呂耀平 金 晶 施 倩 陳 潔 劉子明 陸 君 黃富友 傅旭豪

(1. 麗水學院生態(tài)學院, 麗水 323000; 2. 寧波大學海洋學院, 寧波 315211; 3. 麗水市中心醫(yī)院, 麗水 323000;4. 麗水市水產技術推廣站, 麗水 323000)

棘胸蛙(Quasipaa spinosa)俗稱石蛙、石雞, 分布在我國浙江、江西、福建和湖南等省, 因其肉質鮮美, 富含賴氨酸、亮氨酸等多種人體必需氨基酸,具有較高的食用與藥用價值[1], 為近幾年蛙類養(yǎng)殖的主要品種之一。棘胸蛙養(yǎng)殖環(huán)境要求較高, 極易受到病害侵襲, 其中爛皮病是養(yǎng)殖過程中較為常見的病害之一[2], 發(fā)病初期表現(xiàn)為食欲減退, 頭背部皮膚變淡無光澤, 發(fā)病后期出現(xiàn)潰爛, 嚴重時指骨和和頜骨外露, 關節(jié)腫大。同時該病具有傳染性, 死亡率極高, 給生產帶來了極大的損失[3]。皮膚作為兩棲類防御外部侵害的第一道防線, 可以抵御病原體感染, 防止皮膚表層水分的流失, 同時其特殊的生理化學構造蘊藏著豐富的微生物群落, 形成的共生系統(tǒng)為兩棲類生存必不可缺的[4,5]。爛皮病的發(fā)生直接破壞了棘胸蛙第一道免疫防線, 因此了解該病的發(fā)病機制對防治病害具有重要意義。本試驗從患爛皮病病蛙中分離篩選病原菌, 對其進行革蘭氏染色、形態(tài)觀察、生理生化和分子鑒定, 觀察回歸感染后病蛙主要組織器官的病理變化, 初步探究棘胸蛙爛皮病的發(fā)病機理, 并進一步研究致病菌的藥敏特性, 旨在豐富棘胸蛙病原資料以及為棘胸蛙的病害防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

患爛皮病和健康棘胸蛙均由浙江省麗水市鼎鑫生物工程有限公司提供, 病蛙5只, 規(guī)格為(175±25) g/只。健康成蛙50只, 規(guī)格為(100±16) g/只。

1.2 病癥觀察

觀察病蛙的外觀癥狀, 在解剖鏡下觀察病蛙的皮膚及內臟并用Nikon數碼相機拍照記錄。取腹水進行水浸片觀察, 排除霉菌和寄生蟲感染后, 再進行細菌的分離與純化培養(yǎng)。

1.3 病原菌分離純化

在無菌條件下, 取患病棘胸蛙肝臟、肌肉、腸等組織, 于無菌玻璃勻漿器中研磨、稀釋后涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基, 28℃培養(yǎng)24h后, 肉眼觀察菌落形態(tài)、大小、隆起度、顏色等, 挑取不同形態(tài)單個優(yōu)勢菌落分別接種于綿羊血瓊脂培養(yǎng)基, 28℃培養(yǎng)24h后觀察菌落生長及溶血情況, 將具有溶血性的單菌落于胰蛋白胨大豆瓊脂固體培養(yǎng)基(TSA) 28℃下進行純化培養(yǎng)[6]。

1.4 病原菌的鑒定

革蘭氏染色取28℃培養(yǎng)24h的細菌培養(yǎng)物,根據何昭陽等[6]方法進行革蘭氏染色鑒定, 用草酸銨結晶紫初染、碘液媒染、95%乙醇脫色、番紅染色液復染, 干燥后于光學顯微鏡(麥克奧迪實業(yè)集團有限公司, BA210)下觀察并記錄。

