劉 悅，李杉杉，唐詩慧，方步武

（天津醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)系,天津300070）

肝纖維化是當(dāng)肝臟受到反復(fù)的炎癥或慢性致病因素刺激時所進(jìn)行的肝臟代償性修復(fù)反應(yīng)，是所有慢性肝病發(fā)展成肝硬化乃至肝癌過程中所共同經(jīng)歷的病理階段，以原本處于靜止?fàn)顟B(tài)的肝星狀細(xì)胞（HSCs）被激活，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）合成和降解失衡，ECM過度沉積于肝內(nèi)為主要特征[1]。Frideman等[2-3]指出，肝臟在肝纖維化階段尚有逆轉(zhuǎn)的可能性，但如不加以控制和治療，極有可能發(fā)展成肝硬化甚至是肝癌?，F(xiàn)階段西醫(yī)對于肝纖維化的治療途徑主要包括：（1）病因治療，從根本上減少與造成肝損傷的慢性致病因素接觸；（2）刺激正常肝細(xì)胞的再生和修復(fù)；（3）有效控制HSCs增殖，并且促進(jìn)其凋亡；（4）促進(jìn)ECM的分解，使得其合成和降解重新達(dá)到平衡。中醫(yī)對肝纖維化的研究起源于對活血化瘀的研究，屬“徵積”范疇，中藥用于防治肝纖維化的藥物大致可以分為活血化瘀類、疏肝理氣類和清熱解毒類[4]。本課題組在過往的研究中已經(jīng)證實(shí)蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方（HBYYRJ）對于治療免疫性肝纖維化、四氯化碳復(fù)合因素所致肝纖維化、血吸蟲肝纖維化模型以及酒精性肝纖維化均有顯著的治療作用，保護(hù)肝臟免受酒精、化學(xué)毒物和自身代謝性疾病的損傷[5-9]。本研究主要從蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方抗由CCl4誘導(dǎo)的肝臟過氧化損傷著手，首先建立CCl4復(fù)合因素所致的大鼠肝纖維化模型，給予蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方不同治療劑量的治療，測定肝組織內(nèi)羥脯氨酸（Hyp）含量來評估大鼠肝臟肝纖維化程度，測定肝組織內(nèi)Nrf2和NQO1的表達(dá)水平和分布情況來評估蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方抗肝纖維化發(fā)生的作用與抗氧化應(yīng)激通路Nrf2/NQO1之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動物 SPF級健康Wistar大鼠共60只，體質(zhì)量100~130 g，雌雄各半，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物飼養(yǎng)室溫20~24℃，實(shí)驗(yàn)前正常飼養(yǎng)動物1周以適應(yīng)環(huán)境。

