陳佳妮 林麗春 徐年軍 張琳 孫雪

（寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211）

雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）是綠藻綱（Chlorophyceae）、團(tuán)藻目（Volvocales）、紅球藻科（Haematococceae）的一種單細(xì)胞綠藻。它的生活周期可分為營養(yǎng)細(xì)胞和厚壁孢子兩個時期，環(huán)境有利時主要以綠色游動細(xì)胞的形式存在，環(huán)境不利時形成厚壁孢子并大量累積蝦青素［1］。其最高蝦青素含量可達(dá)到干重的5%以上［2］，且所含蝦青素在結(jié)構(gòu)、功能、應(yīng)用和安全性上優(yōu)于人工合成的，被認(rèn)為是天然蝦青素含量最高的生物，是蝦青素的最好生物來源［3］。蝦青素（Astaxanthin）是一種具強(qiáng)抗氧化活性的紅色類胡蘿卜素酮化物，也是迄今為止人類發(fā)現(xiàn)的自然界最強(qiáng)的抗氧化劑，在全球市場有很大的潛力和很高的市場價值，被廣泛應(yīng)用于飼料、食品添加劑和營養(yǎng)保健品等方面［4］。

目前，雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的研究趨勢是采用兩步培養(yǎng)法［5］，根據(jù)雨生紅球藻生長周期的特性可將蝦青素的生產(chǎn)分為利于營養(yǎng)細(xì)胞生長、生物量積累的綠色營養(yǎng)階段和利于蝦青素積累的紅色孢子階段。與低生產(chǎn)成本的化學(xué)合成法相比，雨生紅球藻生長速度緩慢，生產(chǎn)成本較高，在蝦青素的批量生產(chǎn)上不占優(yōu)勢［6］。目前，國內(nèi)外對雨生紅球藻的研究主要集中于優(yōu)化其生長和蝦青素積累條件上，如光照、溫度、pH、氮源、碳源等［7-11］。已有研究表明高CO2濃度能促進(jìn)雨生紅球藻生長和蝦青素積累［12-14］，因此研究雨生紅球藻對高濃度CO2的生理響應(yīng)具有重要的理論和實踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種 雨生紅球藻由寧波大學(xué)海洋生物工程重點實驗室微藻室提供。

1.1.2 培養(yǎng)條件 以NMB3#加富的過濾除菌自然水制成基礎(chǔ)培養(yǎng)基［15］，培養(yǎng)溫度為（25±1）℃、光照 強(qiáng) 度 為 100 μmol/（m2·s）（D∶L=12 h∶12 h）。實驗使用CO2光照培養(yǎng)箱控制CO2濃度，未通入CO2時，培養(yǎng)箱內(nèi)CO2濃度為空氣CO2濃度，顯示值為0.04%；通入CO2后，設(shè)置培養(yǎng)箱CO2濃度為0.16%，即4倍空氣CO2濃度。將對數(shù)生長期的藻液接種到盛有300 mL新鮮培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中培養(yǎng)，接種密度大約為2×104cells/mL，培養(yǎng)過程中每天在固定的時間搖瓶2次，防止細(xì)胞貼壁。

蝦青素的誘導(dǎo)階段：在低光強(qiáng)100 μmol/（m2·s）下培養(yǎng)8 d后，分別離心收集空氣CO2濃度和4倍空氣CO2濃度下培養(yǎng)的雨生紅球藻，用去離子水洗滌2次后離心，然后重新懸浮于缺氮的NMB3#培養(yǎng)基中。光照強(qiáng)度調(diào)整為200 μmol/（m2·s）（D∶L=12 h∶12 h）， 以 1.3×105cells/mL的密度接種繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 藻細(xì)胞密度測定 每天定時取3 mL藻液，于680 nm處測定其OD 值。依據(jù)藻的細(xì)胞密度和OD680關(guān)系的回歸方程y=7.973 3x+0.032 9（R2=0.990 1）計算雨生紅球藻的細(xì)胞密度。

1.2.2 葉綠素、類胡蘿卜素含量測定 葉綠素和類胡蘿卜素含量測定參照Cheng等［13］的方法，計算公式如下：

C葉綠素（mg/L）=4.35A663+19.34A645

C類胡蘿卜素（mg/L）=4×A480

例 1 (房屋評估問題) 設(shè)U={x1,x2,…,xn}是代表10套房屋的集合,A={a1,a2,a3,a4}={價格, 結(jié)構(gòu), 色彩, 周圍環(huán)境}為條件屬性集。 “價格”屬性值域為{高,適中,低}, “結(jié)構(gòu)”屬性值域為{合理,一般,差},“色彩”屬性值域為{好,差}和“周圍環(huán)境”的屬性值域為{安靜,有一點噪音,有噪音,非常吵},決策屬性D=syggg00的值域為{售賣,進(jìn)一步評估,禁止售出}?，F(xiàn)邀請4位專家對這些房屋的屬性進(jìn)行評估(具體評估結(jié)果參看文獻(xiàn)[19]),整合所有專家的意見,此時每一個屬性都會產(chǎn)生如下所示的一個U的覆蓋。

