殷繼忠 李亮 接偉光 蔡柏巖，

（1. 黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 黑龍江省普通高等學(xué)校微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080；2. 黑龍江東方學(xué)院食品與環(huán)境工程學(xué)部，哈爾濱 150066）

大豆作為一種重要的油料作物，在國民經(jīng)濟(jì)中一直占有重要地位。近年來，隨著人們需求碳量的增大，耕地面積緊張導(dǎo)致大豆連作現(xiàn)象日益嚴(yán)重。黑龍江省是我國非轉(zhuǎn)基因大豆主要產(chǎn)區(qū)，然而，大豆連作現(xiàn)象極為嚴(yán)重［1］。作物連作會(huì)造成土壤理化性質(zhì)惡化、土傳病害加劇及自毒作用，進(jìn)而減少作物產(chǎn)量，影響作物正常生產(chǎn)［2-3］。在農(nóng)田中，連作條件下大多依靠施肥來提高作物產(chǎn)量，但會(huì)破壞土壤結(jié)構(gòu)、養(yǎng)分失衡、自毒物質(zhì)積累，加劇作物土傳病害的產(chǎn)生［4］。

細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在土壤養(yǎng)分中一直扮演重要角色［5］。研究表明，連作會(huì)破壞土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，促進(jìn)病原微生物生長，抑制有益微生物繁殖，進(jìn)而造成作物減產(chǎn)［6-7］。相關(guān)研究證實(shí)，連作障礙可危害黃瓜，番茄和大豆等大多數(shù)作物的生長［8-10］。研究發(fā)現(xiàn)，土壤受土壤種類、種植模式和種植作物種類等眾多因素影響，與間作種植模式相比，連作會(huì)導(dǎo)致土壤酶活性、微生物群落數(shù)和土壤養(yǎng)分均有降低［11］。近年來，有關(guān)根際土壤微生物菌群結(jié)構(gòu)的研究多采用DGGE技術(shù)，但該技術(shù)僅能分析有限的優(yōu)勢(shì)微生物類群，存在高估物種豐度以及低估微生物群落大小和多樣性的可能，并具有較大的隨機(jī)性很難檢測(cè)出低豐度的土壤微生物類群［12-13］。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，高通量測(cè)序已成為定量和鑒別微生物群落演替的更好的研究工具［14］。該技術(shù)能夠在整體微生物細(xì)菌群落水平下分析物種遺傳多樣性，并能較為客觀的反映樣本中低豐度的重要功能微生物［15］。該技術(shù)具有測(cè)序通量高、試驗(yàn)過程簡化、速度快、準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn)，試驗(yàn)結(jié)果能夠更好地反應(yīng)出群落結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)。

本研究選用大豆品種為黑農(nóng)48，大田選取連作0年和連作2年土樣。利用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)分析對(duì)比根際土壤中的細(xì)菌多樣性旨在探索連作大豆根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，旨為改善連作大豆土壤菌群結(jié)構(gòu)、提高大豆生長奠定前期理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)在哈爾濱工業(yè)大學(xué)糖業(yè)研究所試驗(yàn)站進(jìn)行。試驗(yàn)土壤主要理化指標(biāo)：有機(jī)質(zhì)26.13 g/kg，全N 1.69 g/kg，全P 5.5 g/kg，全K 24.6 g/kg，堿解N 136.2 mg/kg，速效P 13.40 mg/kg，速效K 205 mg/kg，pH7.0。

試驗(yàn)材料由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。選用黑龍江省主栽大豆品種：黑農(nóng)48（HN48，高蛋白品種，蛋白質(zhì)含量平均45%，脂肪含量平均為20%）。

1.2 方法

1.2.1 大田試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)土壤分別選用：連作0年（未種植大豆土壤，即第一年種植大豆土壤，三個(gè)生物學(xué)重復(fù)分別標(biāo)記為L0 1、L0 2和L0 3）和連作2年（種植過2年大豆，及第三年種植大豆土壤，三個(gè)生物學(xué)重復(fù)分別標(biāo)記為L2 1、L2 2和L2 3）大田土壤。2016年5月17日播種，生育期正常澆水。

1.2.2 樣本采集 在大豆成熟期進(jìn)行采樣，三點(diǎn)取樣法隨機(jī)取樣，取10-20 cm大豆根際土壤樣本，每個(gè)土樣隨機(jī)采取三點(diǎn)，去除土樣中的植物和動(dòng)物殘?bào)w等雜質(zhì)，分別混合后過40目篩子，一部分裝入土袋中保存于-80℃冰箱中；另一部分用于土樣的高通量測(cè)序。

