高琳琳，王 軍，李子英，劉曉梅*

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110004；2.本溪市中心醫(yī)院，遼寧 本溪 117022)

宮內(nèi)發(fā)育遲緩(intrauterine growth retardation，IUGR)兒又稱小于胎齡(small for gestational age，SGA)兒，是指出生體重低于同胎齡平均體重的第十個(gè)百分位或低于同胎齡平均體重的2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的新生兒[1]。我國(guó)人群中IUGR的發(fā)生率平均為6.39%，IUGR不僅是圍產(chǎn)兒的死亡和發(fā)病的重要原因之一，而且還會(huì)增加成年后心血管疾病、糖尿病、高血壓等疾病的發(fā)生[2]。目前，IUGR動(dòng)物模型有較多建立方法，包括酒精干預(yù)(alcohol intervention)法、子宮動(dòng)脈結(jié)扎(uterine artery ligation)法、低蛋白飲食(low protein diet)法等；盡管制備模型的方法多樣，但是沒有公認(rèn)建立IUGR模型的唯一標(biāo)準(zhǔn)[3]。

因此，穩(wěn)定而簡(jiǎn)便地建立與人類臨床病理特征相似的IUGR模型，對(duì)研究該疾病的發(fā)生機(jī)制、疾病的治療方法具有十分重要的科學(xué)意義。本文著重介紹三種IUGR模型的造模方法比較及新生大鼠生長(zhǎng)變化，進(jìn)而探討建立IUGR模型最適合的方法及對(duì)大鼠遠(yuǎn)期代謝的影響，為相關(guān)科學(xué)研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar大鼠33只，25只雌性，體重230～250 g，8只雄性，體重280～300 g，來(lái)源于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司 [SCXK (遼) 2015-0001]。動(dòng)物飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)操作于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 [SYXK (遼) 2017-0004]，隨機(jī)將雌雄比例為4∶1合籠過夜，次日做陰道涂片，在顯微鏡下檢出精子則定為受孕第0天[4]，每組為5只孕鼠，隨機(jī)分為A、U、LP、CON四組，即酒精干預(yù)組、子宮動(dòng)脈結(jié)扎組、低蛋白飲食組、正常對(duì)照(normal control)組。本實(shí)驗(yàn)符合倫理要求，倫理編號(hào)：2015PS41K。

1.2 主要試劑與儀器

95%乙醇，由盤錦天源藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：遼衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1996)第004754號(hào)，生產(chǎn)批號(hào)：20160302；0.9%氯化鈉注射液，由大連大冢制藥有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H12020010，生產(chǎn)批號(hào)：16101138；水合氯醛，由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供，生產(chǎn)批號(hào)：20160705。T系列電子天平，由美國(guó)雙杰兄弟(集團(tuán))有限公司生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 各組IUGR模型制備

酒精干預(yù)組：正常飲食飲水(熱卡約為1558 kJ/100 g、蛋白質(zhì)約為23%)，飼料由北京華阜康提供 [SCXK (京) 2014-008]，于孕第7天開始，給予孕鼠自配50%的酒精進(jìn)行灌胃處理 [0.9 mL/(100 g·d)][5]。

子宮動(dòng)脈結(jié)扎組：正常飲食飲水于孕第17天以水合氯醛0.3 mL/kg的劑量進(jìn)行麻醉，從腹中線的位置縱切，切口約為3～4 cm，暴露子宮，用溫的生理鹽水浸潤(rùn)紗布鋪在子宮表面來(lái)維持子宮的溫度及濕度，尋找子宮角動(dòng)脈，結(jié)扎處平行放置一號(hào)鋼針，同時(shí)結(jié)扎子宮動(dòng)脈和鋼針，后將鋼針輕輕抽出，結(jié)扎單側(cè)子宮動(dòng)脈后關(guān)閉腹腔并用酒精進(jìn)行消毒[6]。