生化鑒定取28℃培養(yǎng)24h細菌培養(yǎng)物按照李紹戊等[7]方法進行糖發(fā)酵(蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、纖維二糖、乳糖、鼠李糖、蕈糖、阿拉伯糖)、醇發(fā)酵(甘露醇、山梨醇)及其他生化實驗(氧化酶、觸酶、乙酰甲基甲醇(v-p)、丙二酸鹽、檸檬酸鹽、硫化氫、七葉苷、鳥氨酸脫羥酶、精氨酸雙水解、賴氨酸脫羧酶、水楊苷、吲哚、明膠水解、硝酸鹽、甲基紅(M-R))。

16S rDNA鑒定取28℃培養(yǎng)24h菌懸液1 mL, 12000 r/min離心2min; 棄上清液, 加超純水100 μL, 煮沸10min; 冰浴5min, 12000 r/min離心2min, 取上清液, -20℃保存, 備用。以菌株DNA為PCR擴增模板, 細菌16S rDNA通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴增16S rDNA基因, 引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

PCR反應條件: 25 μL反應體系, 每管依次加入超純水17.5 μL、10×PCR Buffer 2.5 μL、dNTP mix(10 mmol/L each) 0.5 μL、上下游引物各1 μL、模板1 μL。94℃預變性5min, 以下條件PCR擴增:94℃變性45s, 55℃復性45s, 72℃延伸90s, 共33個循環(huán), 72℃再延伸10min。PCR擴增后產物經 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測, 用AXYGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收純化PCR產物。所得產物連接至pGEM-T載體后轉化到大腸桿菌感受態(tài)細胞Top10, 陽性克隆送生工生物工程(上海) 有限公司測序。

1.5 人工回歸感染實驗

按照杭小英等[8]方法進行回歸感染試驗。取60只健康蛙, 于水箱中暫養(yǎng)2周。將篩選出的菌株接種于TSA平板上, 28℃培養(yǎng)24h, 用0.65%的無菌生理鹽水洗下菌苔制成菌懸液, 梯度稀釋使菌液濃度為104、105、106、107和108CFU/mL。試驗采用肌肉注射法, 每組濃度各10只, 每只蛙注射劑量為0.5 mL, 對照組注射等量無菌0.65%生理鹽水, 連續(xù)觀察10d。

1.6 組織病理觀察

按照樊威等[9]方法, 取人工染病棘胸蛙和健康棘胸蛙的肝、肌肉、肺、舌, 用10%的中性福爾馬林固定, 石蠟包埋, 切片, HE染色, 中性樹膠封片,于光學顯微鏡下觀察并記錄。

1.7 藥物敏感性檢測

取0.2 mL培養(yǎng)菌液均勻涂布于TSA瓊脂平板上, 等距貼上藥敏紙片4片/平板, 后將處理好的平板倒置于培養(yǎng)箱中, 28℃培養(yǎng)24h, 測定其抑菌圈直徑(平行重復3次), 以平均值±標準差(x±SD)表示, 直徑小于10 mm為不敏感或低度敏感, 10—15 mm為中度敏感, 大于15 mm為高度敏感[10]。選用常用藥敏紙片: 妥布霉素、氨芐西林、頭孢他啶、鏈霉素、卡那霉素、四環(huán)素和慶大霉素。

2 結果

2.1 病癥觀察

對健康的棘胸蛙和患病棘胸蛙進行外部特征和解剖觀察(圖1), 圖1a和圖1b為健康棘胸蛙的外部特征圖和解剖圖, 圖1c和圖1d為患病棘胸蛙的外部特征圖和解剖圖。由圖可見患病棘胸蛙頭部皮膚表層脫落, 真皮層腐爛, 露出肌肉(圖1c), 解剖發(fā)現(xiàn)肝部嚴重充血、淤血(圖1d)。取腹水水浸片觀察, 未發(fā)現(xiàn)有霉菌和寄生蟲感染。

