李 琴 王天云 王小引 郭 瀟 林 艷

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院分析測試實驗室，新鄉(xiāng) 453003)

哺乳動物細胞由于具備類似于人類細胞的翻譯后加工修飾 (Post-translational modifications，PTMs)，因此，哺乳動物細胞表達系統(tǒng)是目前藥物重組藥物蛋白生產(chǎn)的重要平臺[1,2]。哺乳動物細胞表達系統(tǒng)包括非人源化細胞和人源化細胞系，常用的非人源化哺乳動物細胞主要是中國倉鼠卵巢 (Chinese hamster ovary,CHO)細胞，目前近70%重組藥物蛋白都是用CHO細胞表達系統(tǒng)生產(chǎn)的[2,3]。盡管非人源化哺乳動物類細胞具備安全性和有效性，但是由于PTMs方式不同，尤其是糖基化修飾與人源細胞存在差別，表達蛋白容易使人體產(chǎn)生免疫性，導(dǎo)致外來的重組藥物蛋白被循環(huán)系統(tǒng)清除等[4]。

近年來，人們對人源細胞系作為重組藥物蛋白表達系統(tǒng)做了大量工作，目前已經(jīng)有人類胚腎細胞293 (Human embryonic kidney 293，HEK293)、纖維肉瘤細胞系HT-1080[5-11](fibrosarcoma HT-1080) 細胞生產(chǎn)的藥物蛋白獲美國食品藥品監(jiān)督管理局 (Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)或歐洲醫(yī)藥局 (European Medicines Agency，EMA) 批準生產(chǎn)批準。此外，由PER.C6、HKB-11、CAP及HuH-7人源細胞生產(chǎn)的藥物蛋白正在進行審批中[12-15]。本文對人源化細胞系用于重組藥物蛋白研究進展做一綜述。

1 人源化的細胞系

1.1HEK293細胞系 HEK293細胞來源于人胚腎細胞，最早由Graham[16]于1977年利用轉(zhuǎn)染腺病毒5型DNA獲得，近年來被應(yīng)用于重組藥物蛋白和病毒載體的生產(chǎn)。HEK293能夠在SFM懸浮生長、易轉(zhuǎn)染，具備生產(chǎn)重組藥物蛋白的優(yōu)點[17,18]。對HEK293細胞進行馴化和改造，已經(jīng)培育出能在SFM生長迅速、轉(zhuǎn)染效率高、表達水平高的細胞系，如HEK293-H、293-F等[19]。此外HEK293-T(293-T)細胞系表達猴病毒40 (SV40) 大T抗原，能夠作為基因治療表達高滴度的病毒基因載體，常用于生產(chǎn)腺病毒[20]。HEK293-EBNA1細胞系能夠穩(wěn)定表達愛潑斯坦-巴爾病毒 (Epstein-Barr virus,EBNA-1)，受巨細胞病毒啟動子調(diào)控，其生長速率及細胞密度比HEK293細胞高[21]。

迄今已有5種由HEK293細胞系生產(chǎn)的藥物蛋白獲美國FDA或EMA 批準生產(chǎn)。目前應(yīng)用于臨床的Drotrecogin alfa (活化蛋白C)，是美國FDA批準的第一個治療嚴重敗血癥藥物 (商品名為Xigris)，Xigris具備前肽斷裂及谷氨酸殘基羧化作用的2種CHO細胞不能完成的PTMs方式[22,23]。重組因子IX Fc 融合蛋白 (rFIXFc) 和重組因子VIII Fc 融合蛋白 (rFVIIIFc) 是2014年FDA批準的2種用于預(yù)防和控制血友病A和B的患者出血藥物蛋白[24-26]，目前已獲加拿大，澳大利亞和日本等多個國家批準。rFVIIIFc和rFIXFc都是由HEK293細胞生產(chǎn)，富含γ-羧基谷氨酸域，依賴于維生素K12谷氨酸殘基γ-羧化作用修飾谷氨酸殘基，形成γ-羧基谷氨酸，是Factor IX (FIX) 活性的基本PTMs方式，這種方式促進FIX結(jié)合到磷脂膜上。和CHO細胞相比，HEK293細胞具有活性更高的γ-羧化活性，因此更適合表達rFIXFc[22]。此外，F(xiàn)VIII包含6個潛在的酪氨酸硫酸化位點，這對于FVIII的功能及結(jié)合到血管性假血友病因子 (von Willebrand Factor，vWF) 至關(guān)重要。已經(jīng)證實人源細胞表達的FVIII能夠徹底發(fā)生硫酸化。重組人凝血因子VIII 作為一種用于治療血友病A凝血因子VIII的替代產(chǎn)品，在HEK293-F細胞系成功表達，已獲EMA批準并正提交FDA審批[27]。這種產(chǎn)品和人FVIII具備相似的糖基化修飾方式，沒有發(fā)生α-1,3-半乳糖和羥乙酰神經(jīng)氨酸(N-glycolylneuraminic acid，NGNA) 作用。

