崔雪陽 綜述 邢承忠 審校

惡性腫瘤的發(fā)生主要是由于調控細胞增殖、分化的基因不斷變異累積造成。一直以來，組織標本是癌癥診斷的金標準，也是確定預后以及監(jiān)測治療的基石。通過組織樣本獲取的腫瘤分子表達譜不能反復獲得，只能提供腫瘤異質性的“快照”，且分子譜常隨著疾病的進展而發(fā)生變化。在癌癥進展和治療過程中，由于內源性及外源性的選擇壓力作用，腫瘤細胞的多個亞克隆種群相互競爭，促進優(yōu)勢子克隆體出現(xiàn)，而這些克隆體具有復制及轉移能力強、治療敏感性差等特點，最終導致腫瘤進展及耐藥發(fā)生[1-3]。

在腫瘤精準治療時代，有限的組織標本不能及時了解所有的腫瘤基因組變化，這可能錯失治療良機。而近年來引起極大關注的“液體活檢”(Liquid biopsy，LB)可能會彌補這些不足。本文將針對結直腸癌領域的液體活檢進行簡要概括。

1 液體活檢的生物學基礎

液體活檢技術主要通過無創(chuàng)手段提取血液、尿液、唾液、胸腔積液、腦脊液甚至糞便等，而這些體液都已經(jīng)被證實包含腫瘤來源的基因物質?，F(xiàn)有研究證實[4-6]，液體活檢能夠測定癌癥患者的基因譜、監(jiān)測治療反應、評估耐藥性的發(fā)生、量化微小殘留病灶。

1.1 循環(huán)腫瘤細胞(Circulating tumor cells，CTCs)

CTCs最早于1896年由澳大利亞的Thomas Ashworth在轉移性腫瘤患者血液中發(fā)現(xiàn)，但是直到近15年才引起廣泛關注。CTCs主要指腫瘤患者原發(fā)灶或者轉移灶釋放入外周血循環(huán)的腫瘤細胞，可以以單個細胞或者細胞簇形式存在[7]，通常CTCs濃度很低，在大多數(shù)腫瘤患者中，每10 mL外周血中能夠分離出1～10個細胞[8]。目前分離CTCs的技術多種多樣，例如，CTCs可以通過其大小及生物、物理性質進行陰性富集，或者通過這些細胞表面常表達的生物標志物，如上皮細胞黏附分子(Epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)來進行陽性富集[9]?，F(xiàn)有研究證實CTCs與腫瘤侵襲和轉移有關，并且CTCs的數(shù)量與治療效果及總生存期呈負相關[7]。即使在原發(fā)灶尚未出現(xiàn)癥狀之前，CTCs也極有可能在遠處停留，并處于休眠狀態(tài)，一段時間之后，休眠的細胞被重新激活，導致腫瘤轉移，但其機制目前尚不清楚[10]。

1.2 循環(huán)腫瘤DNA(Circulating tumor DNA，ctDNA)

ctDNA是壞死或凋亡的腫瘤細胞釋放入外周血的DNA片段，主要來源于原發(fā)性腫瘤、CTCs、微轉移灶及轉移灶。ctDNA包含與其同源腫瘤細胞相同的基因缺陷，例如點突變、基因重組、擴增甚至基因拷貝數(shù)的變異等[11]。據(jù)統(tǒng)計，每天大約有3%的腫瘤DNA進入外周血循環(huán)中，而從腫瘤細胞中獲得的ctDNA的比例差別較大(1.4%～47.9%)，這在很大程度上取決于腫瘤的大小和分期[12]。并且，一旦進入循環(huán)系統(tǒng)，ctDNA通過肝臟、腎臟等快速清除，半衰期從16分鐘到數(shù)小時，雖然這帶來檢測上的挑戰(zhàn)，但是能夠反映腫瘤的實時變化狀態(tài)[11]。

1.3 外泌體

外泌體是一類直徑為40～100 nm的胞外盤狀囊泡，可由血細胞、上皮細胞、免疫細胞、血小板及平滑肌細胞等通過內分泌及旁分泌的方式釋放到多種體液中，進而影響臨近細胞及遠處區(qū)域的生物學行為及功能。其內容物包括蛋白質、脂類、DNA、mRNA、miRNA及LncRNA等，通過調節(jié)受體細胞活性，在細胞通信及物質運輸方面發(fā)揮重要作用[13]。并且，腫瘤來源的外泌體可以調節(jié)宿主微環(huán)境，刺激新生血管形成、增強腫瘤侵襲能力，最終導致疾病進展及遠處轉移[14]。