2.2 病原菌的鑒定

革蘭氏染色鑒定從患爛皮病棘胸蛙病灶部位分離篩選出3種菌, 分別將其命名為BS1、BS2和BS3, 其中BS1和BS3分離于肌肉中, BS2分離自腸, 在綿羊血瓊脂培養(yǎng)基上均呈β-溶血。對其進行革蘭氏染色鑒定(圖2), 圖2a、圖2b和圖2c分別為BS1、BS2和BS3的革蘭氏染色圖, 發(fā)現(xiàn)BS1、BS2和BS33種菌均為革蘭氏陽性, 細胞呈桿狀, 末端方, 以鏈狀形式排列。

生化鑒定根據細菌手冊[11]對BS1、BS2和BS3生理生化測定, 發(fā)現(xiàn)3種菌均不發(fā)酵甘露醇; 能液化明膠; 觸酶陽性; 亞硝酸鹽還原為陽性 (表 1)。

分子鑒定用細菌16S rDNA通用引物擴增BS1、BS2和BS3的16S rDNA基因, 將其與Gen-Bank數據庫中已報道的16S rDNA基因序列進行BLAST比對, BS1、BS2和BS3與已知蠟樣芽孢桿菌同源性分別為97%、93%、100%。

2.3 回歸感染實驗

圖1 患病棘胸蛙病變特征Fig. 1 Clinical signs of illness of Q. spinosa

人工感染試驗分別以菌液濃度為7.1×104、7.1×105、7.1×106、7.1×107和7.1×108CFU/mL感染健康棘胸蛙, 試驗發(fā)現(xiàn)細菌感染24h后, 發(fā)現(xiàn)部分染病棘胸蛙活動能力降低, 反應力變弱, 于水箱內靜伏不動, 食欲減退, 吻部周圍出現(xiàn)大小不規(guī)則的表皮潰瘍斑, 病癥與圖1一致, 對照組顯示健康。用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析后, 計算得到BS1、BS2和BS3三株菌株的LD50分別為4.09×107、2.50×106和 2.51×107CFU/mL (表 2)。

2.4 主要器官組織病理觀察

觀察人工感染蠟樣芽孢桿菌棘胸蛙和健康棘胸蛙的病理組織切片(圖3), 圖3a、3b、3c和3d為健康肝部、舌部、肌肉和肺部組織切片圖, 圖3e、3f、3g和3h為患病組織切片圖。染病棘胸蛙肝組織大面積細胞破裂, 核溶解(圖3e); 舌組織肌肉溶解, 出現(xiàn)空泡, 早期能清楚看到橫紋肌, 晚期橫紋肌蛻變, 溶解(圖3f); 肌肉糜爛, 組織滲出壞死, 出現(xiàn)炎癥細胞, 有破裂核碎片出現(xiàn)(圖3g); 肺部出現(xiàn)大量包涵體和炎癥反應: ①肺泡腔增生, 肺泡腔膠原化(均質、粉碎), 出現(xiàn)波量變性; ②淋巴、漿細胞增多, 壞死不明顯; ③出現(xiàn)滲出組織以及炎癥反應(圖3h)。

圖2 致病菌的革蘭氏染色Fig. 2 Gram staining of pathogenic bacteria

表 1 菌株的生理生化指標Tab. 1 Physiological and biochemical characteristics of the bacterial strains

2.5 抗生素敏感性試驗

3株菌培養(yǎng)24h后對其進行抗生素敏感性試驗,其抑菌圈大小如表 3所示, 根據盧靜等[10]方法, 直徑小于10 mm為不敏感或低度敏感, 10—15 mm為中度敏感, 大于15 mm為高度敏感, 可見3株菌均對氨芐西林和頭孢他啶均不敏感, 對妥布霉素、四環(huán)素和卡那霉素表現(xiàn)出中度敏感, 此外BS1表現(xiàn)出對鏈霉素高度敏感, BS2和BS3對慶大霉素高度敏感。

