豐文雯 吳山功 郝耀彤 李文祥 李 明 鄒 紅 王桂堂

(1. 中國科學院水生生物研究所, 農業(yè)部水產養(yǎng)殖病害防控重點實驗室, 淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072;2. 中國科學院大學, 北京 100049)

在魚類生長發(fā)育過程中, 腸道內逐漸形成由好氧細菌、兼性厭氧細菌和專性厭氧細菌組成的動態(tài)穩(wěn)定正常菌群[1,2]。研究證明腸道菌群在魚類食物消化、營養(yǎng)吸收、疾病發(fā)生及防治上有重要作用[3]。因此, 近年來腸道微生物受到了越來越多的關注?；诜肿由飳W技術的方法, 例如DNA芯片技術[4]、熒光原位雜交技術[5]、宏基因組學技術[6]等, 能全面分析腸道微生物的種類、豐度信息。但多數腸道微生物是不可培養(yǎng)的, 尤其是腸道為厭氧和微厭氧的環(huán)境, 厭氧細菌對營養(yǎng)條件、培養(yǎng)環(huán)境等要求苛刻, 更難以培養(yǎng), 而獲得純培養(yǎng)的細菌是進行微生物功能研究的關鍵一步。目前, 我們對魚類消化道微生物的認識是不充分的。

草魚(Ctenopharyngodon idellus)是全球水產養(yǎng)殖產量最大的一個品種, 2015年, 我國草魚產量達到5.68×109kg, 占淡水水產品養(yǎng)殖總量的18.54%[7]。目前, 草魚腸道微生物受到了廣泛關注, 吳山功等[8]利用DGGE和T-RFLP技術研究了草魚腸道內容物微生物種類及其與環(huán)境的關系, Tran等[9]利用高通量測序方法研究了草魚腸道黏膜上的微生物類群,此外, 16S rRNA克隆文庫也被用于草魚腸道內容物微生物結構的研究[10]。這些研究都是基于分子生物學方法, 而草魚消化道微生物的分離培養(yǎng)也有不少文獻報道, 例如王微微等[11]采用羧甲基纖維素瓊脂培養(yǎng)基篩選草魚腸道中的纖維素降解細菌, Sugita等[12]采用7種不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)草魚腸道微生物,探究其與宿主草魚之間的關系。以上結果都是在有氧條件下獲得的, Trust等[13]1979年首次分離出草魚腸道專性厭氧微生物, 主要為擬桿菌屬(Bacteroides)、放線菌屬(Actinomyces)、梭菌屬(Clostridium)、梭形桿菌屬(Fusobacterium)、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus), 但他們的工作沒有區(qū)分腸道黏膜和腸道內容物中的細菌。腸道黏膜上的微生物被認為是固有微生物[14], 固有微生物在維持個體正常生理活動中起重要作用[3]。

本研究以饑餓2個月的草魚腸道黏膜為材料,采用傳統(tǒng)厭氧微生物培養(yǎng)方法對草魚腸道黏膜固有微生物進行了分離鑒定, 以期建立魚類腸道厭氧微生物的培養(yǎng)方法, 為豐富草魚消化道可培養(yǎng)微生物種類及其功能研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗培養(yǎng)基

BHIA腦心浸液培養(yǎng)基(青島海博生物)的配制方法: 稱取18.5 g腦心浸液培養(yǎng)基溶于500 mL去離子水, 加入0.1%刃天青(上海源葉生物)0.4 mL, 加熱煮沸10min, 再加入5 g瓊脂。待瓊脂完全溶化后,加入0.25 g L-半胱氨酸(中國上海國藥), 繼續(xù)煮沸至紅色消失, 轉移至厭氧瓶(北京豐美)中, 121℃滅菌20min。

1.2 實驗材料

實驗草魚來源于黃岡水產科學研究所實驗基地, 體質量536.9 g, 體長37.90 cm。草魚帶回后于實驗魚房中飼養(yǎng)2個月, 期間不投喂飼料且每星期換水一次, 直至草魚腸道排空, 菌群趨于穩(wěn)定。

1.3 樣品采集

將實驗用魚置于解剖盤中, 75%酒精擦拭體表3次, 用解剖剪沿肛門向上朝前呈弧形剪開, 在未取出腸道前按結構把草魚腸道分為前腸、中腸和后腸, 并用細線進行結扎[15], 取出腸道, 剝離腸道外壁脂肪, 迅速轉移至厭氧手套箱(Coy)中。待厭氧手套箱中H2和O2含量穩(wěn)定后開始采集各腸段黏膜。用無菌解剖剪沿各部分腸道縱向剪開, 用PBS緩沖液(pH=7.2)漂洗3次, 最后用無菌解剖刀輕輕刮取0.5 g黏膜到10 mL離心管中[14]。