1.1.2 蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方 由青蒿、鱉甲、虎杖等9味藥材組成，稱取一定質(zhì)量該復(fù)方，量取6倍體積蒸餾水，先將鱉甲煮至微沸狀態(tài)2 h后，將其余藥材倒入，浸泡2 h，微沸狀態(tài)煮沸1 h后，將所得藥液濾至燒杯，量取等體積60%乙醇，微沸狀態(tài)提取2次，每次2 h，將兩次醇提所得藥液和上述水提所得藥液混勻，懸蒸至所稱藥材的體積，即可得到生藥濃度為1 mg/mL的蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方藥液，密封，4℃保存?zhèn)溆谩?.1.3 試劑 四氯化碳、高氯酸、枸櫞酸、枸櫞酸鈉、對二甲氨基苯甲醛、氯胺T和異丙醇（天津市光復(fù)精細(xì)化工廠）；秋水仙堿（Sigma公司）；兔抗Nrf2抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；鼠抗NQO1抗體（美國Santa Cruz公司）；PV-9001兔超敏二步法檢測試劑盒（中杉金橋生物公司）；PV-9002鼠超敏二步法檢測試劑盒（中杉金橋生物公司）；DAB染色液（上海博士德生物技術(shù)有限公司）；SDS、甘氨酸和丙烯酰胺均為天津市鼎國生物科技有限公司產(chǎn)品；免疫組化一抗稀釋液、RIPA裂解液、蛋白印記一抗稀釋液、蛋白印記二抗稀釋液、蛋白印記一抗二抗去除液（強(qiáng)堿性）、PMSF、EeyoEcl Plus試劑盒、SDS-PAGE凝膠配置試劑盒A盒、SDS-PAGE凝膠配置試劑盒B盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強(qiáng)型）和DTT均為碧云天生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 儀器 FA1004型電子天平（上海HANG PING精密儀器有限公司）；B600型低速自動平衡離心機(jī)（河北安新縣白洋離心機(jī)廠）；OLYMPUS CK-40顯微鏡（上海賴氏電子科技有限公司）；整合分光光度計(jì)（UV-200）；WD-9405A型脫色搖床（北京市六一儀器廠沃德生物醫(yī)學(xué)儀器分公司）；4360型鼓風(fēng)干燥烘箱（Thermo Scientific）；XMTE-8222型水浴鍋（上海驚鴻儀器）；PHS-3C型pH計(jì)（上海雷磁儀器廠）；LS-B50L立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司）；HQ-60-II型漩渦混合器（杭州瑞成儀器股份有限公司）；680型酶標(biāo)儀、垂直電泳槽和小型電泳儀均為BIO-RAD公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及設(shè)計(jì) 將購入的60只Wistar按照隨機(jī)區(qū)組分組的方法隨機(jī)分為正常組、模型組、秋水仙堿組、蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方高劑量組（8.2 g·kg-1）、中劑量組（2.59 g·kg-1）和低劑量（0.82 g·kg-1）組共 6組。正常飼養(yǎng)1周后，開始建立CCl4復(fù)合因素所致的大鼠肝纖維化模型，除正常組外，其余大鼠均第1次皮下注射40%CCl4花生油的容量為5 mL·kg-1，從第2次至建立模型完畢，給藥劑量均為3 mL·kg-1；實(shí)驗(yàn)前兩周，除正常組大鼠給予正常鼠糧飼養(yǎng)外，其余大鼠均進(jìn)食自制高脂高膽固醇飼料，第3周至造模結(jié)束期間，自制鼠糧將不再添加豬油；給藥組大鼠隔日灌胃給予30%乙醇，每只灌胃容量為1 mL；蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方高、中、低劑量組和秋水仙堿組則每日分別灌胃給予蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方藥液和秋水仙堿，模型共建立6周。

1.2.2 標(biāo)本采集 模型周期結(jié)束后，所有大鼠均再持續(xù)飼養(yǎng)1周，用0.5 mL·kg-1腹腔注射25%烏拉坦生理鹽水溶液麻醉后，方可采集標(biāo)本，腹腔靜脈取血后，取肝組織分別保存于Ep管中放置于-80℃超低溫保存箱中凍存，以及盛有固定液和脫水液的西林瓶中，脫水液需要每日更換，直至換夠6次。

1.2.3 指標(biāo)測定

1.2.3.1 比色法測定肝組織內(nèi)Hyp的含量：用研缽將脫水后的肝組織研磨成粉，稱取一定量的粉末于西林瓶中，放置于105℃烤箱內(nèi)高溫烘烤至衡重，稱取烘烤后的粉末40mg于安瓿瓶中，吸入8mL6mmol/L鹽酸，酒精噴燈封口，重新放入105℃烤箱內(nèi)水解18 h后，過濾，各樣本吸取50 μL于離心管內(nèi)，放入60℃烘干，依次加入1.2 mL 50%異丙醇和0.2 mL 0.56%氯胺T溶液反應(yīng)10 min后，加入1 mL ER液，50℃水浴90 min后，用紫外分光光度計(jì)測定各樣本的吸光度值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照公式Hyp含量（μg/mg）=(檢測管吸光度值-空白管吸光度值)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度)×標(biāo)準(zhǔn)管Hyp濃度×稀釋倍數(shù)，計(jì)算各樣本Hyp含量。

