李慧瑾 連媛媛 孫麗君 孫晶瑩 李 元 胡 軍 曹慧玲

(陜西省缺血性心血管疾病重點實驗室，西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所，西安 710021)

流行性感冒是一種由流感病毒感染引起的急性呼吸道傳染病。在甲、乙、丙三種流感中以甲型流感的危害最為嚴(yán)重[1,2]。目前，流感的預(yù)防是一個全球性難題，疫苗接種仍是甲型流感的主要預(yù)防手段。流感病毒表面的糖蛋白血凝素(Hemagglutinin，HA)，具有較強的免疫原性，可以刺激機體產(chǎn)生保護性抗體[3-5]?？乖砦坏淖儺悾沟脵C體先前獲得的免疫無法對新的流感病毒發(fā)揮中和作用，是流感難以預(yù)防的重要原因[6,7]。因此，研究甲型流感病毒HA的結(jié)合位點，有助于為防控流感病毒的感染提供理論依據(jù)。

抗原表位的研究方法有多種[8-10]，如：計算機模擬表位，噬菌體展示技術(shù)篩選多肽小分子，但每種方法都有它的局限性，目前尚無一種準(zhǔn)確有效的方法取得公認(rèn)的規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)和實驗證實。本研究以4株單克隆抗體作為研究對象，通過對噬菌體文庫與計算機模擬篩選的H1N1流感病毒HA結(jié)合位點比較分析，旨在為H1亞型流感病毒的診防治提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實驗材料、試劑 2009年甲型H1N1流感病毒裂解疫苗購自華蘭生物疫苗有限公司；季節(jié)性H1N1流感病毒由大連雅利峰生物技術(shù)有限公司饋贈；4株單克隆抗體由本實驗室制備；Ph.D.-12噬菌體展示肽庫試劑盒購自NEB公司；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗由中杉金橋公司提供；總RNA提取試劑盒和cDNA第一鏈合成試劑盒由北京天根生物公司提供；PCR聚合酶、pMD19-T載體和DNA Marker購自大連TaKaRa公司；引物合成及測序由上海生物工程有限公司和北京華大六合基因有限公司完成。

1.2方法

1.2.1噬菌體展示文庫的篩選 噬菌體展示文庫的篩選根據(jù)試劑盒說明書(#E8110SC)操作。用前期制備的A1-8和H1-13單克隆抗體與其文庫分別作用，將篩選獲得的序列送公司測序并翻譯為對應(yīng)的氨基酸序列。

1.2.2抗體的制備 將合成的多肽分別與弗氏佐劑乳化混合均勻，皮下免疫BALB/c小鼠，每只注射量為20～25 μg。3周后，用同初次免疫完全相同的劑量和方法加強免疫1～2次，融合前的3 d用不含佐劑的抗原腹腔追加免疫1次。細胞融合方法見文獻[11，12]，間接ELISA法篩選分泌抗體的陽性細胞，有限稀釋法進行亞克隆，建立穩(wěn)定的雜交瘤細胞系。

1.2.3抗體的鑒定 抗體的Ig亞類鑒定采用SBA Clonotyping System/HRP抗體亞類鑒定試劑盒測定，具體操作同說明書。

1.2.4計算機模擬抗體結(jié)合位點 首先擴增并克隆獲得單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)序列，通過Ig Blast翻譯找出對應(yīng)的氨基酸序列。根據(jù)獲得的氨基酸序列與中科院生物物理研究所生物信息學(xué)研究組獲得的HA的晶體結(jié)構(gòu)，預(yù)測抗原抗體結(jié)合位點，具體的預(yù)測方法參見文獻[13]。

