管俊嬌 楊曉洪 張建華 王江民 張鵬 李彥剛

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，昆明 650205）

我國水稻種植以秈稻為主，粳稻種植面積較?。?］。但隨著生活水平的提高，市場對(duì)粳米的需求量日益增長，需要培育出更多優(yōu)秀品種來滿足需求［2-3］。把優(yōu)異遺傳資源應(yīng)用到育種中，保持粳稻品種的多樣性是培育優(yōu)秀新品種的關(guān)鍵［4］。張立娜等［5］研究表明云南的粳稻地方品種遺傳多樣性最為豐富，也育成了大量的粳稻系列品種，其中具有優(yōu)異特性的品種、品系等作為親本材料常用于育種中。因此，通過對(duì)各單位創(chuàng)新的粳稻選育品種的遺傳多樣性研究，闡明云南不同來源粳稻品種的親緣關(guān)系和遺傳結(jié)構(gòu)，了解粳稻品種的生態(tài)類型及地理分布，能有效的指導(dǎo)粳稻雜交育種中親本材料選配，加強(qiáng)育種家間資源共享和種質(zhì)資源交流，拓寬育種的遺傳基礎(chǔ)，推動(dòng)云南粳稻育種發(fā)展。

分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于作物種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究。其中應(yīng)用最多的是簡單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR）標(biāo)記，其具有重復(fù)性好、多態(tài)性高、數(shù)量豐富、呈共顯性且廣泛分布于基因組等優(yōu)點(diǎn)［6-7］。本研究精選云南粳稻品種163份，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)研究其遺傳多樣性，并闡明其遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系，以期為粳稻優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)育種提供科學(xué)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

選取云南省7個(gè)育種單位的163份粳稻品種、品系等作為實(shí)驗(yàn)材料（表1）。包括麗江市農(nóng)業(yè)科學(xué)院17份，楚雄州農(nóng)業(yè)科學(xué)院27份，大理州農(nóng)業(yè)科學(xué)院13份，保山市農(nóng)業(yè)科學(xué)院25份，曲靖市農(nóng)業(yè)科學(xué)院19份，云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院56份，其他親本材料的6份。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 參照農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標(biāo)記法》（NY/T 1433-2014）的方法，試驗(yàn)材料經(jīng)催芽播種于秧床上，薄膜覆蓋進(jìn)行育苗。當(dāng)幼苗長到四葉一心時(shí)，混合取20個(gè)單株的葉片，用改良的CTAB法提取DNA。

1.2.2 SSR標(biāo)記檢測 依據(jù)Temnykh 等［8］公布的水稻SSR遺傳標(biāo)記連鎖圖，經(jīng)過初篩選，在每條染色體上均勻選擇1-3對(duì)，共30對(duì)SSR熒光標(biāo)記引物用于遺傳多樣性檢測。PCR總反應(yīng)體系為10 μL，采用2×mix混合液，10 μL的反應(yīng)體積包括5 mL 2×mix混合液、0.3 mL 10 mmol/L正向引物、0.3 mL 10 mmol/L反向引物，1 mL樣品DNA，3.4 mL超純水。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30次；72℃下延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物在毛細(xì)管熒光電泳系統(tǒng)AB 3730XL DNA 分析儀上檢測。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析 用 Powermarker Version3.25［9］軟件計(jì)算群體的等位基因數(shù)、基因多樣性指數(shù)和多態(tài)信息含量（PIC），并按非加權(quán)配對(duì)法（UPGMA）采用Nei’s遺傳距離進(jìn)行聚類。用MEGA Version 3.1［10］軟件對(duì)生成的聚類圖進(jìn)行編輯修飾。用STRUCTURE Version2.2 軟件完成參試材料的遺傳結(jié)構(gòu)分析［5］。參照Evanno 等［11］的K 值變化下△K的折線圖模型（△ K=m（|L（K+1）-2L（k）+L（K-1）|）/s［L（k）］，其中 m 代表 K 值的平均值，s 表示 K 值的標(biāo)準(zhǔn)差），K 值預(yù)設(shè)為1-10，估計(jì)最佳群體組群數(shù)K，每個(gè)K值都獨(dú)立運(yùn)算10次。

