叢倩倩，蘭玉菲，崔曉，安秀榮

（泰安市農業(yè)科學研究院，山東泰安271000）

平菇（Pleurotus ostreatus），又名糙皮側耳，隸屬于真菌門擔子菌綱（Basidiomycetes）傘菌目（A-garicales）側耳科（Pleurotaceae）側耳屬（Pleurotus），是我國栽培面積最廣泛的食用菌之一[1]。平菇營養(yǎng)物質豐富，適應性強，栽培成本低，周期短，且栽培原料能就地取材，可為栽培者帶來良好的經濟效益。但是，在平菇菌種生產種植過程中可能會受到一些病毒的侵染，導致子實體畸形，品質下降，產量降低甚至絕收[2]。

病毒的檢測和診斷是預防和控制病毒病害的關鍵技術環(huán)節(jié)，對生產實踐具有重要的指導意義。相對于其他作物病毒病害的研究，食用菌病毒病害的研究范圍較窄，研究基礎較為薄弱。目前，對食用菌病毒的檢測和鑒定通常采用電鏡法[3-4]、血清學方法[5-6]、dsRNA技術[7-10]、PCR[11-12]等。上述方法僅在對病原物特征有預先了解的情況下使用，而在對病原物了解缺乏的情況下，這些檢測方法的使用就受到了極大的限制。

應用siRNA高通量測序技術鑒定病毒是近幾年快速發(fā)展起來的一項技術。在病毒與寄主的互作中，病毒復制產生的雙鏈RNA（dsRNA）可以被寄主體內Dicer酶切割成大量針對入侵病毒的小干擾RNA（siRNA）[13-14]。siRNA分子量較小，長度為20 nt～25 nt，很容易與細胞中的其他RNA區(qū)分，因此可以利用高通量測序技術對病毒產生的siRNA序列進行測序，并利用軟件對測序結果進行組裝，組裝結果與數據庫進行比對來鑒定和發(fā)現新病毒[15-18]。

本研究利用siRNA高通量測序技術，檢測疑似被病毒侵染的平菇樣品中是否攜帶病毒，旨在為其他種類食用菌的病毒檢測鑒定提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

平菇樣品采集于山東省聊城市鄭家鎮(zhèn)，樣品表現癥狀為子實體球形變小，菌蓋黃褐色，見圖1。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取與質量檢測

圖1 平菇樣品癥狀Fig.1 Sample symptoms of Pleurotus ostreatus

將5個平菇樣品混合后，采用Trizol法提取總RNA?？俁NA用干冰保存，送往北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行測序。測序前需對RNA的質量進行檢測，包括：分析RNA是否降解及其是否有污染，檢測RNA的純度和完整性，精確定量RNA的濃度。

1.2.2 文庫的構建

樣品檢測合格后，使用Small RNA Sample Pre Kit構建cDNA文庫。

1.2.3 測序數據過濾

構建好的文庫利用Illumina HiSeqTM 2000進行測序。為了保證分析質量，必須對測序數據進行過濾，去除接頭序列和低質量的讀段（reads），得到干凈的讀段（clean reads），最后選取18 nt～26 nt的reads來進行后續(xù)分析。

1.2.4 siRNA的序列拼接和候選病毒篩選

所得的序列去除3’接頭，然后分別利用PFOR（參數為-x4）和Velvet（參數為k-mer 17）軟件對篩選所得siRNA進行序列拼接，獲得較長的重疊群（contigs）。首先將拼接所得的contigs與寄主基因組數據庫（Host Genome）進行比對，除去寄主的基因組序列，然后將剩余的contigs用BLASTN與核酸數據庫（NCBI Nt）進行比對，尋找與這些contigs高度同源的序列，再然后用BLASTX將沒有找到高度同源序列的contigs與蛋白數據庫（NCBI Nr）進行比對，尋找與contigs部分同源的序列，最后將與contigs高度同源序列和部分同源序列分別與病毒核酸數據庫（Virus RefSeq Nucleotide）和病毒蛋白數據庫（Virus RefSeq Protein）進行比對，篩選出和病毒序列同源的contigs，從而得到候選病毒。比對采用參數限制e期望值（e-value）（1e-6 for BLASTN，1e-4 for BLASTX）。