胰高血糖素-1類似肽Fc融合蛋白 (dulaglutide) 是2014年FDA批準的用于治療Ⅱ型糖尿病的藥物，是用HEK293-EBNA 細胞生產(chǎn)的[6,28]。大量臨床數(shù)據(jù)證實其療效優(yōu)于二肽基肽酶抑制劑拮抗劑—艾塞那肽 (exenatide) 非劣效于利拉魯肽 (liraglutide) 兩種治療糖尿病的藥物[29,30]。

1.2HT-1080細胞系 HT-1080細胞是一種人纖維肉瘤細胞，通過基因激活技術(shù)產(chǎn)生的細胞系，目前有4種HT-1080細胞生產(chǎn)的藥物蛋白上市生產(chǎn)[17]。促紅細胞生成素 (Epoetin delta) 于2002年由EMA批準，用于修復(fù)和維持透析治療的慢性腎臟病患者的血紅蛋白水平。研究表明，HT-1080細胞產(chǎn)生的Epoetin delta和CHO細胞產(chǎn)生的紅細胞生成素具有不同的糖基化方式，包括缺乏NGNA[31,32]。艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶 (Iduronate-2-sulfatase,idursulfase;ELAPRASE) 是一種用于治療亨特綜合征(黏多糖累積?、蛐?的酶，亨特氏綜合征的患者體內(nèi)缺乏艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，該酶對機體內(nèi)諸如葡萄胺聚糖 (GAG) 這樣的碳水化合物循環(huán)利用非常重要。α-半乳糖苷酶是2001年由EMA批準用于治療法布里病 (Fabry disease) 的蛋白藥物，和CHO細胞生產(chǎn)的β-agalsidase beta相比，α-半乳糖苷酶具有相似的酶動力學(xué)，但α-半乳糖苷酶在法布里患者纖維母細胞吸收較少，在鼠的心、腎、脾等器官累計濃度較低[33]。第4種由HT-1080細胞生產(chǎn)的蛋白藥物是velaglucerase alfa，是2010年FDA和EMA批準用于治療1型高歇氏病的藥物[19,34-36]，和由CHO細胞生產(chǎn)的伊米苷酶 (imiglucerase) 及胡蘿卜細胞產(chǎn)生的taliglucerase alfa相比，這些產(chǎn)品有不同的多聚糖方式，具備可比擬的巨噬細胞吸收方式、體外酶活性、穩(wěn)定性、器官分布及有效性[37,38]。

1.3PER.C6 PER.C6細胞最早由人胚胎視網(wǎng)膜細胞轉(zhuǎn)染Ad5 E1A和 E1B病毒產(chǎn)生[39]，這個細胞系最初用于生產(chǎn)用于疫苗和基因治療的人腺病毒載體。PER.C6細胞能夠在SFM或無動物成分培養(yǎng)基上懸浮或貼壁高密度生長 (>107cells/ml)，因此能夠產(chǎn)生高水平的重組蛋白[14,40]。此外，插入的基因無需擴增，在無選擇壓力情況下，較低水平的基因拷貝就足夠生產(chǎn)足夠的IgG[41]。目前，有一些利用PER.C6 細胞系產(chǎn)生的產(chǎn)品已進入Ⅰ期、Ⅱ期臨床階段[23]，包括粒-巨噬細胞集落刺激因子 (GM-CSF) 為靶標的人單克隆抗體MOR103和抗狂犬病毒抗體CL184[42]。研究表明，活動性中度類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者對MOR103抗體耐受良好，藥物安全性高。Ⅰ期臨床試驗證明，抗體CL184，能夠快速中和狂犬病毒活性，CL184正處于FDA審批中。

1.4CAP細胞系 CAP細胞系來源于人羊水細胞，通過5型腺病毒E1 轉(zhuǎn)染永生化而成，這個細胞系具備高水平生產(chǎn)重組藥物蛋白的能力，能表達完全糖基化和唾液酸蛋白(glycosylated and sialylated protein)，表達量高達30 pg/(cell·d)[43]，并且在無選擇壓力情況下能夠穩(wěn)定傳代90代。目前，CAP細胞系已經(jīng)引起研究者及企業(yè)的極大興趣。

