沈小波 任漢強(qiáng) 陳 偉 龔傳明

(江漢大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，武漢 430015)

甲狀腺癌是常見(jiàn)的內(nèi)分泌腫瘤之一，目前在我國(guó)的發(fā)病率居腫瘤發(fā)病率第10位[1]。近30年來(lái)，甲狀腺癌的發(fā)病率在世界各地呈逐年上升的趨勢(shì)[2]。由于甲狀腺癌的復(fù)發(fā)率較高，致使其不可治愈性和死亡率增加。腫瘤免疫是近年來(lái)腫瘤研究的熱點(diǎn)之一[3]?，F(xiàn)已證實(shí)，多種細(xì)胞因子(如IL-2、IL-12和IFN-γ等)在腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用，已被用于腫瘤的免疫治療[3,4]。IL-18是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子，其結(jié)構(gòu)與IL-1相似，功能與IL-12相似，具有強(qiáng)烈的IFN-γ誘導(dǎo)能力[5,6]。IL-18可通過(guò)多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[7]。報(bào)道指出，IL-18能誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的增殖并增強(qiáng)其活性[8]。IL-18還能促進(jìn)IFN-γ、IL-2、GM-CSF、TNF-α等細(xì)胞因子的產(chǎn)生和分泌，而這些細(xì)胞因子能夠直接殺傷或通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[9]。IL-18的產(chǎn)生可能受腫瘤細(xì)胞或腫瘤發(fā)展相關(guān)因子所誘導(dǎo)。IFN-γ通過(guò)與其表面受體IFNGR結(jié)合向胞內(nèi)傳導(dǎo)信號(hào)，JAK/STAT途徑是IFN介導(dǎo)的經(jīng)典信號(hào)途徑[10]。近期報(bào)道指出IL-18與IFN-γ在乳腺癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌及腎癌等組織中的表達(dá)顯著降低[6,9,11]，提示IL-18水平可能反映人體對(duì)腫瘤細(xì)胞防御反應(yīng)的程度。據(jù)本文作者所知，目前尚無(wú)文獻(xiàn)指出IL-18對(duì)甲狀腺癌的作用。本次研究的目的是探討IL-18抑制甲狀腺癌的作用，并研究其潛在的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1資料來(lái)源 本次研究共納入2015年6月～2017年1月我院收治的123例甲狀腺癌患者作為研究對(duì)象；所有患者中男性64例，女性59例；患者年齡25～71歲，平均(47.8±6.9)歲；患者腫瘤直徑4～13 mm，平均(6.8±1.2)mm。所有患者均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為甲狀腺癌；所有患者均為原發(fā)性甲狀腺癌；所有患者入院前半年內(nèi)均無(wú)任何外科手術(shù)史。排除伴橋本氏甲狀腺炎、甲狀腺功能減退、甲狀腺功能亢進(jìn)等甲狀腺疾病的患者；排除長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)不良患者；排除長(zhǎng)期臥床患者；排除近期及長(zhǎng)期服用影響機(jī)體免疫功能藥物患者；排除并發(fā)其他腫瘤患者；排除伴有嚴(yán)重心肝腎功能障礙的患者；排除伴有全身感染性疾病的患者；排除妊娠期或哺乳期女性；排除中途退出治療、臨床數(shù)據(jù)缺失的患者。另選取20例在我院體檢中心進(jìn)行體檢的健康者作為對(duì)照；對(duì)照組患者的年齡30～58歲，平均(46.4±7.2)歲。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者知曉本研究的方法和目的并簽署知情同意書(shū)。

1.1.2材料與設(shè)備 主要試劑包括人IL-18 ELISA試劑盒(美國(guó)R&D Systems)。重組人IL-18(武漢艾美捷科技有限公司)。IL-18抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)。IFN-γ抗體、p-STAT1抗體(美國(guó)Abcam公司)，STAT1抗體、β-actin抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)。流式抗體包括：FITC標(biāo)記的CD8抗體、APC標(biāo)記的CD4抗體、FITC標(biāo)記的CD56抗體、PE標(biāo)記的CD16抗體(美國(guó)BioLegend公司)。SDS-PAGE試劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)(美國(guó)Gibco公司)，青霉素、鏈霉素(美國(guó)Sigma公司)。小鼠淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?。Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑(Thermo Fisher)。IFN-γ及對(duì)照siRNA(廣州銳博生物科技有限公司)。TPC1細(xì)胞購(gòu)自武漢大學(xué)細(xì)胞庫(kù)。C57BL/6J小鼠購(gòu)自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。TRK-T1與IL-18轉(zhuǎn)基因小鼠購(gòu)自南京大學(xué)南京生物醫(yī)藥研究院。主要設(shè)備包括CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、流式細(xì)胞儀、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀、Bio-Rad垂直電泳儀，Bio-Rad Western blot化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)。