1.2.5 PCR驗證

根據所得候選病毒，設計特異性引物分別進行擴增以進一步驗證測序結果的準確性。

2 結果與分析

2.1 平菇樣品總RNA質量分析

平菇樣品總RNA質量分析結果見表1，檢測結果合格，符合建立cDNA文庫的要求。

表1 平菇樣品總RNA質量分析Tab.1 Quality analysis on total RNA of Pleurotus ostreatus

2.2 測序數據質量情況

對siRNA測序結果進行分析，去除接頭序列和低質量的讀段，測序得到的數據統(tǒng)計結果見表2。

對數據庫的測序質量進行評估，其中干凈的讀段占總讀段的百分比達到了95%以上，表明測序質量較高，達到信息分析的要求。

2.3 siRNA的拼接與注釋

5個數據庫所注釋的contigs維恩圖和結果統(tǒng)計見圖2和表3。

從clean reads中篩選長度18 nt～26 nt的siRNA來進行后續(xù)分析，經長度篩選后所得的總reads數為2 749 087。使用PFOR軟件和velvet軟件對篩選的siRNA進行序列拼接，得到總的重疊群數為479，將拼接所得的contigs分別與Host Genome、NCBI Nr、NCBI Nt、Virus RefSeq Nucletide和Virus RefSeq Protein五個數據庫進行比對，發(fā)現被Host Genome注釋所得的contigs數為85，未被Host Genome而只被NCBI Nr和NCBI Nt注釋的contigs數分別為5和17，被Virus RefSeq Nucleotide和Virus RefSeqProtein注釋所得的contigs數分別為2和7。

表2 測序數據質量統(tǒng)計Tab.2 Quality statistics of sequencing data

圖2 5個數據庫所注釋的contigs維恩圖Fig.2 Contigs Venn diagrams annotated by 5 databases

2.4 候選病毒檢測結果

在以上分類注釋結果中分離與病毒相關的con tigs，其病毒檢測結果見表4。

從結果可以看出，文庫中檢測到8種候選病毒。其中，與Burdock mottle virus同源的contigs數目最高為3，其次檢測到了與Choristoneura occidentalisgranulovirus和Beet soil-borne mosaic virus同源的contigs數都為2，樣本中還檢測到與Culex originated Tymoviridae-like virus、Fig fleck-associated virus、Beet necrotic yellow vein virus、Blackberry virus E、Grapevine fleck virus同源的contigs數都為1。由于檢測到的與8種病毒同源的contigs數目均較少，而且能比對上的contigs總長度都較短，因此測序結果需要進一步的試驗驗證才能明確所采集的樣品里是否含有這幾種病毒。

表3 5個數據庫所注釋的contigs結果統(tǒng)計Tab.3 Contigs statistics annotated by 5 databases

表4 平菇siRNA文庫病毒檢測結果Tab.4 Detection results of virus in Pleurotus ostreatus siRNA library

2.5 RT-PCR驗證

根據序列拼接結果，設計針對這八種候選病毒的特異性引物，利用RT-PCR方法進行擴增驗證，RT-PCR結果卻未檢測到目的條帶，說明采集的平菇樣品中不存在這八種病毒，推測平菇球形癥狀的產生可能不是由于病毒侵染所導致的。

3 討論

常規(guī)的檢測方法在病毒檢測和新病毒發(fā)現中存在一定缺陷，適用于研究比較清楚的病毒，其針對性強，但對于新病毒的發(fā)現較困難。與其相比，應用深度測序技術可在病毒序列、特征等信息未知情況下，只需要提取樣品總RNA，通過篩選，建立小RNA文庫，然后對小RNA進行測序，并通過組裝來檢測和發(fā)現病毒，靈敏度高，適用性強，獲得的信息豐富。近年來，利用siRNA深度測序技術已在鑒定許多動植物的未知病原物中發(fā)揮重要作用[15-18]。

目前，對食用菌病毒研究相對較少，可以利用的序列信息也較少，利用常規(guī)檢測方法難以對食用菌病毒做到全面檢測和鑒定，特別是尚未報道的病毒[19]。本研究利用siRNA高通量測序技術直接對球形平菇樣品中提取的siRNA進行測序和生物信息學分析，鑒定其是否受病毒侵染，結果證明本研究采集的球形平菇樣品中不存在病毒，表明這種癥狀的產生并不是由病毒侵染所導致的。平菇畸形癥狀產生的原因有很多，包括栽培環(huán)境不適宜、管理不當、菌種退化或變異等，我們所采集的樣品具體由哪種原因所導致還有待于進一步的試驗證明。

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