1.2.3.2 檢測肝組織內(nèi)Nrf2和NQO1的分布情況：將切片置于玻片架，60℃烘烤2 h，依次放入二甲苯、無水乙醇、95%、85%和70%乙醇中脫蠟后，轉(zhuǎn)入3%過氧化氫甲醇溶液中滅活15 min，浸泡于pH=6的醋酸-檸檬酸緩沖液中，126℃修復(fù)5 min，待液體自然放涼后，正常羊血清封閉30 min后，孵育一抗Nrf2（1∶100）和 NQO1（1∶80），4 ℃過夜，次日，棄去一抗，分別滴加試劑I和試劑II，并37℃孵育30 min，DAB顯色后，蘇木素染色，中性樹膠封片，晾干，使用熒光顯微鏡采圖進(jìn)行分析。

1．2．3．3 檢測肝組織內(nèi) Nrf2 和 NQO1 表達(dá)水平：使用勻漿器將凍存的肝組織制備成勻漿，按照PIRA∶PMSF=99∶1 的比例，冰上裂解 1 h 后，以 2 000×g的轉(zhuǎn)速，4℃離心10 min后，收集上清，按照BCA蛋白濃度檢測盒說明書步驟進(jìn)行蛋白定量，計(jì)算上樣量，蛋白變性后即可上樣，30%聚丙烯酰胺凝膠電泳，全濕式電轉(zhuǎn)法將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉水平搖床上封閉2 h后，將各條帶放入相應(yīng)的雜交袋中孵育一抗Nrf2（1∶400）和NQO1(1∶100)，4℃搖床過夜，次日，將條帶取出，TBST充分漂洗3次，5 min/次，重新放入雜交袋內(nèi)孵育二抗抗鼠β-actin（1∶1 000）和抗兔β-actin（1∶1 000），常溫水平搖床孵育2 h后，TBST充分震蕩洗滌4～5次，5 min/次，按照EeyoEcl Plus試劑盒說明書，曝光。使用Quantity One凝膠軟件分析系統(tǒng)分析各蛋白條帶的光密度值。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 16．0軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料均以±s表示，樣本間均數(shù)的比較采用單因素方差分析（one-way，ANOVA）的方法進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2．1 蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方對四氯化碳復(fù)合因素所致大鼠肝纖維化肝組織內(nèi)Hyp含量的影響 與正常組相比，模型組的Hyp含量顯著升高（P＜0．05），說明CCl4復(fù)合因素所致大鼠肝纖維化建模成功；與模型組相比，給藥組的 Hyp 含量明顯降低（P＜0．05）（表 1）。

表1 蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方對四氯化碳復(fù)合因素所致大鼠肝纖維化肝組織內(nèi)Hyp含量的影響Tab 1 Effect of HBYYRJ on the content of Hyp of CCl4-induced rats hepatics fibrosis （±s）

表1 蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方對四氯化碳復(fù)合因素所致大鼠肝纖維化肝組織內(nèi)Hyp含量的影響Tab 1 Effect of HBYYRJ on the content of Hyp of CCl4-induced rats hepatics fibrosis （±s）

與正常組相比，*P＜0．05；與模型組相比；#P＜0．05；與 HBYYRJ高劑量相比，△P＜0．05；與 HBYYRJ中劑量組相比，□P＜0．05

分組正常組模型組秋水仙堿組HBYYRJ 8．2 g·kg-1 HBYYRJ 2．59 g·kg-1 HBYYRJ 0．82 g·kg-1含量of Hyp/（μg/mg）0．210±0．012#△□0．368±0．013*△□0．280±0．047*#0．272±0．027*#0．298±0．021*#0．322±0．051*#△

