彭侃霖，鄭文亞，李春林，童靜嫻，劉 犇

(宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西 宜春 336000)

李氏桿菌病屬于一種人獸共患病，易感動物為羊、豬、牛和兔子等，發(fā)病率低但死亡率高[1]，引起發(fā)病的主要是單核細胞增多性李氏桿菌，可引起組織中單核細胞浸潤，以敗血癥、腦膜炎、孕畜流產(chǎn)或死胎為主要癥狀[2]。在以往的病理學(xué)試驗中，對李氏桿菌致動物病理損傷也有較深入的研究，單核細胞增多性李氏桿菌在動物肝、脾、腎和腦的研究較多[3]，但其對子宮、卵巢和輸卵管造成的組織病理損傷的研究報道非常少，因此本試驗旨在研究單核細胞增多性李氏桿菌對小鼠生殖器官造成的病理損傷。李氏桿菌可以引起母畜的死胎、流產(chǎn)現(xiàn)象，大大降低了出生率，給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[2]，因此，研究李氏桿菌對生殖器官的病理損傷有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與菌種 購買健康、無特定病原菌的雌性昆明系小鼠共12只(湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，體重20.5 g±2.1 g)，25 ℃恒溫飼養(yǎng)2周。山羊源單核細胞增多性李氏桿菌由宜春學(xué)院肉牛(羊)疾病控制實驗室提供。

1.2 試驗設(shè)備與試劑 烘箱、切片機、攤片機、烘片機、顯微鏡、生物安全柜、計時器、染色架、不同濃度的酒精、二甲苯、蘇木精染液、分化液、伊紅染液等。

1.3 動物處理與樣品采集 將小鼠隨機分成兩組，每組8只，對小鼠進行稱重編號，試驗組按0.2 mL/10 g(3×108CFU/mL的細菌生理鹽水懸液)的標準腹腔注射李氏桿菌，對照組腹腔注射相同劑量的滅菌生理鹽水。觀察并記錄接種之后小鼠的異常變化，對死亡的小鼠及時進行剖檢，觀察生殖系統(tǒng)的病理變化并拍照。剖檢小鼠后即刻取出卵巢和子宮，用生理鹽水沖洗后浸入4%多聚甲醛中固定48 h以上。

1.4 組織切片制備與病理學(xué)觀察 取出樣品流水沖洗24 h，依次放入梯度酒精進行脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋。制作4 μm連續(xù)切片，經(jīng)過二甲苯脫蠟、梯度酒精水化、蘇木精-伊紅染色，二甲苯透明后用中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 李氏桿菌感染小鼠臨床癥狀與病理變化 接種后觀察發(fā)現(xiàn)，試實驗組的小鼠被毛雜亂、無光澤，精神亢奮，小鼠出現(xiàn)共濟失調(diào)，行走不穩(wěn)，或無目的的轉(zhuǎn)圈，或躲在暗處，或不斷后退，直至抵住障礙物，嚴重時側(cè)臥、抽搐，對外界的刺激反應(yīng)遲鈍，3 d內(nèi)試驗組小鼠全部死亡。病理剖檢發(fā)現(xiàn)，試驗組小鼠皮膚蒼白，腹下、股內(nèi)等部位出現(xiàn)淤血點，腸系膜淋巴結(jié)腫大，胃腸黏膜充血，觀察生殖器官發(fā)現(xiàn)卵巢和子宮充血水腫，呈現(xiàn)淡粉紅色或暗紅色，部分區(qū)域有出血點或出血斑，子宮內(nèi)可見淡灰紅色滲出液，子宮壁明顯增厚(見封三彩版圖1)。

2.2 李氏桿菌感染小鼠生殖器官的病理組織學(xué)觀察 病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)與對照組相比，試驗組小鼠的子宮角橫切面疏松，組織間隙較大，肌層增厚，縱行肌層異常增生(封三彩版圖2-1A)；血管層血管內(nèi)皮細胞發(fā)生透明，變性(封三彩版圖2-2A)；導(dǎo)致內(nèi)皮破損，血管充血，部分紅細胞滲出進入組織間隙，少量淋巴細胞聚集在血管周圍(封三彩版圖2-2A)；子宮角黏膜固有層淋巴細胞浸潤，并可見腺體萎縮，管腔狹小甚至消失(封三彩版圖2-1B)；腺上皮細胞胞核腫大、淡染(封三彩版圖2-2B)；細胞破裂，胞漿滲出，間質(zhì)淡紅色物質(zhì)增多，少量細胞胞漿固縮深染伊紅，形成均質(zhì)的紅色嗜酸性小體(封三彩版圖2-1B)。子宮內(nèi)膜單層柱狀上皮細胞核染色質(zhì)固縮并崩解成若干碎片，細胞壞死，上皮脫落(封三彩版圖2-1C、2-2C)；固有層淋巴細胞浸潤，大量炎性細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)鮮紅色均質(zhì)半透明物質(zhì)或出現(xiàn)卵圓形細小空泡(封三彩版圖2-1C)；組織細胞部分核幾乎透明，僅見細胞核輪廓(封三彩版圖2-2C)。卵巢髓質(zhì)處血管充血，部分血管內(nèi)膜破損，少量紅細胞逸出至組織間隙，并可見大量炎性細胞(封三彩版圖2-3A)；卵泡內(nèi)顆粒細胞異常增多、腫大，顆粒細胞核可見若干高度濃縮的染色質(zhì)碎片，卵泡腔狹窄，炎性細胞圍繞卵泡腔內(nèi)側(cè)形成新的空腔(封三彩版圖2-3B)；部分黃體可見中央?yún)^(qū)域、甚至全層不同數(shù)量的細胞出現(xiàn)空泡化、壞死，表現(xiàn)完全空泡化、空泡中可見部分濃縮的胞質(zhì)和細胞核或僅見染色質(zhì)邊緣化的細胞核，空泡化細胞旁可見數(shù)量不等的胞質(zhì)深染的細胞(封三彩版圖2-3C)。