1.2.3 Illumina高通量測(cè)序 土壤樣本用干冰送到上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，進(jìn)行Illumina高通量測(cè)序。細(xì)菌的16S rDNA擴(kuò)增引物選用V3-V4區(qū)引物（338F-806R），每個(gè)土壤樣本3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2.4 有效序列和優(yōu)化序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 運(yùn)用多個(gè)樣品平行測(cè)序的方法，所以各樣品中的序列均引入了一段標(biāo)示其樣本來源信息的barcode標(biāo)簽序列及前引物（forward primer）序列。本次分析根據(jù)barcode標(biāo)簽序列和前引物序列篩選出有效序列后，將測(cè)序接頭與barcode序列去除，并對(duì)處理后的有效序列進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。為了得到更高質(zhì)量及更精準(zhǔn)的生物信息分析結(jié)果，應(yīng)對(duì)有效序列進(jìn)行去雜。丟棄長度短于150 bp、含有模糊堿基、引物堿基含2個(gè)以上錯(cuò)配的序列，即得到優(yōu)化序列，之后對(duì)優(yōu)化序列進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

1.2.5 OTU-based分析 對(duì)所有樣品進(jìn)行OTU生成并對(duì)OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析。將優(yōu)化序列選取長度大于350 bp的序列并截齊后與silva庫比對(duì)后對(duì)序列進(jìn)行聚類。聚類分析使用的軟件為 mothur和chopseq。

1.2.6 細(xì)菌群落多樣性分析 細(xì)菌群落物種的豐富度和多樣性分別用Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)表示，測(cè)序深度指數(shù)用Coverage表示。

1.2.7 群落結(jié)構(gòu)分析 將優(yōu)化序列根據(jù)silva庫中的參考序列鑒定OTU種屬。在門的水平上做樣品群落分布柱狀圖，比較3個(gè)土樣中的菌落分布情況。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

通過Illumina高通量測(cè)序并優(yōu)化后，樣品共獲得225 998條序列，總堿基數(shù)為136 050 796 bp，平均堿基長度為99 228 256 bp，其中421-440 bp和441-460 bp的堿基分別占總序列的45.61%和53.70%，如表所示。

表1 樣本序列長度分布

對(duì)測(cè)序獲得的序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣，以抽樣得到的序列數(shù)與他們所代表的OTU數(shù)目構(gòu)建稀釋性曲線，從圖1中可以看出，6個(gè)樣本的稀釋性曲線菌區(qū)域平坦，這表明試驗(yàn)測(cè)序數(shù)據(jù)合理，更多的測(cè)序數(shù)據(jù)只會(huì)產(chǎn)生少量新的OTU。

圖1 稀釋曲線圖

2.2 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

通過比較DNA序列的相似性，將大于97%的序列相似性歸為同一種可操作分類單元（opertinal taxonomic unit，OTU）。對(duì)不同連作年限的大豆根際土壤細(xì)菌16S rDNA多樣性指數(shù)進(jìn)行分析，L0_1、L0_2、L0_3、L2_1、L2_2及 L2_3的 Shannon指 數(shù)分別為6.70、6.68、6.63、6.56、6.58及6.60，Chao指數(shù)分別為2 144、2 133、2 130、2 023、2 101和2 044（表2），可以看出連作后細(xì)菌的多樣性和豐富度均有所降低。表明不同連作年限的大豆根際土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在差異，細(xì)菌多樣性及豐富度均降低。

表2 不同連作年限的土壤樣本中細(xì)菌豐富度和多樣性指數(shù)

通過表3的獨(dú)立樣本檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)方差方程的Levene檢驗(yàn)P=0.294＞0.05證明具有方差齊性；則P=0.019＜0.05證明連作0年與連作2年間的香農(nóng)指數(shù)存在差異顯著。

由圖2可知，全部供試土壤中共檢測(cè)到10個(gè)細(xì)菌門，其中L2年中相對(duì)豐度大于1%的有10個(gè)，L0年的有9個(gè)。80%以上的細(xì)菌序列屬于變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）。而牙單胞菌門（Gemmatimonadetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、硝化螺菌門（Nitrospirae）、厚壁菌門（Firmicutes）、浮霉菌門（Planctomycetes）的相對(duì)豐度所占比例較低。

隨著連作年限的增加細(xì)菌的門水平也隨之產(chǎn)生變化，變形菌門（Proteobacteria）的相對(duì)豐度連作0年較連作2年有所增加，相似的放線菌門（Actinobacteria）也出現(xiàn)了豐度增加現(xiàn)象。而相反的酸桿菌門（Acidobacteria）和綠彎菌門（Chloroflexi）的相對(duì)豐度在連作2年要低于連作0年。