低蛋白飲食組：于孕第0天給予低蛋白飲食(熱卡約為1558 kJ/100 g、蛋白質(zhì)約為8%)，飼料由北京華阜康提供 [SCXK (京) 2014-008]，每天給予低蛋白飼料[7]，正常飲水。

正常對(duì)照組：于孕第0天給予正常飲食飲水。

1.3.2 取材

孕第20天時(shí)剖宮產(chǎn)取胎鼠，隨機(jī)選取5組樣本進(jìn)行考察，并測(cè)量其身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)、體質(zhì)量、腦質(zhì)量、胎盤質(zhì)量、雙腎質(zhì)量、肝質(zhì)量、肺質(zhì)量；剩余部分胎鼠繼續(xù)飼養(yǎng)分別于飼養(yǎng)后3周、6周、12周隨機(jī)選取5只實(shí)驗(yàn)鼠，分別對(duì)其肝臟、雙腎及腎周脂肪質(zhì)量進(jìn)行測(cè)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)組胎鼠成活率及IUGR發(fā)生率的比較

子宮動(dòng)脈結(jié)扎組1只孕鼠死亡，其他實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組均無(wú)死亡。三組實(shí)驗(yàn)組胎鼠IUGR發(fā)生率明顯高于對(duì)照組(P< 0.05)，實(shí)驗(yàn)組胎鼠成活率明顯低于對(duì)照組(P< 0.05)，其中子宮動(dòng)脈結(jié)扎組中胎鼠成活率低于其他兩組。各組的孕鼠成活數(shù)、活胎數(shù)、死胎數(shù)、吸收胎、IUGR發(fā)生率等詳見表1。

2.2 實(shí)驗(yàn)組胎鼠體質(zhì)量、體長(zhǎng)及臟器質(zhì)量的變化

三組實(shí)驗(yàn)組胎鼠平均體質(zhì)量分別為3.741 g、3.704 g、3.525 g，明顯低于對(duì)照組胎鼠平均體質(zhì)量5.017 g(P< 0.05)，除腦質(zhì)量外，實(shí)驗(yàn)組臟器質(zhì)量均明顯低于對(duì)照組臟器的平均質(zhì)量；其中，子宮動(dòng)脈結(jié)扎組與低蛋白飲食組肝臟的質(zhì)量低于對(duì)照組肝臟的質(zhì)量，但差異無(wú)顯著性(P> 0.05)。各組胎鼠平均體質(zhì)量、體長(zhǎng)及臟器質(zhì)量詳見表2，圖1、2。

2.3 實(shí)驗(yàn)組胎盤比重、胎鼠肝等臟器比重的變化

三組實(shí)驗(yàn)組的胎盤比重(胎盤質(zhì)量與胎鼠體質(zhì)量比)均低于對(duì)照組(P< 0.05)，且酒精干預(yù)組低于低蛋白飲食組的胎盤比重；酒精干預(yù)組肝臟比重明顯低于對(duì)照組肝臟比重(P< 0.05)，子宮動(dòng)脈結(jié)扎組和低蛋白飲食組肝臟比重低于對(duì)照組肝臟比重，但差異無(wú)顯著性(P> 0.05)。各組胎鼠臟器比重詳見表3、圖3。

表1 各組孕鼠剖其胎鼠的情況

注：與對(duì)照組比較，*P< 0.05。

Note. Compared with the CON group,*P< 0.05.

注：A：各組剖宮產(chǎn)胎鼠生長(zhǎng)情況；B：各組剖宮產(chǎn)胎鼠的體質(zhì)量。A：酒精干預(yù)組；U：子宮動(dòng)脈結(jié)扎組；LP：低蛋白飲食組；CON：正常對(duì)照組。與正常對(duì)照組比較，* P< 0.05。圖1 各組剖宮產(chǎn)胎鼠生長(zhǎng)及體質(zhì)量情況Note. A: Growth of fetal rats delivered by cesarean section. B: Body mass of fetal rats delivered by cesarean section. A: Alcohol intervention group; U: Uterine artery ligation group; LP: Low protein diet group; CON: Normal control group. Compared with the CON group,*P< 0.05.Fig.1 Growth status and body mass of the fetal rats delivered by cesarean section in each group

