徐彤彤 劉治民 邢瀟 張航 梁玉冰 楊建龍

摘? 要：采用氣相色譜法測定月見草子中γ-亞麻酸的含量。采用HP-INNOWAX毛細管色譜柱（40～260℃，30m×320μm×0.50μm）、FID 檢測器，載氣為N2，純度99.999%程序升溫（初始溫度150℃，保持5min然后以5℃/min速度升至240℃保持10min）;分流進樣進樣（20：1）;進樣口溫度為250℃;檢測口溫度為260℃，以外標(biāo)法測定月見草子中γ-亞麻酸的含量。γ-亞麻酸在HP-INNOWAX毛細管色譜柱（40～260℃，30m×320μm×0.50μm）上具有較好的分離效果，其分離度為2.67。γ-亞麻酸的線性范圍為1.2～7.2 mg/min （R2=0.9999） ; γ-亞麻酸平均回收率（ n = 9）為92.4%，RSD 為0.4%。結(jié)論：所建立的方法簡單、準(zhǔn)確、可靠，可用于月見草子的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：月見草子;氣相色譜;γ-亞麻酸;含量測定

中圖分類號：S-3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?? ? ? 文獻標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.11974/nyyjs.20181131007

月見草子為柳葉菜科植物月見草Oenothera biennis L.的干燥成熟種子。俗稱山芝麻、夜來香、東風(fēng)草等。夏末、秋季果實成熟時采收，剪（割）果序，或全株拔起，曬干，壓或敲打，收集種子，除去雜質(zhì)，即得。常見為月見草油的原料藥[1]。

雖然月見草子在市面流通廣泛，但尚未有對其有效成分進行含量控制，因此為完善藥材質(zhì)量的安全、穩(wěn)定、有效、可控，考慮采用氣相色譜法對月見草子中主要成分γ-亞麻酸進行含量測定[2-3] ，并為月見草子的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

研究表明月見草子含有生物堿、氨基酸、不飽和脂肪酸（棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、γ-亞麻酸）、蛋白質(zhì)等，γ-亞麻酸為其月見草子的主要藥效成分[4-5]，具有防止血脂沉積、抑制血小板集聚的作用，可作抗血栓劑，營養(yǎng)補充劑。由于γ-亞麻酸對照品不穩(wěn)定難于購買，因此采用甲酯化法把其轉(zhuǎn)化成衍生物γ-亞麻酸甲酯進行含量測定。

1? ? ?儀器與試藥

Agilent 7890A 氣相色譜儀及工作站（氫火焰離子化檢測器FID）;載氣為高純氮氣（ 大于99.999%）;HP-INNOWAX毛細管色譜柱（40～260℃，30m×320μm×0.50μm）。

γ-亞麻酸甲酯對照品：中國食品藥品檢定研究院，批號： 121134-200001，純度93.7%;水：超純水;12批月見草子藥材均采收于吉林省各地，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)張景龍教授鑒定，具體來源見表1。

2? ? ?方法與結(jié)果

2.1? ? ?色譜條件

采用HP-INNOWAX（40～260℃，30m×320μm×0.50μm）毛細管柱; FID檢測器;程序升溫;150℃恒溫5min后，以5℃/min速度升至240℃，保持10min檢測器溫度為260℃，進樣口溫度為250℃;分流比為20：1;氮氣：3mL/min（純度99.99 %）、氫氣：30mL/min （純度99.99 %）、空氣350mL/min。進樣量：1.0μL。

2.1.1? ? ?對照品溶液的制備

取γ-亞麻酸甲酯對照品適量，精密稱定，加石油醚（30～60℃）制成濃度為4μg/mL的溶液，即得。

2.1.2? ? ?供試品溶液的制備

取樣品粉末（過三號篩）約4g，精密稱定，置索氏提取器中，加石油醚（30～60℃）適量加熱回流（8h）至脂肪油提盡，收集提取液，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上低溫蒸干，在100℃干燥1h，移置干燥器中，冷卻30min。取脂肪油約100mg，精密稱定，于5mL量瓶中，加入2.0mL 石油醚（30～60℃）溶解， 然后邊振蕩邊滴加氫氧化鉀-甲醇溶液（1mol·L-1）1.0mL，密封， 繼續(xù)振蕩1min 后， 靜置10min， 加適量鹽酸溶液至中性， 混勻，加石油醚（30～60℃）至刻度，混勻，離心， 移取上層于另一試管中， 加入無水硫酸鈉， 制成供試品溶液。濾過，取續(xù)濾液，即得[6]。