1.5HKB-11細胞系 HEK293細胞在大規(guī)模細胞培養(yǎng)過程中，會產(chǎn)生細胞凝結(jié)。為避免這種現(xiàn)象，Cho等[44]用PEG方法融合293S cells和2B8細胞，篩選出一株能夠在SFM高密度懸浮培養(yǎng)(8.6×106cells/ml)，并且高水平表達細胞因子[interleukin (IL)-2 and IL-4]、ICAM-1 及 rFVIII的一株細胞克隆，命名為HKB-11細胞系，其表達水平可以與293細胞和CHO細胞相比，是一種可用于人類藥物蛋白生產(chǎn)的良好宿主細胞系[45]。

1.6HuH-7細胞系 最近發(fā)展的HuH-7細胞系，來源于人的肝癌細胞[12]。研究表明，HuH-7-CD4細胞能夠產(chǎn)生具備人源細胞糖基化的重組因子IX，PTMs方式如糖基化、唾液酸化作用、磷酸化作用及硫酸鹽化，與plasma-derived and recombinant factor IX (rFIX) 類似，優(yōu)于CHO細胞產(chǎn)生的rFIX[12]。最近，HuH-7細胞系用于生產(chǎn)rFIX的突變體，提高活化FVIII的親和力[46]。

2 人源化細胞系的優(yōu)缺點

人源化細胞系用于重組藥物蛋白的生產(chǎn)，其優(yōu)點在于以下兩個方面：一是具備人類細胞完全一致的PTMs方式，雖然其他哺乳動物細胞具備和人細胞相似的PTMs方式，但還是存在差別[47]。已經(jīng)證實PTMs的糖基化影響蛋白的活性、產(chǎn)量以及在循環(huán)系統(tǒng)的清除[48]。NGNA的抗體普遍存在于人類細胞[47]。Ghaderi等利用NGNA敲除的鼠實驗證實，抗NGNA 抗體能夠增加西妥昔單抗的免疫原性[49]。此外，在接受西妥昔單抗治療的結(jié)、直腸癌，頭、頸部癌癥患者中，大多數(shù)嚴重的過敏反應(yīng)是與預(yù)先存在的a-gal抗體IgE有關(guān)[40,48]，這些抗體因具有人類細胞沒有的多聚糖結(jié)構(gòu)而改變其療效或者免疫原性，因此人源細胞作為藥物蛋白的表達系統(tǒng)非常有價值和意義。另一方面，人源細胞的高密度培養(yǎng)及高水平的蛋白表達也是其具備的優(yōu)勢。目前非人源化哺乳動物細胞系藥物蛋白的表達量已經(jīng)達到50～90 pg/(cell·d)(PCD)及1～5 g/L水平。人源細胞系PER.C6已經(jīng)達到27 g/ L抗體表達水平[50]。Coco-Martin和Harmsen[49]比較了CHO和PER.C6細胞2種表達系統(tǒng)，PER.C6細胞的表達量是CHO細胞的10倍，表達10 kg的藥物蛋白，PER.C6細胞用500 L就可完成，而CHO細胞則需要11個500 L的反應(yīng)器。Cho等[51]在HKB11和CHO細胞中比較了3種不同的蛋白，發(fā)現(xiàn)CHO細胞表達重組因子VIII (BDDrFVIII)，IL-4SA及組織因子分別達到5～10 U/(cell·d),4～5 PCD和40～50 PCD。HKB11細胞表達的重組因子VIII和組織因子分別比CHO細胞表達提高11和22倍，而IL-4SA則比CHO細胞低3～4倍。Mei等[15]也在HEK293、BHK21和HKB11細胞比較了重組因子VIII 的表達，3種細胞的表達活性水平分別為0.92、0.22、7.22。

人源細胞作為藥物蛋白表達系統(tǒng)，雖然具備一定的優(yōu)點，但也存在潛在的風(fēng)險。目前的細胞系大多為腺病毒載體轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)產(chǎn)生，此外無法抵抗人類病毒的感染，而其他非人源的哺乳動物細胞系，如CHO細胞能夠抵抗人類病毒的感染，提高生產(chǎn)產(chǎn)品的安全性。

3 結(jié)語與展望

目前，用人源細胞系生產(chǎn)藥物蛋白發(fā)展迅速，已經(jīng)有幾種產(chǎn)品上市或在臨床前研究。未來，需進一步對人源細胞系表達系統(tǒng)進行優(yōu)化，包括載體、細胞系、培養(yǎng)基及反應(yīng)器等方面。相信人源細胞系有望作為替代CHO細胞表達系統(tǒng)表達某些藥物蛋白。當然，由于重組藥物蛋白表達的特殊性，不可能有通用的蛋白表達系統(tǒng)，要根據(jù)重組藥物蛋白的特性、細胞系、載體、反應(yīng)器及成本等多方面考慮，選擇合適的表達細胞系統(tǒng)。