3 討論

爛皮病作為棘胸蛙養(yǎng)殖過程中的常見病之一,具有極強的感染性, 因此了解該病發(fā)病機理, 使之得到有效防治以此提高養(yǎng)殖經濟效益具有重要意義。本試驗從患爛皮病棘胸蛙中篩選出BS1、BS2和BS3三種致病菌, 對其進行革蘭氏染色、形態(tài)觀察、生理生化鑒定和16S rDNA序列分析, 鑒定這3株菌均為蠟樣芽孢桿菌。同時, 觀察人工感染蠟樣芽孢桿菌棘胸蛙的病理組織切片, 發(fā)現(xiàn)經病原菌感染的棘胸蛙肝、肺、舌和肌肉的損傷較嚴重, 表現(xiàn)出明顯變性、壞死和炎癥細胞浸潤, 且在肺部組織內發(fā)現(xiàn)嗜堿性包涵體。藥敏試驗表明, 在所試的7種抗生素中, 致病性蠟樣芽孢桿菌對慶大霉素和鏈霉素高度敏感, 對妥布霉素、卡那霉素和四環(huán)素中度敏感, 對氨芐西林和頭孢他啶產生抗藥性。

表 2 分離菌株對棘胸蛙的致病性(死亡數/試驗數)Tab. 2 The effect of artificial bacterial infection on the survival

圖3 患病棘胸蛙病理組織學特征(HE染色)Fig. 3 Histopathological features of diseased Q. spinosa

表 3 抗生素對菌株的抑制作用Tab. 3 Inhibition of antibiotics to bacterial strains

3.1 病原菌的分離與鑒定

引起爛皮病的原因有非感染性和感染性因素。非感染性因素包括在養(yǎng)殖過程中缺乏營養(yǎng)(如維生素A), 高溫, 養(yǎng)殖密度較高引起過度擁擠導致受傷或接觸到有毒物質[12—14]。但更多研究發(fā)現(xiàn), 感染性因素如一些寄生蟲[15]、真菌[16]、病毒[17]以及細菌才是造成爛皮病的主要原因。目前, 已被研究報道的細菌有嗜水氣單胞菌[18]、奇異變形桿菌(Proteus vulgaris)[19]、克氏耶爾森氏菌(Yersinia Kiristensenii)[20]、熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)[21]等。實驗在排除寄生蟲感染的可能性下, 從病蛙病灶部位中分離篩選得到3種病菌BS1、BS2和BS3, 經革蘭氏染色鑒定均為革蘭氏陽性, 細胞呈桿狀, 末端方, 以鏈狀形式排列。生理生化特性鑒定, 發(fā)現(xiàn)3株菌均能分解葡萄糖、麥芽糖等, 不發(fā)酵阿拉伯糖、鼠李糖和甘露醇等; 不產H2S; 能液化明膠; 觸酶陽性、亞硝酸鹽還原、VP等試驗呈陽性, 呈現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌的特性。本試驗為進一步鑒定BS1、BS2和BS3, PCR擴增了3株菌16S rDNA基因序列, BLAST分析結果看, 菌株BS1、BS2和BS3與蠟樣芽孢桿菌16S rDNA具有較高的同源性。綜合細菌革蘭氏染色、形態(tài)觀察、生理生化特性和16S rDNA基因序列測定分析結果,菌株BS1、BS2和BS3為蠟樣芽孢桿菌。

已知蠟樣芽孢桿菌, 屬于芽孢桿菌屬(Bacillussp.), 革蘭氏陽性好氧桿菌, 廣泛存在于各種環(huán)境中,其無毒菌株已被作為益生菌應用于飼料、農業(yè)、水產養(yǎng)殖等各領域, 但其中部分菌株具有致病性[22]。譚愛萍等[23]從患病鱉中分離篩選得到的JY02、JY05、JY07和JY09均為蠟樣芽孢桿菌, 經感染性試驗證明對健康中華鱉具有較強的致病性。但目前關于棘胸蛙爛皮病的研究較少, 對蠟樣芽孢桿菌引起棘胸蛙爛皮的研究更未見報道, 因此了解蠟樣芽孢桿菌造成棘胸蛙爛皮的致病機理具有重要意義。