組別Groups身長(zhǎng)(cm)Bodylength尾長(zhǎng)(cm)Taillength體質(zhì)量(g)Bodymass腦質(zhì)量(g)Brainmass胎盤質(zhì)量(g)Placentalmass雙腎質(zhì)量(g)Two?kidneymass肝質(zhì)量(g)Livermass肺質(zhì)量(g)LungmassA3119±02201118±01333741±0387?0142±00180339±00550035±0011?0285±0068?0134±0019U3123±01831108±01383704±0441?0148±00270345±00440036±0013?0312±00390129±0024LP3469±07931123±02743525±0290?0145±00070385±00320027±0007?0304±00850132±0015CON3691±01341241±01055017±01490151±00420453±00830054±00390377±00690138±0050

注：與對(duì)照組比較，*P< 0.05。

Note. Compared with the CON group,*P< 0.05.

注：A：剖宮產(chǎn)胎鼠腦質(zhì)量；B：剖宮產(chǎn)胎鼠雙腎質(zhì)量；C：剖宮產(chǎn)胎鼠肝臟質(zhì)量。A：酒精干預(yù)組；U：子宮動(dòng)脈結(jié)扎組；LP：低蛋白飲食組；CON：正常對(duì)照組。與正常對(duì)照組比較，* P< 0.05。圖2 各組剖宮產(chǎn)胎鼠的腦、雙腎、肝臟質(zhì)量Note. A: Brain mass. B: Two-kidney mass. C: Liver mass. A: Alcohol intervention group; U: Uterine artery ligation group; LP: Low protein diet group; CON: Normal control group. Compared with the CON group,* P< 0.05.Fig.2 Brain mass, two-kidney mass and liver mass of the fetal rats delivered by cesarean section in each group

組別Groups腦比重Braincoefficient胎盤比重Placentacoefficient雙腎比重Two?kidneycoefficient肺比重Lungcoefficient肝比重LivercoefficientA0041±00070075±0017?0007±00040038±00040081±0020?U0040±00070050±0015?0007±00030035±00060087±0010LP0041±00040076±0020?0009±00010036±00630085±0016CON0045±00080090±00170011±00080048±00100095±0014

注：與對(duì)照組比較，*P< 0.05。

Note. Compared with the CON group,*P< 0.05.

注：A：剖宮產(chǎn)胎鼠的腦比重；B：剖宮產(chǎn)胎鼠的胎盤比重；C：剖宮產(chǎn)胎鼠的肝比重。A：酒精干預(yù)組；U：子宮動(dòng)脈結(jié)扎組；LP：低蛋白飲食組；CON：正常對(duì)照組。與正常對(duì)照組比較，* P< 0.05。圖3 各組剖宮產(chǎn)胎鼠的腦、胎盤、肝臟比重Note. A: Brain coefficient. B: Placenta coefficient. C: Liver coefficient. A: Alcohol intervention group; U: Uterine artery ligation group; LP: Low protein diet group; CON: Normal control group. Compared with the CON group, *P< 0.05.Fig.3 Brain, placenta and liver coefficients of the fetal rats delivered by cesarean section in each group

2.4 實(shí)驗(yàn)組體質(zhì)量的變化

大鼠飼養(yǎng)3周后，酒精干預(yù)組、子宮動(dòng)脈結(jié)扎組、低蛋白飲食組三組大鼠平均體質(zhì)量均明顯低于對(duì)照組(P< 0.05)；飼養(yǎng)6周后，實(shí)驗(yàn)組大鼠平均體質(zhì)量仍低于對(duì)照組的水平，差異無(wú)顯著性(P> 0.05)；飼養(yǎng)12周后，酒精干預(yù)組、低蛋白飲食組兩組實(shí)驗(yàn)組大鼠平均體質(zhì)量明顯高于對(duì)照組(P< 0.05)。各組大鼠平均體質(zhì)量增長(zhǎng)情況詳見圖4。