同時(shí)從數(shù)據(jù)庫中鑒定出418個(gè)屬，從土壤樣本細(xì)菌屬的相對(duì)豐度中能發(fā)現(xiàn)年際變化。從圖3可以看出大豆連作0年最豐富的細(xì)菌屬是Subgroup_6_norank，Anaerolineaceae和RB41_norank，而連作2年的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬為Subgroup_6_norank，Acidimicrobiales，Gemmatimonadaceae，Nitrosomonadaceae 和 Anaerolineaceae。

表3 不同連作年限香農(nóng)指數(shù)的顯著性分析

圖2 連作2年與連作0年門水平群落結(jié)構(gòu)組成圖

圖3 連作2年與連作0年屬水平群落結(jié)構(gòu)組成圖

由圖3可知，通過對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)連作大豆2年土樣中的酸微菌目（Acidimicrobiales_uncultured）、硝化螺菌屬（Nitrospira）、鞘氨醇菌屬（Sphingomonas）和芽孢桿菌屬（Bacillus）的相對(duì)豐度要高于連作0年土樣。

2.3 群落結(jié)構(gòu)分析

在屬的水平上對(duì)樣品和樣品所含菌屬進(jìn)行聚類，根據(jù)聚類后的各樣品中不同OTU數(shù)，對(duì)應(yīng)所含序列的豐度作出Heatmap（圖4），顏色梯度的變化，能夠反映出在菌屬水平上各樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異性。菌屬的豐度會(huì)受到大豆連作條件的影響，其中菌屬的豐度受作物種植方式影響最大的是Acinobacteria、Proteobacteria、Acidobacteria、Chloroflexi和Verrucomicrobia。在連作與輪作土壤中所測(cè)得的細(xì)菌菌屬中豐度差異較大的有：Acidimicrobiales、Gemmationadaceae、Nitrosomonadaceae 和 Anareolinenceae等。

由圖5可見，可以將大豆根際土壤16S rDNA細(xì)菌的Heatmap圖劃分為3個(gè)Cluster。首先Cluster1主要包括亞硝化細(xì)菌科、酸微菌目、厭氧繩菌科。大豆種植方式的改變影響著大豆根際土壤中的細(xì)菌相對(duì)豐度。連作2年中的酸微菌目豐度增加高于連作0年。Cluster2主要包括紅色桿菌屬、假諾卡氏菌屬、噬纖維素菌科以及一些未知的菌，其中紅色桿菌屬與噬纖維菌科相對(duì)豐度有所減少，而假諾卡氏菌屬略有增加。Cluster3中主要包括牙單胞菌屬、鏈霉菌屬、慢生根瘤菌屬等。從圖4可見，芽單胞菌屬在連作2年種植后豐度降低，但是鏈霉菌屬、及慢生根瘤菌屬在連作種植后細(xì)菌豐度高于輪作種植。

從總體來看，連作2年與連作0年相比，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和豐度變化并不顯著。這說明連作種植模式雖然會(huì)降低根際土壤中細(xì)菌多樣性但對(duì)細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和豐度影響較小。

3 討論

從影響部位看，連作造成的微生物群落變化主要發(fā)生在根際部位。雖然可培養(yǎng)微生物占土壤微生物總量的比例不足1%，但土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌是對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)貢獻(xiàn)最大的類群，它們比整個(gè)微生物群體更容易遭受土壤生態(tài)系統(tǒng)變化的影響，可用作與污染影響有關(guān)的指示劑［16-17］。土壤微生物幾乎參與土壤中一切生物和生物化學(xué)反應(yīng)，其主要生理類群則直接參與土壤中C、N等營養(yǎng)元素的循環(huán)和能量流動(dòng)，其數(shù)量和活性直接關(guān)系到土壤生態(tài)系統(tǒng)的維持和改善［18］。由此連作根際土壤中菌群結(jié)構(gòu)變化一直是人們研究過程中的重點(diǎn)。

圖4 基于16S rDNA序列構(gòu)建的熱圖

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)得到的各處理Coverage指數(shù)均達(dá)到80%以上，證實(shí)本次測(cè)序結(jié)果可以反應(yīng)樣本的真實(shí)情況。對(duì)于分析根際土壤中的不同微生物群落結(jié)構(gòu)是十分有效的方法，多樣性指數(shù)數(shù)值越高則代表樣本中的微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性越高，它由群落的多樣性及群落的豐富度兩部分構(gòu)成［19-20］。本研究結(jié)果表明，連作2年較連作0年土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)有明顯差異，Shannon指數(shù)和豐富度指數(shù)均呈現(xiàn)L0＞L2?？梢婋S著連作種植模式的出現(xiàn)，大豆根際土壤中的細(xì)菌多樣性隨之減少。大量研究證實(shí)連作會(huì)破壞土壤細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)，降低土壤細(xì)菌多樣性及菌種的豐富度［3，21］。

本實(shí)驗(yàn)研究中，連作年限不同的根際土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在一定的差異。連作0年土樣中的細(xì)