2 結(jié)果

2.1抗體特性鑒定 從之前制備的84株H1N1單克隆抗體中，選取抗H1N1-HA的特異性單克隆抗體A1-8和具有交叉反應(yīng)的代表性抗體H1-13，進行后續(xù)的分析。為了驗證抗體與抗原的結(jié)合，根據(jù)2009年H1N1的HA序列，合成兩段短肽(11p：包含WGIHH序列；14p：包含WYGYHH序列)，并制備其抗小鼠的單克隆抗體，分別將其命名為anti-11p和anti-14p。對制備的單克隆抗體進行了與2009年H1N1流感病毒的結(jié)合活性、Ig亞類及抗體效價的測定，結(jié)果如表1所示。其中抗體Ig亞類鑒定結(jié)果顯示，4株抗體的輕鏈均為κ鏈，A1-8和H1-13重鏈均為IgG1，anti-11p 和anti-14p 重鏈均為IgM。A1-8的抗體效價為10-3，anti-11p的抗體效價為10-1，anti-14p和H1-13的抗體效價為10-2。

2.2噬菌體文庫篩選獲得抗體結(jié)合的氨基酸位點 通過12肽的噬菌體展示文庫對抗體結(jié)合的序列進行篩選，每組抗體篩選10個克隆。并且對序列中的組氨酸(Histone，H)及精氨酸(Arginine，R)所占的比例進行分析。結(jié)果如表2所示，A1-8抗體結(jié)合的序列中H和R所占比例分別為25.0%、16.7%、25.0%和16.7%；H1-13抗體結(jié)合序列中H和R所占比例分別為50.0%、33.3%和41.7%(下劃線示堿性氨基酸)。并且TQRRSRRRLRTS序列克隆數(shù)占總克隆數(shù)的比例高達50.0%。該篩選結(jié)果提示，H1-13與多種抗原產(chǎn)生的交叉反應(yīng)性可能與其結(jié)合的R和H的比例較高有關(guān)。這和我們課題組預(yù)測的該抗體與多種含卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)的分子可發(fā)生反應(yīng)的結(jié)果相吻合(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。

2.34株流感病毒單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)氨基酸序列的克隆 合成11p和14p序列，免疫制備單克隆抗體，制備方法參考[11,12]。并且對4株抗體A1-8、H1-13、anti-11p和anti-14p的輕鏈和重鏈可變區(qū)序列進行了克隆，獲得序列見表3。

表1H1N1-HA和短肽的抗體特征

Tab.1CharacterizationofantibodiesagainstH1N1-HAortwopeptides

MonoclonalantibodiesBindingactivity with H1N1Ig typingLight chainHeavy chainTiter of mAbA1-83+κIgG110-3H1-133+κIgG110-2anti-11p3+κIgM10-1anti-14p3+κIgM10-2

對4株抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)序列的相似性進行比對分析，結(jié)果(圖1)顯示：4株單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的相似性為72.32%；重鏈可變區(qū)的相似性為71.22%。

2.4計算機模擬HA抗原上與抗體或多肽的結(jié)合位點 用計算機模擬分析抗體與1918年H1N1，2008年H1N1及2009年H1N1的血凝素結(jié)合的氨基酸位點。預(yù)測的抗體A1-8和anti-11p與HA結(jié)合位點完全一致；預(yù)測的H1-13和anti-14p與HA結(jié)合位點完全一致。對兩組抗體與1918年H1N1-HA的結(jié)合位點比較得出，如表4所示，A1-8組結(jié)合的HA位點(49-K,51-I,58-K,70-E,87-S,88-N,143-A,144-G,273-D,274-A,275-P,276-V)包含H1-13組結(jié)合的所有抗原位點(51-I,87-S,88-N,143-A,144-G)；H1-13組結(jié)合的所有抗原位點(48-G,49-V,57-C,69-C,70-E,86-S,273-P,274-V)包含A1-8組結(jié)合的HA位點(48-G,49-V,67-P,271-D,273-P,274-V)中的48-G、49-V、273-P和274-V共4個位點。