1.2方法

1.2.1血清IL-18水平檢測(cè) IL-18 ELISA試劑盒由美國(guó)R&D Systems提供，使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Tecan infinite F50，瑞士)進(jìn)行檢測(cè)，操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.2小鼠模型的建立 將TRK-T1與IL-18轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行雜交，得到TRK-T1/IL-18雙轉(zhuǎn)基因小鼠[12]。將TRK-T1單轉(zhuǎn)基因與TRK-T1/IL-18雙轉(zhuǎn)基因后代小鼠進(jìn)行比較。記錄兩組小鼠的甲狀腺癌發(fā)生率，繪制小鼠的生存曲線。Western blot和免疫組化分析各組小鼠甲狀腺癌組織中IL-18、IFN-γ及p-STAT1的表達(dá)水平。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組小鼠甲狀腺癌組織中CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞與CD56+CD16+NK細(xì)胞的數(shù)量。

1.2.3免疫組化染色 將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH6.0)高壓鍋抗原熱修復(fù)，加3%H2O2室溫避光孵育30 min，PBS洗 5 min×3次。采用SP法檢測(cè)IL-18、IFN-γ及p-STAT1水平。即用10%正常非免疫羊血清37 ℃孵育60 min，滴加一抗工作液4℃冰箱過(guò)夜，PBS洗5 min×3次。滴加二抗工作液，37℃孵育60 min，PBS洗5 min×3次。滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，37℃孵育60 min，PBS洗5 min×3次。DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片。每個(gè)切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，顯微鏡下觀察染色陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 取100 μl加入抗凝劑的小鼠靜脈血，根據(jù)說(shuō)明書(shū)加入適當(dāng)比例的待測(cè)抗體(CD4、CD8、CD65、CD16)，混勻后室溫避光孵育30 min。向每管中加入1 ml紅細(xì)胞裂解液，室溫避光溶血10 min。1 500 r/min離心5 min，棄上清。加 1 ml PBS洗滌，1 500 r/min離心3 min，棄上清。加0.5 ml PBS重懸細(xì)胞，混勻上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。CD65+CD16+細(xì)胞即為NK細(xì)胞。

1.2.5PBMC中NK細(xì)胞活性的檢測(cè) 按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)分離小鼠PBMC。將分離的PBMC進(jìn)行體外培養(yǎng)，待貼壁后，換無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，將IFN-γ或?qū)φ誷iRNA分別與lipo2000按100 pmol/5 μl混合進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染8 h后換液，使用含100 μg/L IL-18的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)36 h。計(jì)數(shù)細(xì)胞，按每孔2×105細(xì)胞鋪于96孔板中。將TPC1細(xì)胞作為靶細(xì)胞，按效∶靶細(xì)胞=50∶1 比例加入靶細(xì)胞，并設(shè)效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞對(duì)照，MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定NK細(xì)胞活性，酶標(biāo)儀測(cè)570 nm OD值(參考波長(zhǎng)630 nm)。根據(jù)以下公式計(jì)算：NK細(xì)胞活性=[靶細(xì)胞對(duì)照孔OD-(反應(yīng)孔OD-效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔OD)]/靶細(xì)胞對(duì)照孔OD。

2 結(jié)果

2.1患者的基本信息 研究初期共納入146例甲狀腺癌患者，其中9例為甲狀腺疾病患者，6例有近期服用影響機(jī)體免疫藥物史，3例臨床資料不完整，2例并發(fā)其他腫瘤，2例長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)不良，1例長(zhǎng)期臥床。最終123例患者被納入本次研究。所有患者中73例(59.3%)患者的年齡≥45歲；64例(52.0%)為男性。所有患者均為首次行甲狀腺癌手術(shù)者，術(shù)后病理診斷僅包括起源于濾泡上皮細(xì)胞的甲狀腺乳頭狀癌(PTC)、甲狀腺濾泡癌(FTC)、甲狀腺未分化癌(ATC)及起源于濾泡旁細(xì)胞的甲狀腺髓樣癌(MTC)?；颊叩呐R床病理分級(jí)與分期等情況見(jiàn)表1。