1.4 基于腫瘤血小板的RNA測序

腫瘤血小板(Tumor-educated blood platelets，TEPs)是腫瘤相關生物學信息的另一種來源，作為全身及局部反應的中心分子，與腫瘤細胞相互作用，改變RNA表達譜，進而影響腫瘤的生長和擴散。Best等[15]研究者對不同類型的局部和轉移性腫瘤患者及健康個體進行TEPs的RNA測序，結果提示其區(qū)分腫瘤的準確率達到96%，并且可以區(qū)分6種不同類型腫瘤，其判斷原發(fā)腫瘤位置準確率達71%。因此，TEPs作為一種新興的液體活檢，可用于泛腫瘤分析、區(qū)分腫瘤類型以及腫瘤基因突變的診斷。

2 液體活檢與結直腸癌的研究熱點

2.1 在結直腸癌診斷中的作用

研究表明液體活檢技術因其非侵入性、敏感性高等優(yōu)勢，結合不同的生物學標志物，可用于結直腸癌的早期診斷。目前，臨床最普遍快捷的篩查結直腸癌的方式是便潛血試驗及糞便免疫化學試驗，雖然這兩種非侵入性方法都有助于降低結直腸癌的死亡率，但是特異性及敏感性較低[16]。Bettegowda等[17]通過數(shù)字PCR技術(Digital PCR，dPCR)發(fā)現(xiàn)100%的轉移性結直腸癌患者能夠檢測到ctDNA，而非轉移性患者的檢測率達73%?；羝战鹚拱┌Y中心通過新型的CancerSEEK方法，能對16個癌癥基因突變及10種循環(huán)中的蛋白標記濃度進行評估。對1 005名已被診斷罹患8種常見類型癌癥的I～III期患者以及812名健康對照者進行了研究；CancerSEEK檢測到癌癥的敏感性為69%～98%，特異性為99%。因此，CancerSEEK方法有利于癌癥的早期發(fā)現(xiàn)，降低死亡率[18]。

多項試驗證實外泌體包含的miRNA及蛋白組分的敏感性及特異性明顯高于目前臨床中應用的腫瘤標志物CEA、CA19-9。最近，Ogata等[19]分析對比了結直腸癌患者與健康人群血清中16種外泌體來源的miRNA，其中l(wèi)et-7a、miR-21、miR-23a、miR-150、miR-223、miR-1229、miR-1246含量在患者血清中顯著升高，而手術切除后這些miRNA水平下調，并且miR-23a和miR-1246檢測早期結直腸癌敏感性分別為95%、90%。采用高度敏感的ExoScreen分析技術，檢測到結直腸癌細胞系外泌體表面存在膜蛋白CD147，并在患者血漿外泌體中得到相同結果，預示著CD147可能在未來成為早期診斷結直腸癌的指標[20]。

2.2 在結直腸癌預后中的作用

液體活檢不僅能夠早期診斷結直腸癌，而且可以評估疾病復發(fā)、預后及轉移。在腫瘤轉移的過程中，CTCs的存在可能是最早的亞臨床階段。一項對95例非轉移性結直腸癌患者進行2年術后隨訪的研究顯示，CTCs基線數(shù)量≥5的患者在根治性術后1年內發(fā)生遠處轉移的比率是CTCs<5的8倍，這意味著CTCs可以作為無病進展生存期及總生存期的獨立預測因素[21]。另一項研究分析194名晚期肝轉移患者的預后情況時發(fā)現(xiàn)，CTCs陽性與不可切除的肝轉移瘤密切相關，這也提示CTCs能夠影響肝轉移瘤的治療決策[22]。

Reinert等[23]開發(fā)了一項基于ctDNA的個性化檢測方法，并通過dPCR技術評估量化了6位復發(fā)性結直腸癌及5位非復發(fā)性結直腸癌患者血漿的ctDNA及體細胞結構變異水平，研究結果證實ctDNA與傳統(tǒng)的隨訪方法相比，可以提前10個月檢測到腫瘤術后復發(fā)，其敏感性及特異性達100%。因此，對于根治性手術后的非轉移患者而言，ctDNA能夠在影像學及臨床證實復發(fā)之前，捕捉和監(jiān)測微小殘留病灶，并通過基因組的改變早期預測腫瘤復發(fā)。