2 結(jié)果

2.1 SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

用30對(duì)SSR 引物，對(duì)163 份粳稻品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，其結(jié)果見表2。30個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)共檢測到等位基因207個(gè)，每個(gè)位點(diǎn)等位基因變幅為2-17，平均等位基因數(shù)為6.6?；蚨鄻有灾笖?shù)變異范圍為0.024 4-0.823 9，平均為0.479 8；多態(tài)信息含量（PIC）的變異范圍為0.024 1-0.802 5，平均為0.440 7。其中，RM297、RM336、RM1306、RM72、RM551的等位基因數(shù)較多，依次為17、14、13、12、10。等位基因數(shù)最少的為RM274，有2個(gè)等位基因。基因多樣性指數(shù)較高的引物依次為RM336、RM8277、RM297、RM72、RM219、RM551、RM1306、RM254、RM1，分別是 0.823 9、0.804 1、0.759 3、0.748 3、0.739 4、0.726 1、0.710 7、0.704 8和0.702 0。結(jié)果表明，不同的粳稻品種存在著豐富的SSR多態(tài)性，SSR標(biāo)記適合應(yīng)用于粳稻選育品種的遺傳多樣性分析及品種鑒定。

2.2 不同育種單位的粳稻選育品種遺傳多樣性分析

7個(gè)育種單位選育粳稻品種的遺傳多樣性參數(shù)

分析結(jié)果見表3。7個(gè)育種單位粳稻品種的等位基因數(shù)變異在3.1-4.5，基因多樣性指數(shù)變異范圍為0.392-0.466，其他分類中的基因多樣性水平最高。PIC 變異范圍為0.347-0.417，其他分類中的PIC值最大，為0.417。等位變異數(shù)最多的是云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育的品種，但遺傳多樣性并不與群體大小完全正相關(guān)，群體最小的其他分類中的基因多樣性指數(shù)和PIC均表現(xiàn)為最高。此外，保山市農(nóng)科院和麗江市農(nóng)科院的基因多樣性指數(shù)和PIC稍高于其他單位。

表1 粳稻品種及其來源

續(xù)表

2.3 粳稻品種基于Nei s遺傳距離的系統(tǒng)聚類分析

來自不同育種單位的163份粳稻品種系統(tǒng)聚類分析結(jié)果見圖1。利用30對(duì)SSR標(biāo)記將163份粳稻材料分為4大類群。第I類群為來自國際水稻所的一個(gè)粳稻親本TRAT104，第 II、Ⅲ類群主要包括了麗江市農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育的9個(gè)品種，云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院的4個(gè)及兩個(gè)親本。第Ⅳ大類群包含了其他單位選育的品種，其中又分為不同的小類群。從每個(gè)小類群品種的組成可見相同單位的材料雖然并未完全聚類于同一小類群，而是分散于不同小類群中，但大部分品種遺傳相似度較高。表明不同育種單位間的育種材料有交叉但交叉不多。

表2 云南粳稻品種SSR標(biāo)記遺傳多樣性參數(shù)

2.4 粳稻品種的遺傳結(jié)構(gòu)分析

采用基于數(shù)學(xué)模型的聚類方法分析了163份粳稻品種的群體遺傳結(jié)構(gòu)。圖2 顯示K值變化下△K值的折線圖。當(dāng)K=2時(shí)出現(xiàn)拐點(diǎn)，圖3顯示K=2 時(shí)參試材料類群的遺傳結(jié)構(gòu)和群體組成。圖中所示縱坐標(biāo)數(shù)值表示每份材料劃分到相應(yīng)類群的幾率，橫坐標(biāo)表示個(gè)體所在群體，163個(gè)品種劃分為兩個(gè)類群。某材料屬于某類群的概率＞0.6，被歸入此類群，各亞群材料來源列于表3。在163份材料中，有70份材料被分到紅色部分表示的第1 亞群，其余93份被分到綠色部分表示的第2 亞群。

表3 七個(gè)育種單位或地區(qū)的粳稻品種遺傳多樣性參數(shù)

表4中來自大理州農(nóng)業(yè)科學(xué)院和保山市農(nóng)業(yè)科學(xué)院的品種全部分在第1亞群中，楚雄州農(nóng)業(yè)科學(xué)院和云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院的品種主要集中在第2亞群中。麗江市農(nóng)業(yè)科學(xué)院、曲靖市農(nóng)業(yè)科學(xué)院的品種平均分布在兩個(gè)亞群中。大理州農(nóng)業(yè)科學(xué)院、保山市農(nóng)業(yè)科學(xué)院與其他院所的資源遺傳差異較大，它們之間的雜交有利于拓寬后代材料的遺傳基礎(chǔ)。