2.2患者的血清IL-18及組織IL-18、IFN-γ與p-STAT1水平分析 ELISA結(jié)果顯示，甲狀腺癌患者的血清IL-18水平[(482.4±11.6)pg/L]顯著高于健康者[(31.0±5.7)pg/L](P<0.05)。Western blot及免疫組化結(jié)果顯示，甲狀腺癌患者癌組織中IL-18、IFN-γ及p-STAT1的表達(dá)水平均顯著高于癌旁組織(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2.3小鼠模型的建立與分析 TRK-T1單轉(zhuǎn)基因與TRK-T1/IL-18雙轉(zhuǎn)基因小鼠的甲狀腺癌發(fā)病率分別為27.3%和7.5%，兩者相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TRK-T1/IL-18雙轉(zhuǎn)基因小鼠的生存率顯著優(yōu)于TRK-T1單轉(zhuǎn)基因小鼠(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

表1患者的基本信息

Tab.1Basicdataofpatients

Objectn(%)Objectn(%)Age≥45 yr73(59.3)TNM stageMale64(52.0)Ⅰ17(26.2)Metastasis Ⅱ22(33.8)No metastasis77(62.6) Ⅲ15(23.1)Lymph node metastasis31(25.2) Ⅳ11(16.9)Vascular invasion2(1.6)Pathological typeCapsular invasion11(8.9)PTC/FTC118(95.9)Distant metastasis2(1.6)ATC/MTC5(4.1)

圖1 甲狀腺癌患者癌組織與癌旁正常組織中IL-18、IFN-γ及p-STAT1的表達(dá)Fig.1 Expression of IL-18,IFN-γ and p-STAT1 in tumor and paracarcinoma tissue of patients with thyroid cancer Note:A.Result of Western blot;B.Result of IHC.

圖2 TRK-T1單轉(zhuǎn)基因與TRK-T1/IL-18雙轉(zhuǎn)基因小鼠的生存期分析Fig.2 Survival curve of TRK-T1 single and TRK-T1/IL-18 double transgenic mice

圖3 IL-18對(duì)IFN-γ/JAK-STAT1信號(hào)通路及腫瘤組織中免疫細(xì)胞數(shù)量的影響Fig.3 Effect of IL-18 on IFN-γ/JAK-STAT1 signaling and tumor immuneNote:A，B.Western blot and IHC analysis of IL-18,IFN-γ and p-STAT1 expression in the tumor tissue of mice from different group;C.Flow cytometry analysis of the number of CD4+T,CD8+T and CD56+CD16+ NK cells in the tumor tissue of mice from different group.

圖4 IL-18對(duì)PBMC中NK細(xì)胞活性的影響Fig.4 Effect of IL-18 on activity of NK cells in PBMC

2.4IL-18對(duì)IFN-γ/JAK-STAT1信號(hào)通路及腫瘤組織中免疫細(xì)胞數(shù)量的影響 Western blot和免疫組化分析顯示TRK-T1/IL-18雙轉(zhuǎn)基因小鼠甲狀腺癌組織中IL-18、IFN-γ及p-STAT1的表達(dá)水平均顯著高于TRK-T1單轉(zhuǎn)基因小鼠(P<0.05)。流式分析顯示TRK-T1/IL-18雙轉(zhuǎn)基因小鼠甲狀腺癌組織中CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞與CD56+CD16+NK細(xì)胞數(shù)量均顯著高于TRK-T1單轉(zhuǎn)基因小鼠(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

2.5IFN-γ對(duì)IL-18誘導(dǎo)NK細(xì)胞活化的影響 分離正常C57BL/6J小鼠PBMC，分別轉(zhuǎn)染IFN-γ及對(duì)照siRNA。IL-18處理能顯著增加正常PBMC中NK細(xì)胞的活性(P<0.05)，而不影響轉(zhuǎn)染IFN-γ siRNA的PBMC中NK細(xì)胞的活性(P>0.05)，見(jiàn)圖4。

3 討論

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是近年發(fā)病率上升最快的惡性腫瘤之一[1,2]。隨著對(duì)甲狀腺癌相關(guān)基因、蛋白水平研究的不斷深入，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多基因與其發(fā)生、發(fā)展、局部淋巴轉(zhuǎn)移等有密切聯(lián)系[1]。腫瘤免疫已經(jīng)成為免疫學(xué)的一個(gè)熱門(mén)研究方向，其中，免疫細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子在腫瘤免疫編輯的過(guò)程中發(fā)揮重要功能[4]。IL-18是1995年發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，對(duì)天然免疫的調(diào)節(jié)具有重要作用[5]。近年來(lái)IL-18已被嘗試用于腫瘤的免疫治療，報(bào)道指出IL-18在體內(nèi)廣泛拮抗各種不同腫瘤細(xì)胞[6-8,13]。目前關(guān)于甲狀腺癌免疫治療的臨床實(shí)踐較少，可供研究的資料有限。本次研究的目的是探討IL-18通過(guò)影響腫瘤免疫進(jìn)而抑制甲狀腺癌的作用，并研究其潛在的分子機(jī)制。