2.5 12周部分臟器及腎周脂肪質(zhì)量的比較

三組實(shí)驗(yàn)組測(cè)量12周肝臟、雙腎及腎周脂肪的質(zhì)量，其中，三組實(shí)驗(yàn)組的肝臟、雙腎臟質(zhì)量均低于對(duì)照組，酒精干預(yù)組、低蛋白飲食組腎周脂肪質(zhì)量明顯高于對(duì)照組(P< 0.05)，子宮動(dòng)脈結(jié)扎組腎周脂肪質(zhì)量高于對(duì)照組，但差異無(wú)顯著性(P> 0.05)。各組肝臟、雙腎、腎周脂肪質(zhì)量詳見圖5。

注：與正常對(duì)照組比較，* P< 0.05。圖4 各組大鼠體質(zhì)量變化Note. Compared with the CON group,* P< 0.05.Fig.4 Changes of body mass of the rats in each group

注：A：12周各組肝臟質(zhì)量；B：12周各組雙腎質(zhì)量；C：各組腎周脂肪質(zhì)量。A：酒精干預(yù)組；U：子宮動(dòng)脈結(jié)扎組；LP：低蛋白飲食組；CON：正常對(duì)照組。與正常對(duì)照組比較，* P< 0.05。圖5 12周時(shí)各組大鼠肝臟、雙腎、腎周脂肪質(zhì)量情況Note. A: Liver mass. B: Two-kidney mass. C: Perirenal fat pad mass. A: Alcohol intervention group; U: Uterine artery ligation group; LP: Low protein diet group; CON: Normal control group. Compared with the CON group,* P< 0.05.Fig.5 Liver, two-kidney and perirenal fat pad mass of the rats in each group at age of 12 weeks

3 討論

宮內(nèi)發(fā)育遲緩胎兒在子宮內(nèi)會(huì)出現(xiàn)器官發(fā)育不良、窒息缺氧、宮內(nèi)流產(chǎn)等現(xiàn)象，是造成圍產(chǎn)兒死亡的重要原因之一。其遠(yuǎn)期影響是宮內(nèi)發(fā)育遲緩兒在成年后發(fā)生代謝綜合征(包括糖耐量減低、2型糖尿病)的易感性明顯增加，與成年后的心血管病、肥胖、高血壓等疾病的發(fā)生密切相關(guān)[8]。作為圍產(chǎn)科學(xué)研究的熱點(diǎn)問題，宮內(nèi)發(fā)育遲緩發(fā)生的分子機(jī)制尚未闡明，目前認(rèn)為可能與宮內(nèi)不良發(fā)育造成的持續(xù)終生的胰島素抵抗有關(guān)[9]。研究宮內(nèi)發(fā)育遲緩的近遠(yuǎn)期并發(fā)癥，必須建立穩(wěn)定的研究模型。然而受倫理影響，人體實(shí)驗(yàn)無(wú)法實(shí)現(xiàn)，因此動(dòng)物宮內(nèi)發(fā)育遲緩模型具有無(wú)可替代的模擬價(jià)值。

酒精干預(yù)法能成功地建造大鼠宮內(nèi)發(fā)育遲緩模型，本法最大的優(yōu)點(diǎn)是能精準(zhǔn)地掌握酒精用量及孕鼠的給予劑量(mL)，缺點(diǎn)是酒精干預(yù)法的給予途徑是灌胃，易刺激胃腸，易影響胎鼠的正常發(fā)育[10]。在此研究中，酒精干預(yù)法對(duì)胎鼠的肝臟發(fā)育影響最為明顯[11]，因此，酒精干預(yù)法在探討制備IUGR模型對(duì)長(zhǎng)期肝臟代謝變化中的影響值得進(jìn)一步研究。