2. 2? ? ?專屬性試驗

在上述色譜條件下，分別精密吸取供試品溶液、對照品溶液與陰性樣品各1μL，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖（ 見圖1） 。結(jié)果表明，陰性樣品與樣品、對照品相應(yīng)保留時間處未出色譜峰。對照品溶液、供試品溶液的色譜圖見圖1。由圖1 可見，各色譜峰均達到基線分離，對映γ-亞麻酸甲酯的分離度為2.67，符合中國藥典要求;理論板數(shù)按γ-亞麻酸甲酯計算應(yīng)不低于5000 [7，8]。

（a）對照品;（b）樣品;（c）色譜圖

2.3? ? ?線性關(guān)系考察

對照品貯備液精密稱取120.60mgγ-亞麻酸甲酯對照品至10mL容量瓶中，加正己烷至刻度，配制成12.06mg/mL的對照品溶液，搖勻，備用。

分別吸取母液 γ-亞麻酸甲酯：0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、3mL，至5mL容量瓶中， 加正己烷至刻度，記錄γ-亞麻酸甲酯峰面積。

以化合物的峰面積對濃度作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示：γ-亞麻酸甲酯在1.2～7.2mg/mL范圍內(nèi)線性良好，線性回歸方程為：y=378805x-22（R2=0.9999）。

2.4? ? ?精密度試驗

精密吸取對照品溶液1μL，連續(xù)進樣6 次，測定峰面積。結(jié)果γ-亞麻酸甲酯色譜峰面積的RSD為1.0%（n = 6），表明儀器精密度良好。

2.5? ? ?穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下的供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別于0、2、4、6、8、12h進樣分析，測定峰面積計算γ-亞麻酸甲酯的峰面積的RSD為0.96%。穩(wěn)定性結(jié)果表明供試品溶液在12h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6? ? ?重復(fù)性試驗

按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液6份，按“2.1”項下方法，分別進樣，測定峰面積計算γ-亞麻酸甲酯的峰面積的RSD為2.4%（n=6）。表明方法重復(fù)性良好。

2.7? ? ?回收率試驗

回收率試驗采用向已知濃度的供試品溶液中加入已知量的γ-亞麻酸甲酯對照品，計算回收率的百分率，見表2。結(jié)果表明，回收率均在90.7%～93.7%之間（RSD<3%），符合《中國藥典》（2015年版四部通則9101方法測定）。

2.8? ? ?含量測定

采用建立的方法對12批月見草子藥材進行含量測定，按干燥品測定γ-亞麻酸的含量。結(jié)果見表3。

3? ? ?討論

3.1? ? ?甲酯化方法考察

分別考察了氫氧化鉀-甲醇、三氟化硼-乙醚-甲醇溶液和1%硫酸-甲醇3種方法，其中氫氧化鉀-甲醇甲酯化方法測得γ-亞麻酸含量更高，因此選用此方法作為提取方法。

3.2? ? ?含量計算方法

通過外標(biāo)法進行計算，計算結(jié)果乘以γ-亞麻酸甲酯和γ-亞麻酸質(zhì)量分數(shù)的比值，再乘以精密稱取的脂肪油的重量，最終得出月見草子中γ-亞麻酸的含量[9]。

3.3? ? ? 本方法的建立彌補了月見草子含量測定的空白

方法學(xué)考察及實際樣品的測定結(jié)果顯示，本分析方法在通用性、合理性、耐用性，尤其是準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性上均體現(xiàn)了中國藥典標(biāo)準(zhǔn)所應(yīng)具有的要素。本方法操作簡便而快捷，便于在實際生產(chǎn)及檢驗中應(yīng)用，可作為月見草子藥材的含量測定方法，也為含有月見草子的中藥制劑的標(biāo)準(zhǔn)制備提供了參考。

參考文獻

[1]南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典[M].上?？茖W(xué)出版社，1991：51-52.

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[3]顧關(guān)云，王歡，蔣昱.月見草的化學(xué)、藥理與臨床研究[J].國外醫(yī)藥（植物藥分冊），2005，（06）：231-236.

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[8]路萍，賴炳森，王映強，等.毛細管氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測定月見草種子油中γ-亞麻酸的含量[J].中草藥，1997（11）：658-660.

[9]黃崢，盛靈慧，馬康，等.5種脂肪酸甲酯化方法的酯化效率研究[J].中國油脂，2013，38（09）：86-88.