表2噬菌體文庫篩選的抗體結(jié)合位點

Tab.2Bindingsitesofantibodiesbyphagedisplay

mAbsProportion of clone Amino acid sequence of binding with mAbsProportion of H and R A1-83/10(30.0%)S L T Q R I H R K S Q I3/12(25.0%)2/10(20.0%)R H K P S P L I M S L N2/12(16.7%)2/10(20.0%)L L P N R L I L Q R Q R3/12(25.0%)3/10(30.0%)L S R I I M I Q S R S P2/12(16.7%)5/10(50.0%)T Q R R S R R R L R T S6/12(50.0%)H1-133/10(30.0%)S L R I R I H T I R M I4/12(33.3%)2/10(20.0%)I R R T R M P N M H R S5/12(41.7%)

Note：The underlining represents basic amino acids.

表34株流感H1N1抗體的可變區(qū)序列

Tab.3AminoacidsequenceoffourmAbsvaribleregionsagainstH1N1-HA

mAbsSequencesVariable regions of the light chainsA1-8 DIVMTQSAFSNPVTLGTSASISCRSSK-SLLHSNGITYLYWFLQRPGQSPQLLIYQMSNLA-SGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELWTFGGGTKLELKH1-13DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQ-SISNNLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSR-FSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPHTFGGGTKLELanti-11p DIVMTQSPAIMSASLGEKVTMSCRASSS-VNYMYWYQQKSDASPKLWIYYTSNLAPGVP-ARFSGSGSGNSYSLTISSMEGEDAATYYCQQFTSSTWTFGGGTKLELKanti-14pDVVMTQAPLSLPVSLGDQASISCRSSQS-LVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSN-RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE-AEDLGVYFCSQSTHVPYTFGGGTKLELKVariable regions of the heavy chainsA1-8 VQLVESGPELKKPGETVKISCKASGYTFT-NYGMNWVKQAPEKDLKWMGWINTNTGE-PTYAEEFKGRFAFSLGTSANTAYLQI-NNLKHEDTATYFCARGRGDYWGQGTTVTVSSH1-13VQLEESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTF-SSYTMSWVRQTPEKRLEWVAYISNGGGSTY-YPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLK-SEDTAMYYCARNYGYGFAYWGQGTTVTVSSanti-11p VKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTF-SSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTY-YPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLK-SEDTAMYYCTRDLTTARGGFAYWGQGTTV-TVSSanti-14pVQLQESGTVLARPGASVKMSCKAS-GYSFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGAIYPGNSD-TSYNQKFKGKAKLTAVTSASTAYMELSS-LTNEDSAVYYCTREGYHGYGFAYWGQGTT-VTVSS

圖1 4株單克隆抗體的氨基酸序列的相似性分析Fig.1 Similarity of amino acid sequences among four mAbsNote:A.Light chain of variable region；B.Heavy chain of variable region.

表4計算機模擬HA抗原上與抗體或多肽的結(jié)合位點

Tab.4BindingsitesofthreeantibodiesonHAantigenbycomputermodeling

mAbsHA binding epitopes1918 H1N12009 H1N1A1-849-K,51-I,58-K,70-E,87-S,88-N,143-A,144-G,273-D,274-A,275-P,276-V48-G,49-V,67-P,271-D,273-P,274-VH1-1351-I,87-S,88-N,143-A,144-G48-G,49-V,57-C,69-C,70-E,86-S,273-P,274-Vanti-11p51-I,87-S,88-N,143-A,144-G48-G,49-V,57-C,69-C,70-E,86-S,273-P,274-Vanti-14p49-K,51-I,58-K,70-E,87-S,88-N,143-A,144-G,273-D,274-A,275-P,276-V48-G,49-V,67-P,271-D,273-P,274-V