3 討論

3.1 SSR標(biāo)記遺傳多樣性

趙慶勇［12］、束愛萍［4］、楊文毅［13］、張立娜［5］等分別對(duì)粳稻育成品種和地方品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析，篩選出了相應(yīng)的適合用于粳稻品種遺傳多樣性檢測的標(biāo)記。本研究中，通過等位基因數(shù)與基因多樣性指數(shù)和PIC值的比較，一個(gè)引物上的等位基因數(shù)與基因多樣性指數(shù)和多態(tài)性信息值不成直接的線性關(guān)系。在遺傳多樣性分析及品種鑒別中，引物的選擇需要綜合考慮等位基因的數(shù)量及多態(tài)性信息值，還要考慮位點(diǎn)與農(nóng)藝性狀的連鎖情況，保證所用的分子標(biāo)記可以有效的評(píng)價(jià)種質(zhì)資源。

圖1 粳稻品種基于Nei’s遺傳距離的系統(tǒng)聚類圖

圖2 每個(gè)K值所對(duì)應(yīng)的△K

圖3 163個(gè)粳稻品種的群體結(jié)構(gòu)

3.2 云南省粳稻品種的遺傳多樣性

云南特殊的區(qū)域條件和眾多少數(shù)民族聚居，豐富的生態(tài)地理和人文習(xí)慣及多樣栽培等環(huán)境孕育了云南粳稻地方品種的遺傳多樣性［14］。張麗娜等［5］對(duì)云南省粳稻地方品種的分析表明，等位基因數(shù)、基因多樣性指數(shù)、多態(tài)信息指數(shù)分別為4.9、0.622、0.569。在本研究中，育成粳稻品種的等位基因數(shù)、基因多樣性指數(shù)、多態(tài)信息指數(shù)分別為3.7、0.434、0.392，均低于地方品種?？梢姡壳坝傻木酒贩N在選育過程中丟失了一部分等位基因，云南豐富的種質(zhì)資源還未充分開發(fā)利用。

表4 亞群組成及材料來源

結(jié)合云南省水稻種植區(qū)劃，分為5個(gè)稻作區(qū)，分別為滇中一季粳稻、秈稻區(qū)，滇南單、雙季秈稻區(qū)，南部邊緣水、陸稻區(qū)，滇東北高原粳稻區(qū)，滇西北高寒粳稻區(qū)。根據(jù)楊忠義等［14］的研究，云南粳稻資源在全省各地均有分布，但以滇西南和滇南地區(qū)較為豐富多樣，從氣候類型上看多樣性中心主要集中在亞熱帶地區(qū)。但是近年來云南粳稻品種的選育和推廣種植主要分布在滇中一季粳稻、秈稻區(qū)、滇東北高原粳稻區(qū)，滇西北高寒粳稻區(qū)，對(duì)分布于亞熱帶地區(qū)的熱帶粳等種質(zhì)資源開發(fā)利用較少，造成了粳稻選育品種遺傳多樣性遠(yuǎn)低于地方品種。今后在粳稻育種中應(yīng)重視熱帶粳等地方品種的有效利用。

3.3 不同育種單位選育品種的親緣關(guān)系

束愛萍等［4］認(rèn)為在水稻育種中被選育的基因型首先取決于親本材料的遺傳基礎(chǔ)，而親本材料往往根據(jù)當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)氣候環(huán)境條件和育種目標(biāo)而被選擇。由此可能導(dǎo)致選育品種間較高的遺傳相似性。魏興華等［15］認(rèn)為，秈粳稻品種尤其是粳稻的聚類結(jié)果顯示出較強(qiáng)的季節(jié)型和地域特性。張立娜［5］等研究表明，粳稻地方品種間的親緣關(guān)系與地域性存在一定的相關(guān)性。