3.2 病原菌的致病性與致病機理

用蠟樣芽孢桿菌進行人工回歸感染試驗后, 棘胸蛙在48h內相繼出現(xiàn)了爛皮現(xiàn)象, 其病癥表現(xiàn)與患爛皮病病蛙一致, 且不同的菌液濃度對棘胸蛙產生的致病程度存在差異。同時這3株蠟樣芽孢桿菌對棘胸蛙產生不同的致病性, 根據SPSS 13.0軟件得到的結果顯示, BS1、BS2和BS3三株菌株對棘胸蛙的LD50分別為4.09×107、2.50×106和 2.51×107CFU/mL, 可見BS2的致病性最強。

為進一步了解蠟樣芽孢桿菌造成棘胸蛙爛皮的致病機理, 實驗對經蠟樣芽孢桿菌感染的患病棘胸蛙和健康棘胸蛙進行病理觀察, 對比結果顯示病蛙肝部細胞大面積破裂, 核溶解; 舌部肌肉溶解, 出現(xiàn)空泡, 早期能清楚看到橫紋肌, 晚期橫紋肌蛻變,溶解; 爛皮部分肌肉糜爛, 組織滲出壞死, 出現(xiàn)炎癥細胞, 有破裂核碎片出現(xiàn); 肺部出現(xiàn)大量嗜堿性包涵體、嗜酸性包涵體和炎癥反應。舒新華等[20]對牛蛙腐皮病的組織病理觀察發(fā)現(xiàn), 患部皮膚發(fā)生潰瘍、腐爛, 肝、腎、脾、胃、腸等內部臟器發(fā)炎、壞死。另外, 由于微血管血液淤滯, 阻閉了局部的微循環(huán), 導致了正常代謝發(fā)生障礙, 使受損臟器喪失其應有的機能, 引起主要臟器壞死, 從而加速病蛙死亡。鐘蕾等[24]發(fā)現(xiàn)牛蛙腐皮病引起牛蛙死亡的重要原因是主要臟器的受損, 如肝、胃、腸和腎等, 導致正常代謝發(fā)生障礙; 同時病蛙的白細胞中出現(xiàn)嗜中性粒細胞和淋巴細胞, 這表明病蛙體內具有程度較重的炎癥。研究發(fā)現(xiàn)肝、脾、腎的壞死和炎癥, 細胞胞漿內出現(xiàn)嗜酸性或嗜堿性包涵體等都是確認蛙病菌感染的特異性病變[25,26]。由此對比可知, 實驗中該致病性蠟樣芽孢桿菌對棘胸蛙的肝部、肺部造成了極大的破壞, 導致了蛙自身代謝功能障礙, 解毒能力降低, 最終引起多器官壞死、衰竭引起死亡, 同時免疫系統(tǒng)的損傷, 具有防御作用的皮膚結構的破壞[27], 也會使得一些條件致病菌[28—30]的繼發(fā)感染, 加速棘胸蛙的死亡。

3.3 病原菌對抗生素的敏感性差異

抗生素藥物用于水生生物的病害防治一直取得了較好的效果, 但近幾年, 由于抗生素藥物的濫用, 細菌抗藥性現(xiàn)象屢見不鮮。且不同菌種之間的抗藥現(xiàn)象之間存在差異[31,32], 因此在養(yǎng)殖過程中謹慎使用抗生素, 有選擇性地合理用藥, 防止抗生素濫用及誤用, 盡量防止細菌耐藥性的產生與加重。關秀芝等[33]篩選得到的溫和氣單胞菌GXZ01菌株對丙氟哌酸、氨芐青霉素、新霉素和復方新諾明4種藥物中度敏感; 對青霉素和乙酰螺旋霉素不敏感。本實驗研究發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌BS1、BS2和BS3均對氨芐西林和頭孢他啶產生了抗藥性, 而對慶大霉素表現(xiàn)了高度敏感性, 但缺乏長期效用,48h后慶大霉素的抑菌圈急劇縮小。因此在防治棘胸蛙爛皮病時可先慶大霉素, 24h后再配合施用鏈霉素, 應避免一藥重復利用。

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