2．2 蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方對四氯化碳復(fù)合因素所致大鼠肝纖維化各組大鼠肝組織內(nèi)Nrf2和NQO1分布的影響 Nrf2的分布情況見圖1，與正常組和模型組相比，秋水仙堿組以及蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方各劑量組Nrf2核轉(zhuǎn)位顯著增加，且高劑量組和中劑量組Nrf2核轉(zhuǎn)位顯著高于低劑量組。NQO1的分布情況見圖2，各組NQO1的分布與Nrf2的核轉(zhuǎn)位比較結(jié)果基本保持一致。

圖1 各組大鼠肝組織內(nèi)Nrf2分布情況的檢測結(jié)果Flg 1 The distribution of Nrf2 in the liver tissue of each group

圖2 各組大鼠肝組織內(nèi)NQO1分布情況的檢測結(jié)果Flg 2 The distribution of NQO1 in the liver tissue of each group

2．3 蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方對四氯化碳復(fù)合因素所致大鼠肝纖維化各組大鼠肝組織內(nèi)Nrf2和NQO1表達(dá)水平的影響 各組大鼠肝內(nèi)NQO1的表達(dá)水平見圖3，Nrf2的表達(dá)水平見圖4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與模型組相比，HBYYRJ高中低3個劑量組NQO1和Nrf2 的表達(dá)水平明顯升高（P＜0．05），與高劑量組相比，中劑量組大鼠肝組織內(nèi)Nrf2和NQO1表達(dá)水平并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但低劑量組肝組織內(nèi)的Nrf2和NQO1 表達(dá)水平明顯降低（P＜0．05）。

圖3 各組大鼠肝組織中NQO1表達(dá)水平的檢測結(jié)果Fig 3 The expression level of NQO1 in liver tissue of each group

圖4 各組大鼠肝組織中Nrf2表達(dá)水平的檢測結(jié)果Fig 4 The expression level of Nrf2 in liver tissue of each group

3 討論

HSCs作為正常肝組織非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的組成部分，正常生理狀態(tài)下，處于靜息狀態(tài)存在于狄氏間隙中，但當(dāng)肝臟受到各種慢性致病因素如酒精、脂肪蓄積、化學(xué)毒物、膽汁淤積或某些代謝性疾病長期損傷時，會刺激庫弗細(xì)胞和竇內(nèi)皮細(xì)胞等分泌大量的炎癥因子、趨化因子和ROS等，從而激活HSCs，被活化的HSCs開始逐漸轉(zhuǎn)化為具有彈性的肌成纖維細(xì)胞（MFB），并通過自分泌和旁分泌的途徑不斷合成大量的ECM，ECM合成和降解失衡，在肝組織內(nèi)過度蓄積，就直接導(dǎo)致了肝纖維化的發(fā)生[10]。膠原蛋白是ECM的主要成分，而羥脯氨酸，作為人體的一種非必須氨基酸，也是膠原蛋白的主要成分，所以肝組織中Hyp的含量即可直接反映膠原蛋白的含量，從而客觀反映肝組織內(nèi)ECM的沉積狀況和肝纖維化程度。研究結(jié)果表明，與正常組相比，模型組 Hyp 含量大大提高（P＜0．05），說明此次建立四氯化碳復(fù)合因素所致的大鼠肝纖維化模型成功；與模型組相比，蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方各給藥組Hyp的含量顯著降低（P＜0．05），說明蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方可以有效緩解肝組織內(nèi)ECM的沉積，從而抑制肝纖維化發(fā)生。