本研究聚類結(jié)果顯示，相同單位的材料雖然并未完全聚類于同一小類群，而是分散于不同小類群中，但大部分品種遺傳相似度較高。說明各育種單位在品種選育時(shí)所采用的親本材料遺傳基礎(chǔ)較狹窄。育種單位之間有種質(zhì)資源的交流但交流不多。遺傳結(jié)構(gòu)分析表明，處于滇中一季粳稻、秈稻區(qū)的楚雄州農(nóng)業(yè)科學(xué)院及云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院（昆明）選育的大部分品種聚在了第2亞群中。而同樣處于滇中一季粳稻、秈稻區(qū)的來自大理州農(nóng)業(yè)科學(xué)院和保山市農(nóng)業(yè)科學(xué)院的品種全部分在第1亞群中，這可能由于這兩個(gè)育種單位所處的地區(qū)具有相同的氣候類型，較之楚雄及昆明具有更加豐富的氣候類型，以致大理州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，保山市農(nóng)業(yè)科學(xué)院的品種多樣性也較高。位于滇西北高寒粳稻區(qū)和滇東北高原粳稻區(qū)的麗江市農(nóng)業(yè)科學(xué)院、曲靖市農(nóng)業(yè)科學(xué)院的品種平均分布在兩個(gè)亞群中?？梢姡酒贩N間的親緣關(guān)系與地域性存在一定的相關(guān)性。

4 結(jié)論

各育種單位擁有的粳稻種質(zhì)資源較單一，加上在環(huán)境壓力和人為選擇導(dǎo)致同一單位選育的品種遺傳相似度較高，品種遺傳多樣性不夠豐富，云南省豐富的粳稻資源還沒有被完全挖掘利用。因而還需要在資源的高效利用、優(yōu)異資源評(píng)價(jià)、資源共享和交流等方面開展工作。不同的粳稻品種存在著豐富的SSR多態(tài)性，SSR標(biāo)記適合應(yīng)用于粳稻選育品種的遺傳多樣性分析及品種鑒定。

［1］ 黃山, 何虎, 張衛(wèi)星, 等. 不同粳稻品種在江西不同生態(tài)區(qū)的農(nóng)學(xué)表現(xiàn)［J］. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 35（1）：25-32.

［2］ 張洪程, 許軻, 張軍, 等. 雙季晚粳生產(chǎn)力及相關(guān)生態(tài)生理特征［J］. 作物學(xué)報(bào), 2014, 40：283-300.

［3］ 王遠(yuǎn)征, 王曉菁, 李源, 等. 北方粳稻產(chǎn)量與品質(zhì)性狀及其相互關(guān)系分析［J］. 作物學(xué)報(bào), 2015, 41（6）：910-918.

［4］ 束愛萍, 張媛媛, 曹桂蘭, 等. 中國不同省份粳稻選育品種的遺傳相似性［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 42（10）：3381-3387.

［5］ 張立娜, 曹桂蘭, 韓龍植. 利用SSR標(biāo)記揭示中國粳稻地方品種遺傳多樣性［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 45（3）：405-413.

［6］ 劉承晨, 趙富偉, 等. 云南哈尼梯田當(dāng)前栽培水稻遺傳多樣性及群體結(jié)構(gòu)分析［J］. 中國水稻科學(xué), 2015, 29（1）：28-34.

［7］ 涂敏, 王云月, 盧寶榮, 等. 云南省不同地理位置水稻品種遺傳多樣性分析熱［J］. 熱帶作物學(xué)報(bào), 2011, 32（6）：998-1003.

［8］ Temnykh S, DeClerck G, Lukashova A, et al. Computational and experimental analysis of microsatellites in rice（Oryza sativa L.）：frequency, length variation, transposon associations, and genetic marker potential［J］. Genome Research, 2001, 11 ：1441-1452.

［9］ Fukunaga K, Hill J, et al. Genetic diversity and population structure of teosinte［J］. Genetics, 2005, 169 ：2241-2254.

［10］ Kumar S, Tamura K, Nei M. MEGA3：Integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignmen［J］. Brief Bioinform, 2004, 5（2）：150-163.

［11］ Evanno G, Regnaut S, Goudet J. Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE：a simulation study［J］. Molecular Ecology, 2005, 14：2611-2620.

［12］ 趙慶勇, 張亞東, 朱鎮(zhèn), 等. 30個(gè)粳稻品種SSR標(biāo)記遺傳多樣性分析［J］. 植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2010, 11（2）：218-223.

［13］ 楊文毅, 等. 不同地理來源水稻品種的SSR分子標(biāo)記遺傳相似性分析［J］. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào), 2011, 27（12）：24-30.

［14］ 楊忠義, 曹永生, 蘇 艷, 等. 中國地方粳稻資源特征特性評(píng)價(jià)及多樣性分布［J］. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2007, 20（5）：875-882.

［15］ 魏興華, 袁筱萍, 余漢勇, 等. 我國常規(guī)稻主栽品種的遺傳變異分析［J］. 中國水稻科學(xué), 2009, 23（3）：237-244.