螯合劑的分子量為738，其分子量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于AFP-McAb的分子量(150 kD)，所以在一定標(biāo)記率的情況下，該銪螯合劑對(duì)抗體的空間結(jié)構(gòu)影響是有限的，其標(biāo)記反應(yīng)條件也較為溫和，進(jìn)而對(duì)免疫活性影響較小。

因此，通過對(duì)標(biāo)記過程中標(biāo)記率、熒光強(qiáng)度以及免疫活性的研究，該自合成的銪螯合劑對(duì)甲胎蛋白單克隆抗體的標(biāo)記效果較為理想，可以進(jìn)一步用于均相時(shí)間分辨熒光免疫分析的建立。

[1]Blanc E，Wagner P，Plaisier F，et al.Design and validation of a homogeneous time-resolved fluorescence cell-based assay targeting the ligand-gated ion channel 5-HT3A[J].Analytical Biochemistry，2015，484：105.

[2]Farino ZJ，Morgenstern TJ，Vallaghe J，et al.Development of a rapid lnsulin assay by homogenous time-resolved fluorescence[J].Plos One，2016，11(2)：e0148684.

[3]Chaudhry C，Davis J，Zhang Y，et al.Building homogeneous time-resolved fluorescence resonance energy transfer assays for characterization of bivalent inhibitors of an inhibitor of apoptosis protein target[J].Analytical Biochemistry，2016，497：8.

[4]Hepojoki S，Hepojoki J，Hedman K，et al.Rapid homogeneous lmmunoassay based on time-resolved F?rster resonance energy transfer for serodiagnosis of acute hantavirus lnfection[J].Journal of Clinical Microbiology，2015，53(2)：636.

[5]Alpha-Bazin B，Quéméneur E，Chem A.Antibody-free detection of phosphoserine/threonine containing peptides by homogeneous time-resolved fluorescence[J].Analytical Chemistry，2012，84(22)：9963.

[6]吳英松，李 明，編.時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)[M].北京：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，2008：24-25.