式中，A645、A663與A480，分別為波長645 nm、663 nm與480 nm時色素提取液的OD值。

1.2.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定 測量前藻樣品先暗適應(yīng)15 min，使用Water-PAM水樣葉綠素?zé)晒鈨x（Walz，Germany）進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定。設(shè)定測量光強(qiáng)度為0.1 μmol/（m2·s），光化光強(qiáng)度為 113 μmol/（m2·s），飽和脈沖強(qiáng)度為 10 000 μmol/（m2·s）。葉綠素?zé)晒鈪?shù)PS II最大光能轉(zhuǎn)化效率（Fv/Fm）、實際光化學(xué)量子效率（ФPSII）、光化學(xué)淬滅（qP）和非光化學(xué)淬滅（NPQ）可在葉綠素?zé)晒鈨x中直接讀出。

1.2.4 胞外碳酸酐酶活性測定 采用pH的方法［16-17］。離心收集藻細(xì)胞，使用4℃預(yù)冷的20 mmol/L巴比妥鈉緩沖液（pH 8.4）2 mL洗滌一次后，再用2 mL巴比妥緩沖液懸浮藻細(xì)胞。迅速向懸浮藻液中加入1 mL 0℃飽和CO2的蒸餾水，用pH計監(jiān)測反應(yīng)體系pH值的變化，記錄pH下降一個單位所需的時間。CA活性（WA）計算公式為：WA =（T0/T-1）×10其中，T0和T分別為反應(yīng)體系中未加和加入藻細(xì)胞懸浮液時pH值下降一個單位所需的時間。

1.2.5 Rubisco活性測定 Rubisco的活性測定參照J(rèn)in 等［18］的方法。

Rubisco 活 性［CO2μmol/（g·FW·min）］=［（ΔOD×Vt）/（ξ×d×Δt×Vs）×10］/2

其中，ΔOD為反應(yīng)前后340 nm吸光度的差，Vt為提取酶液總體積（mL），ξ為 1 μmol NADH2的消光系數(shù)，d為比色杯光徑（cm），Δt為測定時間（min），Vs為參加反應(yīng)的酶液體積（mL），10為重量換算系數(shù)，2表示每固定1 mol CO2有2 mol NADH被氧化。

1.2.6 蝦青素含量測定 蝦青素含量測定參照Boussiba和Vonshak［19］的方法并加以改進(jìn)，按下式計算：C（mg/L）= 4.5×A490。式中：A490為波長490 nm下的OD值。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，以P＜0.05作為顯著差異水平。

2 結(jié)果

2.1 CO2濃度對雨生紅球藻生長的影響

在綠色營養(yǎng)階段，經(jīng)過2 d的延滯期后，4倍空氣CO2濃度下的雨生紅球藻迅速進(jìn)入對數(shù)生長期，而在空氣CO2濃度下的藻生長緩慢，到第10 天，4倍空氣CO2濃度培養(yǎng)藻密度約為空氣CO2濃度的3.08倍（P＜0.05）（圖1-A）。在紅色孢子階段，除第4 天和第6 天外，藻細(xì)胞密度無明顯差異，藻細(xì)胞增殖速度隨培養(yǎng)時間的延長逐漸變緩，6 d過后藻細(xì)胞幾乎停止生長（圖1-B）。

2.2 CO2濃度對雨生紅球藻葉綠素和類胡蘿卜素含量的影響

在綠色營養(yǎng)階段，空氣CO2濃度下藻細(xì)胞葉綠素和類胡蘿卜素含量從第4 天之后快速增加，而在4倍空氣CO2濃度下增長幅度不大。從第4 天開始，雨生紅球藻在空氣CO2濃度下藻細(xì)胞葉綠素和類胡蘿卜素含量均顯著高于4倍空氣CO2濃度下的（圖2-A、2-B）。在不同CO2濃度培養(yǎng)條件下，雨生紅球藻中類胡蘿卜素/葉綠素隨時間增加而不斷升高，僅在第2 天和第6 天，低CO2濃度藻中類胡蘿卜素/葉綠素高于高CO2濃度培養(yǎng)藻（P＜0.05）（表1）。