血清中外泌體來源的miR-19a及miR-17-92基因簇的表達水平與結直腸癌復發(fā)呈正相關，并且miR-19a的高水平表達也預示著疾病進展及預后不良[24]。而外泌體蛋白質組學揭示了整合素α6β4、α6β1與肺轉移相關，αvβ5與肝轉移有關，這也表明不同的整合素表達模式可以預測器官特異性轉移[25]。另一項研究表明，外泌體來源的miR-200家族表達缺失，將導致腫瘤細胞更容易侵入血管及淋巴管，并且在5-氟尿嘧啶耐藥的細胞系中同樣觀察到外泌體分泌的miR-200家族表達水平下降。這提示了外泌體miR-200家族的缺失，將導致腫瘤侵襲性增加，更易耐藥[26]。

2.3 在結直腸癌治療中的作用

在臨床實踐中，Ⅱ期結直腸癌化療帶來的絕對生存獲益有限以及引起諸多不良反應，導致Ⅱ期結直腸癌是否需要化療一直存在爭議。一項關于Ⅱ期結腸癌術后患者的前瞻性研究指出，在未接受輔助化療的178名患者中，14名在術后檢測到ctDNA，其中11人(占79%)在27個月的隨訪中復發(fā)，而其余164名ctDNA陰性患者中，僅有16例復發(fā)(HR=18，95%CI：7.9～40)。另一組接受化療的患者，化療結束后ctDNA的存在同樣降低了無復發(fā)生存率(HR=11，95%CI：1.8～68)。所以，在Ⅱ期結腸癌切除術后，ctDNA可以為微小殘留病灶提供直接證據(jù)，同時識別發(fā)風險高的患者，有助于制定輔助治療決策[27]。

在局部晚期直腸癌(Locally advanced rectal cancer，LARC)治療領域，CTCs計數(shù)及參與免疫反應的調節(jié)性T細胞(Regulatory T cells，Treg)可以評估預測新輔助治療的腫瘤客觀反應情況。研究認為如果CTCs檢測陽性則應建議患者接受更強的新輔助治療方案(如誘導化療)[28]。另外，直腸癌患者外周血中Treg含量明顯高于健康人群，而新輔助放療后存在不同程度的下降，并且與放療劑量相關。初步數(shù)據(jù)顯示，新輔助治療5天后，Treg含量高的LARC患者腫瘤分期較好(

轉移性結直腸癌患者需要檢測RAS基因，來決定后續(xù)的治療方案，而以往的研究出現(xiàn)血液中與組織中檢測基因突變情況存在不一致性，即組織檢測為KRAS野生型而外周血中檢測為突變型。體內和體外試驗的ctDNA分析表明，阻斷EGFR通路，KRAS和NRAS突變將快速出現(xiàn)，通常在影像學證實腫瘤復發(fā)之前，就能夠檢測到突變的發(fā)生。而觀察應用西妥昔單抗或帕尼單抗治療轉移性結直腸癌患者ctDNA發(fā)現(xiàn)，阻斷EGFR通路，將導致KRAS突變克隆的產(chǎn)生，而停藥后克隆逐漸減少，一段時間后，腫瘤細胞能夠再次恢復藥物敏感性，這表明克隆進化持續(xù)存在，而ctDNA能夠動態(tài)監(jiān)測KRAS突變水平，為重新應用抗EGFR類藥物提供依據(jù)[1]。另外，KRAS野生型及突變型的細胞系外泌體miRNA表達譜不同，miR-10b在野生型中選擇性上調，而miR-100在突變型中上調，這也提示外泌體miRNA作用于受體細胞，未來可能會成為預測KRAS突變的新模式，指導患者的治療方向[30]。

3 小結與展望

隨著精準醫(yī)療時代的來臨，液體活檢作為近年來新興起的分子診斷技術，在臨床診療工作中發(fā)揮著越來越重要的作用，為臨床實踐帶來機遇。它的優(yōu)勢在于可以動態(tài)監(jiān)測克隆進化、腫瘤負荷、指導靶向治療，在腫瘤個體化治療方面具有實用性。但是，目前液體活檢處于研究階段，仍然面臨很多挑戰(zhàn)，尚需要規(guī)范化技術及大規(guī)模前瞻性臨床試驗來證明。相信在不遠的未來，液體活檢可以更加精確全面的提供腫瘤基因組學信息，為患者帶來希望的曙光。