1.4 厭氧條件下細菌的分離與計數

向上述裝有黏膜樣品的離心管中加入4.5 mL PBS緩沖液, 充分混勻。吸取0.5 mL勻漿液到另一盛有4.5 mL PBS緩沖液的離心管中進行稀釋, 作為10-2倍黏膜稀釋液。按上述步驟, 制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8倍不同稀釋度的腸道黏膜稀釋液。取前腸稀釋度為10-2、10-3和10-4, 中腸稀釋度為10-3、10-4和10-5, 后腸稀釋度為10-6、10-7和10-8的黏膜勻漿液涂布到BHIA培養(yǎng)基上, 每個稀釋度重復3次, 涂布均勻后在28℃下厭氧培養(yǎng)48h[16]。最后從前腸、中腸和后腸培養(yǎng)基上各挑取約100個單菌落接種在液體BHIA培養(yǎng)基中, 28℃震蕩培養(yǎng)48—72h。

1.5 可培養(yǎng)細菌DNA的提取和16S rRNA擴增

在無菌操作臺中用2 mL注射器分別從300個厭氧瓶中吸取培養(yǎng)液1—2 mL離心管中, 每個離心管中裝有2種規(guī)格的小磁珠(0.3 g 0.1 mm和0.1 g 0.5 mm),渦旋3min[17]。隨后以菌液為模板, 用細菌通用引物27F、1492R和Go Taq Green Master Mix酶進行細菌16S rRNA擴增。PCR反應體系(終體積25 μL):80 ng DNA, 10 μmol/L引物, 9.5 μL無核苷酸水,12.5 μL Go Taq Green Master Mix酶。PCR反應條件: 94℃預變性5min; 94℃變性30s, 53℃退火30s,72℃延伸1min30s, 運行30個循環(huán); 72℃延伸10min。擴增產物在1.0%瓊脂糖凝膠上140V電泳30min后, 于凝膠成像系統(tǒng)中觀察, 并用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒(北京艾德萊)對1500 bp的條帶進行回收, 回收產物用pMD18-T載體(TaKaRa, 中國大連)連接轉化到DH5α感受態(tài)細胞中, 涂布于57 mg/mL氨芐青霉素LB培養(yǎng)基上, 37℃培養(yǎng)10h。隨機挑選轉化子, 用載體通用引物M13(+)和M13(-)檢測質粒是否插入成功, 對檢測結果條帶大小為1700 bp的單克隆送測序。

1.6 序列分析和系統(tǒng)進化樹構建

采用DNAStar軟件對測序結果進行拼接并去除載體序列[18], 然后將序列導入Ezbiocloud (www.ezbiocloud.net)數據庫中比對。同時序列文件輸入Ribosomal Database Project (RDP) Release11數據庫進行序列分析[19]。通過Aligner序列比對, Complete Linkage Clustering聚類分析, 最后在Representative Sequence中選出每個聚類文件中的代表序列。用MEGA7.0[20]根據Kimura-two-parametermodel遺傳距離模型[21], 采用鄰接法(Neighbor-joining, NJ)[22]構建系統(tǒng)發(fā)育樹。上述序列已上傳至GeneBank數據庫中, 序列登錄號為MG428715-MG428988。

2 結果

2.1 草魚腸道厭氧條件下可培養(yǎng)細菌的計數

不同腸段, 厭氧條件下可培養(yǎng)的細菌數量不同。前腸可培養(yǎng)細菌的數量是3.17×103cfu/g, 中腸可培養(yǎng)的細菌數量為1.63×104cfu/g, 后腸可培養(yǎng)細菌數量明顯增多, 達到1.79×107cfu/g(表 1)。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn), 前腸與中腸可培養(yǎng)細菌數量沒有顯著差異(P＞0.05), 但前腸和中腸可培養(yǎng)細菌數量都與后腸可培養(yǎng)細菌數量差異極顯著(P＜0.01)。