IL-18是最新發(fā)現(xiàn)的具有強(qiáng)效抗腫瘤活性的細(xì)胞因子。臨床報(bào)道指出，腫瘤患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞中IL-18R與IFN-γ的表達(dá)顯著降低[14]，表明IL-18功能的調(diào)節(jié)可能與腫瘤發(fā)生或逃逸相關(guān)。IL-18的表達(dá)也隨腫瘤細(xì)胞的類(lèi)型不同而異。Tas等[15]的研究指出，惡性胃癌患者的血清IL-18水平顯著高于正常人，且高血清IL-18與患者的術(shù)后存活率顯著相關(guān)。Carbotti等[16]指出正常卵巢上皮中表達(dá)具有功能活性的IL-18，而這種表達(dá)在卵巢癌組織與細(xì)胞系中出現(xiàn)缺失。與此類(lèi)似，肝癌與胃癌中也缺乏成熟的IL-18表達(dá)[6,15]。因此，抑制IL-18的功能活性或抑制免疫細(xì)胞表達(dá)IL-18R可能是腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的一種機(jī)制。

IL-18是IFN-γ的主要誘導(dǎo)因子[5,6]。IFN-γ可通過(guò)活化細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，增強(qiáng)抗原提呈作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝等發(fā)揮抗腫瘤活性[17]。研究指出，抑制IFN-γ會(huì)導(dǎo)致腫瘤在小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)以及IL-18的抗腫瘤效應(yīng)減弱。IL-18能誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫記憶，促進(jìn)CD4+與CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤效應(yīng)。同時(shí)去除CD4+與CD8+T細(xì)胞可完全抑制IL-18的抗腫瘤效應(yīng)，中和IFN-γ的作用亦可抵消IL-18對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用[17,18]。此外，IL-18能直接促進(jìn)NK細(xì)胞的活性，抑制NK細(xì)胞的活性能顯著抑制IL-18的抗腫瘤效應(yīng)[19]。JAK-STAT途徑是IFN介導(dǎo)的經(jīng)典信號(hào)途徑，IFN-γ與Ⅱ型IFN受體結(jié)合后，誘導(dǎo)JAK1與JAK2的活化，JAK1與JAK2使STAT1的酪氨酸殘基Try701位點(diǎn)磷酸化，從而使STAT1形成同源二聚體，進(jìn)而調(diào)控目的基因的表達(dá)[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌患者的血清IL-18水平顯著高于健康者。甲狀腺癌患者癌組織中IL-18、IFN-γ及p-STAT1的表達(dá)水平均顯著高于癌旁組織。提示IL-18、IFN-γ及JAK/STAT1信號(hào)通路可能在甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。小鼠模型的研究顯示，TRK-T1/IL-18雙轉(zhuǎn)基因小鼠的甲狀腺癌發(fā)病率顯著低于TRK-T1單轉(zhuǎn)基因小鼠，同時(shí)，TRK-T1/IL-18雙轉(zhuǎn)基因小鼠的生存率顯著優(yōu)于TRK-T1單轉(zhuǎn)基因小鼠。TRK-T1/IL-18雙轉(zhuǎn)基因小鼠甲狀腺癌組織中IL-18、IFN-γ及p-STAT1的表達(dá)水平均顯著高于TRK-T1單轉(zhuǎn)基因小鼠。此外，TRK-T1/IL-18雙轉(zhuǎn)基因小鼠甲狀腺癌組織中CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞與CD56+CD16+NK細(xì)胞數(shù)量均顯著高于TRK-T1單轉(zhuǎn)基因小鼠。體外培養(yǎng)PBMC的研究顯示，IL-18處理能顯著增加正常PBMC中NK細(xì)胞的活性，而不影響轉(zhuǎn)染IFN-γ siRNA的PBMC中NK細(xì)胞的活性。

綜上所述，甲狀腺癌患者癌組織中IL-18、IFN-γ及p-STAT1的表達(dá)水平均顯著增高，IL-18可能通過(guò)調(diào)控IFN-γ/JAK-STAT1信號(hào)通路激活CD4+與CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞的活性從而發(fā)揮抑制甲狀腺癌的作用。