圖1 CO2濃度對雨生紅球藻生長的影響

在紅色孢子階段，不同CO2濃度下培養(yǎng)雨生紅球藻葉綠素含量均隨培養(yǎng)時間增加而逐漸降低。除第2天外，4倍空氣CO2濃度下藻的葉綠素含量均顯著低于空氣CO2濃度培養(yǎng)藻（圖2-C）。自第2 天起，4倍空氣CO2濃度下類胡蘿卜素含量、類胡蘿卜素與葉綠素比值增加，且顯著高于低CO2濃度組（圖2-D、表2）。在第8 天，4倍空氣CO2濃度下類胡蘿卜素含量是空氣CO2濃度類胡蘿卜素含量的1.78倍，類胡蘿卜素/葉綠素是空氣CO2濃度的2.47倍。

2.3 CO2濃度對雨生紅球藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

如圖3所示，在綠色營養(yǎng)階段，雨生紅球藻的Fv/Fm、ФPSII、qP隨著培養(yǎng)時間變化而上下波動，但差別不大；NPQ在個別時間點變化較大。4倍空氣CO2濃度下雨生紅球藻的NPQ和大部分ФPSII都高于空氣CO2濃度培養(yǎng)藻，而Fv/Fm僅在第3天和第7天與低CO2濃度組差異顯著，但qP對兩種不同CO2濃度的響應(yīng)無顯著差異（圖3-C）。

2.4 CO2濃度對雨生紅球藻胞外碳酸酐酶活性的影響

CO2濃度對營養(yǎng)階段雨生紅球藻碳酸酐酶活性的影響顯著（圖4）。從第4天到第8天，空氣CO2濃度下和4倍空氣CO2濃度下的雨生紅球藻碳酸酐酶活性都呈逐漸下降的趨勢。4倍空氣CO2濃度培養(yǎng)藻的碳酸酐酶活性約為空氣CO2培養(yǎng)的0.55-0.75倍（P＜0.05），該結(jié)果說明較高濃度CO2會抑制碳酸酐酶活性。

圖2 CO2濃度對雨生紅球藻葉綠素和類胡蘿卜素含量的影響

表1 不同CO2濃度培養(yǎng)雨生紅球藻類胡蘿卜素/葉綠素比值的變化（綠色營養(yǎng)階段）

表2 不同CO2濃度培養(yǎng)雨生紅球藻類胡蘿卜素/葉綠素比值的變化（紅色孢子階段）

2.5 CO2濃度對雨生紅球藻Rubisco活性的影響

在綠色營養(yǎng)階段，不同CO2濃度下的雨生紅球藻Rubisco初始活性隨著培養(yǎng)時間的變化呈現(xiàn)先略有上升然后下降的趨勢。除在第6天，4倍空氣CO2濃度下培養(yǎng)藻Rubisco初始活性顯著高于空氣CO2濃度下培養(yǎng)藻之外，其余時間點的雨生紅球藻Rubisco初始活性在兩種CO2濃度培養(yǎng)組均無顯著變化（圖5-A）。在第4、5天，空氣CO2濃度下雨生紅球藻Rubisco總活性略大于4倍空氣CO2濃度下的，而在后3 d則相反，但不同CO2濃度下紅球藻的Rubisco總活性無顯著差異（圖5-B）。

2.6 CO2濃度對雨生紅球藻蝦青素含量的影響

不同CO2濃度培養(yǎng)雨生紅球藻蝦青素含量都隨培養(yǎng)時間的延長而逐漸升高。在第8 天，4倍空氣CO2濃度下單個藻細(xì)胞蝦青素含量達(dá)到6.35×10-6μg，比空氣CO2濃度下蝦青素含量增加了20.23%（P＜0.05）（圖6）?？梢?，在缺氮高光培養(yǎng)條件下，CO2濃度顯著影響了雨生紅球藻蝦青素含量。

圖3 CO2濃度對綠色營養(yǎng)階段雨生紅球藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

圖5 CO2濃度對綠色營養(yǎng)階段雨生紅球藻Rubisco活性的影響

3 討論

CO2是植物生長的重要影響因子之一。在一定范圍內(nèi)，提高CO2濃度可以促進(jìn)藻類植物的生長，例如龍須菜、小球藻、等鞭金藻等［20-22］。適宜的高CO2濃度也能促進(jìn)雨生紅球藻生長，但過高CO2濃度對其生長、光合作用、碳同化無益［14］。本文研究結(jié)果表明，4倍空氣CO2濃度是一個適宜的高CO2濃度，極大地促進(jìn)了綠色營養(yǎng)期雨生紅球藻細(xì)胞密度的提高；但該CO2濃度顯著抑制了紅色孢子期雨生紅球藻生物量積累。據(jù)報道，高濃度CO2對雨生紅球藻蝦青素積累也有很大的影響，如0.06%、6%、10%和20%CO2均能有效促進(jìn)雨生紅球藻中蝦青素的積累［12-14］。本研究中 4 倍空氣 CO2（0.16%CO2）濃度，同樣促進(jìn)了雨生紅球藻中蝦青素含量的升高。

