沈震亞（江中藥業(yè)股份有限公司 南昌330046）

升脾顆粒收載于《國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編》內(nèi)科脾胃分冊(cè)，處方由黃芪、黨參、枳殼、白術(shù)和升麻組成，功能升陽益氣。用于氣虛下陷、勞傷虛損引起的胃下垂、子宮下垂、脫肛等癥。枳殼為方中主藥，主要含黃酮類、揮發(fā)油、生物堿、香豆素及三萜皂苷類等成分[1]，具理氣寬中、行滯消脹的功效，用于胸脅氣滯、食積不化、臟器下垂等[2]，原收載標(biāo)準(zhǔn)中僅對(duì)其主要特征成分之一柚皮苷進(jìn)行了含量測(cè)定，2015版《中國(guó)藥典》中規(guī)定了枳殼藥材中柚皮苷和新橙皮苷的含量測(cè)定方法及限度。因此，為了提高本產(chǎn)品的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，我們對(duì)升脾顆粒中柚皮苷和新橙皮苷的含量測(cè)定進(jìn)行了方法學(xué)研究，建立了升脾顆粒中柚皮苷和新橙皮苷的含量測(cè)定方法?，F(xiàn)報(bào)告如下：

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津LC-20AD高效液相色譜儀（LC-solution工作站，LC-20AD二元泵，SPD-20A紫外檢測(cè)器），CQ-250超聲波清洗器（上海船舶電子設(shè)備研究所），Simplicity TM型超純水系統(tǒng)（Millipore中國(guó)有限公司），AG-135電子天平（梅特勒-托利多上海有限公司）。

1.2 材料 柚皮苷對(duì)照品（含量測(cè)定用，批號(hào)：110722-201613，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；新橙皮苷對(duì)照品（含量測(cè)定用，批號(hào)：111857-201102，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；升脾顆粒（批號(hào)：161201、161202、161203、170101、170102、170103，自制）；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Dikma Diamonsil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈－0.1%磷酸（22∶78）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：283 nm，柱溫：30℃。

2.2 對(duì)照品溶液制備 取柚皮苷和新橙皮苷對(duì)照品各約10 mg，精密稱定，加甲醇使之溶解并稀釋成每1 ml含柚皮苷30.06 μg和新橙皮苷32.07 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備 取本品研細(xì)，取0.30 g，精密稱定，置25 ml容量瓶中，加甲醇至近刻度，超聲處理30 min，放冷，補(bǔ)足甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液用微孔濾膜（孔徑0.45 μm）濾過，即得。

2.4 陰性對(duì)照溶液制備 取未加枳殼的其余藥材按供試品制法制成陰性對(duì)照樣品，取0.30 g，精密稱定，按2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，即得。

2.5 陰性對(duì)照試驗(yàn) 在2.1的色譜條件下，柚皮苷和新橙皮苷與其他色譜峰的分離效果均較好，且與陰性對(duì)照溶液進(jìn)樣后無干擾，說明處方中其余各味藥對(duì)這兩種成分的檢測(cè)無干擾。見圖1。

圖1 對(duì)照品溶液-供試品溶液-陰性對(duì)照溶液色譜圖

2.6 線性范圍 取柚皮苷和新橙皮苷對(duì)照品各約10 mg，精密稱定，加甲醇使之溶解并稀釋成每1 ml含柚皮苷0.300 6 mg和新橙皮苷0.320 7 mg的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，將儲(chǔ)備液加甲醇分別稀釋至2、2.5、5、10、12.5、25 倍量體積的不同濃度的混合對(duì)照品溶液。分別吸取各濃度的混合對(duì)照品溶液各10 μl，注入液相色譜儀中。以對(duì)照品濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（mAU）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，得回歸方程。柚皮苷：Y=1 849.799 65X+1 905.716 2，r=0.999 9；新橙皮苷：Y=2381.575214X＋715.34234，r=0.999 9，表明柚皮苷在濃度 12.024～150.3 μg/ml、新橙皮苷在濃度12.828～160.35 μg/ml范圍內(nèi)，其進(jìn)樣濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。見圖2。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取每1 ml含柚皮苷30.06 μg和新橙皮苷32.07 μg的混合對(duì)照品溶液10 μl，按2.1所述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果顯示柚皮苷和新橙皮苷峰面積值的RSD分別為1.31%和1.12%（n=6）。表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10 μl，于 0、1、2、4、6、8、12 h 分別進(jìn)樣 1 次，測(cè)定峰面積。結(jié)果顯示，供試品中柚皮苷和新橙皮苷的峰面積RSD分別為1.48%和1.29%。表明在12 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)制劑6份，照2.3項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制成供試品溶液，測(cè)定并計(jì)算含量。結(jié)果顯示，柚皮苷和新橙皮苷的含量RSD分別為0.96%和1.95%（n=6）。