3 討論

本試驗所用菌種李氏桿菌自江西某羊場發(fā)病山羊分離得到，通過細菌分離培養(yǎng)、生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定，確診為單核細胞增多性李氏桿菌病，山羊表現(xiàn)嚴重的神經(jīng)癥狀，表現(xiàn)朝向一側(cè)轉(zhuǎn)圈運動、盲目運動或遇障礙物抵住不動，此外，可見單側(cè)眼有膿性分泌物、失明、呼吸困難和母羊流產(chǎn)等癥狀。李氏桿菌通過飲食進入消化道，免疫力降低時該菌就會進入肝臟繁殖，最后進入血液與淋巴循環(huán)系統(tǒng)，到達生殖系統(tǒng)后對生殖器官造成一定程度的影響[4]。本試驗中，病理剖檢發(fā)現(xiàn)，雌鼠子宮腫大充血，病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜上皮脫落、腺上皮不完整、肌纖維變形腫脹、充血出血和部分細胞壞死，這些病理損傷可能干擾早期胚胎發(fā)育、妊娠識別和胚胎著床等生殖活動，造成雌鼠不易受孕，妊娠率降低。此外，可見卵巢卵泡顆粒細胞出現(xiàn)凋亡、黃體細胞發(fā)生空泡化、壞死或凋亡以及卵巢中炎性細胞浸潤等病理損傷，這些現(xiàn)象與受孕率降低相關(guān)，黃體病變表明李氏桿菌對黃體細胞也造成損傷，黃體內(nèi)炎性細胞分泌一些活性物質(zhì)，炎灶內(nèi)物質(zhì)分解代謝加強，酸性代謝物質(zhì)增多，滲透壓增高，正常細胞受到致炎因素干擾，細胞代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)遭到破壞，部分細胞崩解破壞消亡形成空泡，對于妊娠動物來說，黃體細胞遭到破壞將導(dǎo)致孕酮分泌降低，從而使其不易受孕或易發(fā)生流產(chǎn)[5]。李氏桿菌是胞內(nèi)寄生菌，當它受到免疫細胞的威脅時，會侵入細胞內(nèi)躲避追捕，并與原細胞爭奪營養(yǎng)，一般情況下，細菌被吞噬細胞吞噬后會形成吞噬泡，此時溶酶體會與吞噬泡結(jié)合釋放酸性物質(zhì)從而降解菌體，但是李氏桿菌可以分泌溶血素和磷脂酰肌醇特異性磷脂酶，可溶解吞噬體膜使得細菌逃離吞噬體的殺菌物質(zhì)，增加巨噬細胞細胞膜通透性，誘導(dǎo)細胞凋亡，逃離巨噬細胞，進入宿主細胞胞漿汲取營養(yǎng)并大量增殖，對宿主細胞產(chǎn)生不良影響[6-7]。

李氏桿菌病在羊場或牛場常呈散發(fā)性，易造成死亡，并對母畜的生殖器官造成一定的破壞，本試驗結(jié)果證實了李氏桿菌會對未孕雌鼠的生殖器官造成廣泛的損傷，提示李氏桿菌對家畜生殖系統(tǒng)也可能存在較大的病理損傷，可能與養(yǎng)殖場母畜受孕率低、流產(chǎn)和死胎等現(xiàn)象相關(guān)。為了減少李氏桿菌病對養(yǎng)殖場造成的重大經(jīng)濟損失，做好預(yù)防工作非常重要。李氏桿菌可經(jīng)口傳播，抵抗力降低時易感[1]，因此對飼料有一定的要求，應(yīng)提高飼料的營養(yǎng)、保證飼料的品質(zhì)，防止飼料霉變。畜舍要保持干燥通風(fēng)、及時清理糞便、定期進行消毒，并要消滅蚊蟲減少傳播途徑。發(fā)病動物應(yīng)盡快隔離，并對欄舍及所有用具進行消毒，對已死亡的動物要及時無害化處理，減少細菌的傳播。

本試驗通過對感染李氏桿菌小鼠進行病理學(xué)觀察，證實了李氏桿菌能夠嚴重損傷卵巢和子宮等雌性生殖器官，與李氏桿菌感染動物受孕率低下、流產(chǎn)和死胎等相關(guān)，為李氏桿菌病的防治提供參考資料。