圖6 CO2濃度對紅色孢子階段雨生紅球藻蝦青素含量的影響

高CO2濃度會降低藻類的色素含量［23］。本實驗結(jié)果表明，高CO2濃度下雨生紅球藻中葉綠素和類胡蘿卜素含量都顯著降低，這與韋韜等［12］結(jié)論相似。本研究中，紅色孢子階段紅球藻細(xì)胞葉綠素含量顯著降低，類胡蘿卜素大量合成，這與受到環(huán)境脅迫時，雨生紅球藻可以通過積累蝦青素等來保護(hù)細(xì)胞有關(guān)［24］。而類胡蘿卜素與葉綠素比值越高就越適宜雨生紅球藻蝦青素的積累［14，25］。高CO2濃度下類胡蘿卜素/葉綠素顯著增加，這說明高光缺氮脅迫與高CO2濃度共同作用能有效促進(jìn)雨生紅球藻蝦青素合成。

Fv/Fm是PS II最大光能轉(zhuǎn)化效率，反映了藻類進(jìn)行光合作用的最大潛力，同時也是反映藻類生長環(huán)境良好與否的重要指標(biāo)，在非脅迫條件下該參數(shù)變化較?。?6］。ФPSII是實際光化學(xué)量子效率，反映PS II反應(yīng)中心在有部分關(guān)閉情況下的實際原初光能捕獲率。在本研究中，綠色營養(yǎng)階段4倍空氣CO2濃度下雨生紅球藻的Fv/Fm、ФPSII多升高，說明4倍空氣CO2濃度下藻細(xì)胞光能轉(zhuǎn)化效率和光利用水平較高。光化學(xué)淬滅（qP）是反映PS II天線色素吸收的光能用于光化學(xué)電子傳遞的份額；而非光化學(xué)淬滅（NPQ）則表示的是 PS II天線色素吸收的光能中不用于光合電子傳遞而以熱形式耗散的部分［27］。本研究結(jié)果中高濃度CO2促進(jìn)了雨生紅球藻NPQ的顯著升高，而qP值與低CO2相比無顯著變化。推測，在正?？諝釩O2水平下，雨生紅球藻已經(jīng)適應(yīng)了這種低CO2條件，沒有過多的熱能耗散。而在4倍CO2下雨生紅球藻受到了較高CO2脅迫，熱形式耗散的能量增加，因此4倍CO2下該藻的NPQ比正?？諝釩O2濃度要高。但在4倍CO2條件下，該藻在熱形式耗散和光合作用效率兩方面達(dá)到了平衡，F(xiàn)v/Fm、ФPSII和NPQ都升高，最終光合效率提高，生長加快。

CA是一種負(fù)責(zé)CO2轉(zhuǎn)運的酶，能夠可逆地催化CO2與HCO3-之間的轉(zhuǎn)化，重新固定呼吸釋放的CO2并用于光合作用［28］。本實驗結(jié)果顯示4倍空氣CO2濃度下培養(yǎng)藻的CA活性顯著低于空氣 CO2濃度，這與微藻細(xì)胞內(nèi)存在的二氧化碳濃縮機(jī)制（CO2concentrating mechanism，CCM）有關(guān)，說明高濃度CO2會抑制無機(jī)碳的轉(zhuǎn)運，而低濃度CO2可以通過誘導(dǎo)CCM機(jī)制來增強(qiáng)胞外CA活性，提高胞內(nèi)CO2水平從而維持較高的光合固碳能力［29］。Rubisco是催化光合CO2固定和光呼吸最初步驟的關(guān)鍵酶，藻類中95%以上的有機(jī)碳是由Rubisco固定的，但是Rubisco對CO2的親和力較低，且水體中可溶性CO2不足使得水體中藻類光合固碳受限［30］。CO2濃度是影響植物Rubisco活性的一個重要因素。有研究表明，CO2加富處理會顯著提高黃瓜Rubisco活性［31］。然而并不是所有植物在高CO2環(huán)境中Rubisco活性都會增加，在對多種不同植物進(jìn)行的研究中，Rubisco活性平均下降了24%［32］。在本研究中高CO2濃度下雨生紅球藻Rubisco活性升高并不顯著，這可能與高濃度CO2引起的二磷酸核酮糖（RuBP）羧化限制和RuBP再生限制有關(guān)［33］。

4 結(jié)論

本研究表明相比于空氣CO2濃度，4倍空氣CO2濃度條件下雨生紅球藻生長加快，葉綠素和類胡蘿卜素含量及其比值、葉綠素?zé)晒鈪?shù)、CA活性、蝦青素含量均變化顯著。4倍空氣CO2濃度更利于雨生紅球藻生長、光合作用中光能轉(zhuǎn)化效率和光利用水平的提高及蝦青素的合成。

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