2.2 草魚腸道厭氧條件下可培養(yǎng)細菌的分離與鑒定

本實驗從前中后腸共挑取300個單菌落, 最終成功鑒定出274株細菌, 其中前腸97株, 中腸92株,后腸85株。經Ezbiocloud數據庫比對, 共鑒定出15種細菌, 其中專性厭氧細菌4種, 占9.1%, 兼性厭氧細菌11種, 占90.9%(表 2、表 3)。比對分析結果表明, 草魚腸道黏膜中優(yōu)勢菌株為氣單胞菌屬, 占79.9%, 其次擬桿菌屬占7.7%, 希瓦氏菌屬占5.5%,芽孢桿菌屬占2.9%。

前腸微生物有7種(表 3), 分別為Aeromonas hydrophila、A.aquatica、A. encheleia、A. piscicola、Bacillus licheniformis、Citrobacter youngae、Shewanella xiamenensis; 中腸微生物類群主要有8種(表 2、表 3), 分別為Bacteroides luti、B. spaurosaccharolyticus、A. hydrophila、A. aquatica、A.encheleia、B. licheniformis、Pantoea ananatis、S.xiamenensis; 后腸微生物類群主要有12種(表 2、表3), 分別為B. luti、B. spaurosaccharolyticus、Cetobacterium somerae、Fusobacterium ulcerans、A.hydrophila、A. allosaccharophila、A. encheleia、B.licheniformis、P. ananatis、S. oneidensis、S. xiamenensis、F. acidificum。由此可知, 前腸中未分離到專性厭氧菌, 豐度最高的細菌是嗜水氣單胞菌(78/274), 而A. piscicola(1/274)和C. youngae(2/274)僅僅在前腸出現(xiàn)。C. somerae(3/274)和F.ulcerans(1/274)是專性厭氧細菌, 只在后腸出現(xiàn)。

表 1 不同腸段厭氧細菌數量Tab. 1 Numbers of anaerobic bacteria in different intestinal segment (cfu/g)

表 2 草魚腸道可培養(yǎng)專性厭氧細菌數目、種類及分布Tab. 2 Numbers, species and distribution of cultivable obligate anaerobes in intestine of grass carp

表 3 草魚腸道可培養(yǎng)兼性厭氧細菌數目、種類及分布Tab. 3 Numbers, species and distribution of cultivable facultative anaerobes in intestine of grass carp

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

選取15種細菌的代表性序列及其參考菌株序列, 另外以2個古細菌Methanobrevibacter smithii和Methanothermobacter marburgensis作為外類群序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。在草魚腸道黏膜中, 細菌的主要類型有變形菌門(Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)。

3 討論

3.1 厭氧情況下草魚腸道黏膜可培養(yǎng)細菌數量情況

草魚腸道有8個彎曲, 其長度是體長的兩倍, 按結構可分為前、中、后腸3段[23]。本實驗用厭氧方法培養(yǎng)了草魚腸道不同腸段黏膜上細菌的種類和數量。實驗結果顯示草魚前中后腸腸段黏膜上可培養(yǎng)的細菌數量分別是3.17×103、1.63×104、1.79×107cfu/g。該結果與Trust等[13]的研究有很大的差異, 他們在厭氧條件下培養(yǎng)的草魚腸道內容物和黏膜前中后腸細菌總數平均值分別為9.0×106、4.3×107、7.7×108cfu/g。這種差異說明草魚腸道內容物中也存在大量厭氧微生物, 同時, 所使用的培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件差異也可能造成數量差異。本研究使用了BHIA培養(yǎng)基, 而Trust等[13]運用了多種不同培養(yǎng)基。同時, 在Trust的研究中, 細菌培養(yǎng)溫度為37℃, 而本次實驗中為28℃。不同細菌最適生長溫度不同, 超過其最適生長溫度將導致細菌生長緩慢或不生長[24]。進一步分析發(fā)現(xiàn), 在厭氧條件下,前腸微生物比中腸微生物少, 前腸和中腸微生物顯著比后腸少, 前腸分離到的都是兼性厭氧微生物,專性厭氧細菌只在中后腸有發(fā)現(xiàn), 后腸居多。研究表明, 魚類或白蟻后腸為低氧或厭氧環(huán)境[25,26], 因此推測本實驗結果可能是由于宿主消化道氧的分布不同造成的。