3 討論

接種流感疫苗是預(yù)防流感病毒流行的最主要手段[14-16]，甲型流感疫苗的有效性已得到證實，安全性卻受到質(zhì)疑[17,18]，從而影響了它的廣泛推廣及應(yīng)用。計算機抗原表位預(yù)測是依據(jù)抗原包含的氨基酸的物理性質(zhì)和空間結(jié)構(gòu)來進行預(yù)測，但其預(yù)測出的抗原表位能否刺激機體產(chǎn)生抗體，與抗原本身的空間結(jié)構(gòu)和機體的免疫狀態(tài)等多種因素有關(guān)[19]，所以該方法預(yù)測出的抗原表位有一定的局限性。模擬表位可作為抗原的小分子模擬物，其具有分子量小、穩(wěn)定性強及無內(nèi)毒素等優(yōu)點[20]，可以在一定程度上誘導(dǎo)產(chǎn)生天然抗原引起的特異性體液免疫，這為疫苗的設(shè)計制備提供了新的思路。噬菌體展示文庫技術(shù)由于其具有容量大、作用體積小、可多次擴增等優(yōu)點，從而在模擬表位的初步篩選中被廣泛采用[21]。用制備的抗體作為篩選配體，對噬菌體展示文庫進行特異性篩選，有望從中獲得目標(biāo)蛋白的模擬表位。但噬菌體展示文庫也存在缺點，如：在篩選模擬表位時，由于少數(shù)多肽的疏水性過強從而導(dǎo)致噬菌體表面展示的不足；肽庫容量不夠高等缺點。因此，本文通過結(jié)合噬菌體展示技術(shù)和計算機模擬篩選技術(shù)，對4株抗體結(jié)合的抗原表位進行比較，取得了較為理想的預(yù)測結(jié)果。首先，對前期制備的單克隆抗體進行了篩選，選取了一株針對H1N1-HA的特異性單克隆抗體A1-8，與多種HA結(jié)合的有交叉反應(yīng)性的單克隆抗體H1-13。通過噬菌體展示技術(shù)對兩株抗體結(jié)合的多肽進行淘選，結(jié)果顯示與A1-8結(jié)合的10個克隆中多肽的氨基酸沒有典型的特征，而與H1-13結(jié)合的10個克隆的多肽中H和R所占的比例較高，并且富含H和R最多的一組多肽TQRRSRRRLRTS的克隆數(shù)占總克隆數(shù)的比例高達50.0%，提示，H1-13與多種抗原產(chǎn)生的交叉反應(yīng)性可能與其結(jié)合的R和H的比例較高有關(guān)。并且該結(jié)果提示和我們課題組預(yù)測的該抗體與多種含卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)的分子可發(fā)生反應(yīng)的結(jié)果相吻合(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。其次，我們根據(jù)此段序列的氨基酸特征，并結(jié)合2009年H1N1流感病毒的血凝素HA序列，合成了兩段多肽，分別為富含組氨酸H的兩段序列(11p：包含WGIHH序列；14p：包含WYGYHH序列)。將合成的多肽分別免疫小鼠制備單克隆抗體，并對兩株抗體的特性進行分析，結(jié)果提示anti-14p相比anti-11p抗體效價，H1-13相比A1-8的效價均低一個數(shù)量級，這可能和抗體的交叉反應(yīng)性有關(guān)。相對于其他兩株并對A1-8、H1-13、anti-11p和anti-14p共4株單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)序列進行克隆。最后，考慮到2009年H1N1流感與1918年H1N1流感的相似性[22]，我們采用計算機模擬技術(shù)，對4株單克隆抗體的輕重鏈可變區(qū)的氨基酸序列分別與2009年H1N1和1918年H1N1的HA的晶體結(jié)構(gòu)分析，得出結(jié)論，A1-8和anti-14p結(jié)合的HA抗原序列相一致，H1-13和anti-11p結(jié)合的HA抗原序列相一致。此結(jié)果提示噬菌體展示技術(shù)和計算機模擬篩選的抗原表位，在一定程度上是重合的。

綜上所述，本研究通過將噬菌體展示文庫技術(shù)和計算機模擬技術(shù)相結(jié)合篩選抗體抗原結(jié)合位點，為后期研究抗原致病機理提供了實驗基礎(chǔ)。