子宮動(dòng)脈結(jié)扎法通過實(shí)驗(yàn)操作來(lái)減少胎鼠的血液供應(yīng)，并以此影響胎鼠正常發(fā)育，此實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)易，但實(shí)驗(yàn)操作難度較高；結(jié)扎過緊會(huì)導(dǎo)致瞬間的血液供應(yīng)中斷，常引起胎鼠死于宮內(nèi)而致流產(chǎn)率、死亡率上升。結(jié)扎過松則導(dǎo)致宮內(nèi)發(fā)育遲緩模型的發(fā)生率下降[12]。在本文的三種模型制備方法中，子宮動(dòng)脈結(jié)扎法存活胎鼠數(shù)最少，死亡率最高，IUGR發(fā)生率最低，這可能與手術(shù)中的麻醉和外科手術(shù)造成的失血有一定的關(guān)系。在此研究中，子宮動(dòng)脈結(jié)扎法制備宮內(nèi)發(fā)育遲緩模型對(duì)胎鼠腦部的影響較小，與正常對(duì)照組最為接近[13]，該造模方法對(duì)研究腦部的影響不具有說(shuō)服力，同時(shí)該造模方法在制備大鼠宮內(nèi)發(fā)育遲緩模型時(shí)，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員專業(yè)的外科技術(shù)要求較為嚴(yán)格，不具有普及性與推廣性；而且，該實(shí)驗(yàn)組的體質(zhì)量始終低于對(duì)照組，沒有明顯的生長(zhǎng)追趕，12周腎周脂肪質(zhì)量無(wú)明顯增加[14]。因此，對(duì)于追趕性生長(zhǎng)的相關(guān)研究也不適宜采取此類造模方法。

低蛋白飲食法是通過減少母鼠飲食中的蛋白質(zhì)含量來(lái)減少供給胎鼠的蛋白質(zhì)，從而限制了胎鼠的發(fā)育[15]。此方法對(duì)實(shí)驗(yàn)飼料配制、飼料中營(yíng)養(yǎng)水平的控制、飼料飼喂時(shí)間的控制等要求嚴(yán)格。本實(shí)驗(yàn)采用北京華阜康公司的低蛋白飼料，成功構(gòu)建了IUGR大鼠模型，此方法制備大鼠宮內(nèi)發(fā)育遲緩模型成功率高，死亡率低，孕鼠接近自然狀態(tài)，無(wú)刺激、無(wú)創(chuàng)傷，而且效果穩(wěn)定，相比于其他方法具有不可替代的優(yōu)勢(shì)，12周時(shí)出現(xiàn)了明顯的追趕性生長(zhǎng)，腎周脂肪質(zhì)量增長(zhǎng)明顯，對(duì)脂肪沉積及肥胖發(fā)生相關(guān)研究起著重要的作用。

通過上面三種建立IUGR的實(shí)驗(yàn)方法可知，酒精干預(yù)法、子宮動(dòng)脈結(jié)扎法、低蛋白飲食法均可成功建立IUGR的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型；本實(shí)驗(yàn)三種模型建立方法，對(duì)腦質(zhì)量的影響很小，說(shuō)明大鼠本身具有腦保護(hù)效應(yīng)[16]；在本實(shí)驗(yàn)所涉及的實(shí)驗(yàn)方法中，子宮動(dòng)脈結(jié)扎法IUGR發(fā)生率低，死亡率高，不是建立IUGR模型的首選，酒精干預(yù)法和低蛋白飲食法均可很好地建立IUGR模型，而且低蛋白飲食法較酒精干預(yù)法IUGR發(fā)生率高，死亡率更低，因此，低蛋白飲食法可作為建立IUGR模型的首選之一。本研究目前只是初步研究了各組模型中胎鼠的死亡率，胎鼠出生后的體質(zhì)量、臟器質(zhì)量，胎鼠到成年鼠的體重變化，并未深入研究追趕性生長(zhǎng)這個(gè)危險(xiǎn)因素，因此IUGR的遠(yuǎn)期代謝影響值得進(jìn)一步研究。

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