在魚類腸道中, 好氧細菌、兼性厭氧細菌和專性厭氧細菌同時存在, 多數研究結果顯示, 專性厭氧細菌的數量遠遠超過兼性厭氧細菌[27], 但是本實驗通過厭氧培養(yǎng)的方法結果得到的專性厭氧細菌和兼性厭氧細菌的比例約為1鯰10。對于在厭氧條件下, 得到兼性厭氧細菌的數量遠多于專性厭氧細菌的現(xiàn)象, 推測可能是以下兩個方面的原因: 第一,某些專性厭氧細菌對營養(yǎng)條件要求苛刻[2], 在本次實驗中, 并沒有對培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進行優(yōu)化, 因此單一的生長環(huán)境可能不能滿足某些專性厭氧細菌的培養(yǎng)需求; 第二, 某些專性厭氧菌株生長較慢,在一些研究中, 專性厭氧細菌的培養(yǎng)時間為7d[28],而本實驗中細菌培養(yǎng)時間為2d, 因此有些生長緩慢的細菌可能未被培養(yǎng)出來, 導致得到的專性厭氧細菌數量比較少。

圖1 基于草魚腸道黏膜厭氧細菌16S rRNA基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Neighbor-joining phylogenetic tree of 16S rRNA gene sequences of intestinal mucosa anaerobes of grass carp

3.2 厭氧情況下草魚腸道黏膜可培養(yǎng)細菌種類情況

魚類腸道微生物的組成取決于營養(yǎng)狀況。肉食性魚類如青魚腸道中的優(yōu)勢群落為蛋白酶產生菌, 這些細菌能將食物中復雜的蛋白質分解為各種氨基酸以利于營養(yǎng)物質的吸收, 而草食性魚類如草魚腸道中則多為纖維素酶或淀粉酶產生菌[29]。本實驗結果表明, 草魚腸道黏膜中存在大量的兼性厭氧細菌如氣單胞菌屬的種類。這與蔣燕等的結果是一致的, 他們發(fā)現(xiàn)饑餓狀態(tài)下, 氣單胞菌屬的種類是草魚腸道黏膜上的優(yōu)勢菌種, 能夠分泌纖維素酶[30]。氣單胞菌是常見的條件致病菌[31], 但是它在有機物發(fā)酵[32]、纖維素降解[30]和免疫調節(jié)[33]方面有重要作用, 因此氣單胞菌可能在草魚的消化道生理中發(fā)揮重要作用[8], 應該對其進行重新認識。本研究共發(fā)現(xiàn)3個屬的專性厭氧微生物, Trust等[13]研究, 草魚腸道中主要存在5種專性厭氧微生物, 分別為擬桿菌屬、放線菌屬、梭菌屬、梭形桿菌屬和消化鏈球菌屬, 這可能與所用培養(yǎng)基不一致引起的,本研究使用BHIA培養(yǎng)基, 而Trust在此基礎上, 還試用了TSA、RCM、PYGA、EYA、PYSC、BBA培養(yǎng)基, 其中, RCM為強化梭菌培養(yǎng)基, 有利于梭菌屬細菌的生長。本研究中的擬桿菌屬細菌經Ezbiocloud數據庫比對發(fā)現(xiàn)與B. luti和B. paurosaccharolyticus的匹配值分別為89%和92%。在微生物分類中認為, 16S rRNA相似度小于95%時可能為不同屬[34], 因此, 以上2株細菌是否屬于擬桿菌屬類細菌有待于進一步進行生理生化、進化地位及分子生物學的研究。此外, 本研究還在草魚的后腸中發(fā)現(xiàn)了C. somerae, 鯨桿菌是淡水魚類腸道生產維生素B12的主要細菌之一[28], 存在于草魚后腸黏膜中,說明其是固有微生物之一, 能夠長期定植于腸道表面, 持續(xù)提供維生素B12供機體利用。益生菌是一類提高宿主健康水平的有益微生物, 它們增強宿主抵抗有害微生物的能力, 提高食物轉化率, 產生有機酸, 水產養(yǎng)殖過程中經常被作為飼料添加劑[35]。目前應用較多的為芽孢桿菌屬細菌, 例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌等[36]。研究表明, 地衣芽孢桿菌能夠增強鳊魚機體免疫力和抗氧化能力[37], 同時分泌各種消化酶, 提高各種營養(yǎng)成分的利用率, 從而降低水產養(yǎng)殖成本, 提高經濟效益[38]。

4 總結

本研究通過傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法, 成功分離出草魚腸道黏膜專性厭氧細菌, 但是由于實驗中僅運用了一種培養(yǎng)基, 而腸道的營養(yǎng)條件比較復雜, 不同厭氧微生物的營養(yǎng)需求不同, 因此本研究對厭氧微生物的認識還很膚淺, 沒有能夠全面揭示草魚腸道黏膜厭氧微生物的組成和結構, 還需要優(yōu)化實驗條件以充分認識消化道厭氧微生物。

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