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的本品適量，研細(xì)，取約0.15 g，共6份，精密稱定，分別置于25 ml的容量瓶中，分別精密加入每1 ml含0.100 2 mg柚皮苷和0.106 9 mg新橙皮苷的混合對(duì)照品溶液3 ml，加甲醇至近刻度，按2.3項(xiàng)的方法制備成加樣回收樣品溶液。進(jìn)樣10 μl進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算回收率，柚皮苷與新橙皮苷的平均回收率分別為100.90%和101.10%，RSD分別為1.63%和1.89%。見表1。

表1 回收率測(cè)定結(jié)果

2.11 樣品含量測(cè)定 取批號(hào)為161201、161202、161203、170101、170102、170103 的升脾顆粒，按 2.3項(xiàng)所述方法制備成供試品溶液。分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀中，測(cè)定。見表2。

表2 6批制劑中柚皮苷和新橙皮苷含量結(jié)果（mg/袋）

3 討論

根據(jù)《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》辨證分型，“內(nèi)臟下垂”屬中氣下陷[3]。中醫(yī)認(rèn)為脾氣有開發(fā)之性，若脾虛升舉無力，會(huì)引起中氣下陷，故臨床對(duì)氣虛下陷所致的內(nèi)臟下垂往往從脾論治[4]。枳殼功能理氣寬中、行滯消脹，是臨床調(diào)理脾胃的常用中藥?，F(xiàn)代藥理研究表明，枳殼對(duì)不同機(jī)體狀態(tài)下的胃腸平滑肌肌張力有雙向調(diào)節(jié)作用，楊武亮等[5]通過對(duì)枳殼提取物的活性跟蹤發(fā)現(xiàn)，其不同劑量的氯仿提取部位對(duì)正常小鼠的胃腸運(yùn)動(dòng)分別起到促進(jìn)和抑制作用，并且經(jīng)臨床證實(shí)枳殼煎劑對(duì)因胃平滑肌松弛、張力下降所致的胃下垂患者具有良好的治療效果[6]。枳殼主要含黃酮類、揮發(fā)油、生物堿、香豆素及三萜皂苷類等成分，二氫黃酮、黃酮和多甲氧基黃酮等黃酮類成分為其特征成分，包括柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、川陳皮素和紅菊素等，其中以二氫黃酮類的柚皮苷和新橙皮苷含量最高[5～7]。本制劑主要功效為升陽舉陷，因此選取對(duì)臟器下垂有治療作用的枳殼中的柚皮苷和新橙皮苷進(jìn)行含量測(cè)定合理有效。

預(yù)試驗(yàn)方法研究中，參考2015版《中國(guó)藥典》中枳殼藥材的含量測(cè)定方法[2]，選取甲醇作為提取溶劑，先后比較了回流與超聲處理不同提取方法對(duì)樣品檢出的影響，發(fā)現(xiàn)不同的提取方法對(duì)該兩種成分的提取效果無明顯差異；同時(shí)分別對(duì)超聲提取用15 ml、25 ml和 50 ml甲醇和超聲提取 20 min、30 min、45 min和60 min的效果進(jìn)行了考察，最終確定以甲醇25 ml超聲提取30 min的提取效果佳，且操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)可行。結(jié)合以上方法學(xué)考察的結(jié)果，最終建立了升脾顆粒中柚皮苷和新橙皮苷的含量測(cè)定方法。

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