四氯化碳作為最經(jīng)典、最常見的廣泛用于誘導(dǎo)動物或者細(xì)胞建立急性實(shí)驗(yàn)性肝纖維化模型的化學(xué)毒性物質(zhì)[11]，其誘導(dǎo)原理為：CCl4進(jìn)入細(xì)胞后，細(xì)胞色素P450首先將其代謝為三氯甲基自由基（CCl3`），CCl3·與氧反應(yīng)，生成三氯甲基過氧化自由基（CCl3OO·），刺激庫弗細(xì)胞生成大量的ROS和細(xì)胞因子，激活HSCs,導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷和脂質(zhì)過氧化反應(yīng),生成的最終產(chǎn)物丙二醛等，會損傷細(xì)胞膜的流動性和完整性，從而損傷肝組織結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而誘發(fā)肝纖維化[12-13]。本研究就肝纖維化形成過程中發(fā)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)展開探討，著重研究Nrf2/ARE信號通路在蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方發(fā)揮抗肝纖維化發(fā)生中的作用。正常生理狀態(tài)下，Nrf2與Kea1蛋白藕聯(lián)存在于胞漿中，遵循正常的合成和降解的過程，但是當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激或者親電試劑刺激時，Nrf2與Keap1解偶聯(lián)，轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與胞核內(nèi)的抗氧化反應(yīng)元件ARE結(jié)合，從而啟動該通路下游抗氧化酶和II相解毒酶的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激。由此可見，在Nrf2/ARE信號通路保護(hù)細(xì)胞免受過氧化損傷的過程中，Nrf2與Keap1解偶聯(lián)，進(jìn)入細(xì)胞核是該過程的關(guān)鍵性環(huán)節(jié)，所以Nrf2與細(xì)胞核的結(jié)合數(shù)量，就可以體現(xiàn)該通路的表達(dá)程度，Nrf2與細(xì)胞核結(jié)合的越多，說明該通路信號表達(dá)越強(qiáng)，相應(yīng)地，其下游轉(zhuǎn)錄的抗氧化酶和II相解毒酶表達(dá)水平也就越高。受到該通路調(diào)控表達(dá)的酶有許多，比如血紅素加氧合酶-1(HO-1)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)以及本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究的NAD(P)H:醌氧化還原酶I(NQO1)[14]。NQO1是一種溶解于細(xì)胞質(zhì)，普遍存在的同型二聚體黃素酶，屬于II相解毒酶范疇，可以直接催化醌類化合物失去2個電子從而被還原為水合醌類（氫醌），大多數(shù)氫醌均可與谷胱甘肽或者葡萄糖醛酸形成共軛穩(wěn)定地存在于細(xì)胞內(nèi)或者直接被排除體外，區(qū)別于其他氧化還原酶的是，該催化過程中沒有單電子還原產(chǎn)物、半醌以及自由基等氧化產(chǎn)物的形成，從而保護(hù)細(xì)胞免受一系列過氧化損傷[15]。

本研究結(jié)果顯示，就Nrf2的核轉(zhuǎn)位以及NQO1的表達(dá)而言，模型組明顯低于正常組，而正常組又明顯低于蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方各給藥劑量組，該結(jié)果與上述實(shí)驗(yàn)猜想一致，蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方可以有效地上調(diào)Nrf2/NQO1通路的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)Nrf2的核轉(zhuǎn)位，上調(diào)NQO1的表達(dá)水平，促進(jìn)醌類化合物還原為氫醌，形成穩(wěn)定的共軛結(jié)構(gòu)或者直接排除體外，從而緩解由CCl4所誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞免受過氧化損傷。蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方抑制由CCl4復(fù)合因素誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化發(fā)生的作用機(jī)制是多方面的，本實(shí)驗(yàn)主要從抗氧化應(yīng)激的層面逐步展開探討，證實(shí)了蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方可以有效地上調(diào)抗氧化應(yīng)激通路Nrf2/NQO1的表達(dá)，促進(jìn)Nrf2的核轉(zhuǎn)位，上調(diào)其下游抗氧化酶的表達(dá)，同時有效降低肝組織內(nèi)Hyp的含量，緩解ECM的過度沉積，達(dá)到抵抗CCl4復(fù)合因素誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化發(fā)生的作用，為臨床上提供了新的治療肝纖維化疾病的思路，為研究開發(fā)抗肝纖維的新藥提供了新的依據(jù)和治療靶點(diǎn)。

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