菌Shannon指數(shù)要高于連作2年土樣且差異顯著，這一結(jié)論表明連作后的土壤多樣性指數(shù)有所下降。同時(shí)通過試驗(yàn)結(jié)果得知放線菌門（Actinobacteria）在連作2年與連作0年中表現(xiàn)出增加趨勢(shì)。連作種植后土樣中的放線菌數(shù)量增加，這一結(jié)果與孫秀山等［22］的研究結(jié)果相似。揭示長期連作會(huì)對(duì)細(xì)菌，真菌和放線菌造成的影響較大，而連作障礙在短時(shí)期內(nèi)對(duì)細(xì)菌與放線菌造成的影響較?。?2］。大蒜在連作種植后，土壤中的細(xì)菌與放線菌數(shù)量均隨種植年限的增加而表現(xiàn)出先上升后下降態(tài)勢(shì)，在連作種植某年為期，在此之前細(xì)菌和放線菌的數(shù)量及微生物總量逐漸增多，之后猛然下降［23］。另外一些研究結(jié)果也有顯示，連作并沒有使土壤由細(xì)菌型向真菌型轉(zhuǎn)變。例如對(duì)地黃、太子參的相關(guān)研究證實(shí)，隨著連作年限的增加，土壤細(xì)菌數(shù)量下降極為顯著，但放線菌數(shù)量卻增加極為顯著［24-25］。

圖5 基于16S rDNA序列構(gòu)建的熱圖

通過Heatmap圖和群落結(jié)構(gòu)圖得知，大豆連作種植后根際土樣中的酸微菌目、根瘤菌屬、芽孢桿菌屬及鞘氨醇菌屬的相對(duì)豐度均大于輪作土樣，而纖維分解菌屬在連作土樣中相對(duì)豐度下降。且得出的試驗(yàn)結(jié)果在其他作物種植過程中也有出現(xiàn)，如固氮菌與纖維素分解菌都作為有益微生物分別參與了土壤的氮素與碳素循環(huán)過程。李瓊芳［26］研究證實(shí)隨連作年限的增加，土壤中有益細(xì)菌數(shù)量銳減；當(dāng)大蒜連作5-10年后，土壤中的硝化細(xì)菌和鞘氨醇單胞菌數(shù)量呈上升趨勢(shì)，并未有連作障礙的現(xiàn)象出現(xiàn)，只有經(jīng)過連作15-20年后才會(huì)出現(xiàn)細(xì)菌數(shù)量的減少等明顯連作障礙現(xiàn)象［27］。李婧等［28］通過克隆文庫的研究方法證實(shí)，花生在連作后，土壤中的芽孢桿菌的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，其中的一些芽孢桿菌如高地芽孢桿菌成為了土壤微生態(tài)環(huán)境的優(yōu)勢(shì)菌群。同時(shí)在不同作物連作后，土壤細(xì)菌生理菌群的變化趨勢(shì)不盡相同：劉亞峰等［29］對(duì)黃瓜連作表明連作2 年土壤中自生固氮菌和纖維素分解菌數(shù)量均上升，第3年有所下降。而陳慧等［24］對(duì)地黃連作的研究表明連作地黃土壤中氨化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌、好氣性固氮菌、嫌氣性纖維素分解菌、硫化細(xì)菌數(shù)量增多，好氣性纖維素分解菌大量減少。通過研究發(fā)現(xiàn)連作種植后，土壤中有益的芽孢桿菌、纖維素分解菌及固氮菌等有益細(xì)菌的數(shù)量增加，這與以上研究結(jié)果相一致。有益細(xì)菌未顯著減少表明細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)變化并不顯著。

從Heatmap圖和群落結(jié)構(gòu)圖的總體上看，細(xì)菌的多樣性和豐度變化不大，這也與大多數(shù)田間觀察結(jié)果相同。例如花生在連續(xù)種植期間根際細(xì)菌數(shù)量逐漸降低、真菌數(shù)量明顯上升［30］。通過對(duì)連作五年馬鈴薯的觀察發(fā)現(xiàn)其土壤中的尖孢鐮刀菌和立枯絲核菌等數(shù)量增加，土傳病害愈加嚴(yán)重，進(jìn)而影響作物生長。作物病蟲害更加嚴(yán)重。連作環(huán)境保持相對(duì)穩(wěn)定的狀況會(huì)導(dǎo)致病蟲害的頻發(fā)。連作對(duì)細(xì)菌以及固氮菌均有抑制作用，而對(duì)真菌卻有著促進(jìn)作用，土壤由細(xì)菌型轉(zhuǎn)換為真菌型，由高肥力轉(zhuǎn)變?yōu)榈头柿Γ?1，32］，連作后土壤中原有的優(yōu)勢(shì)屬的線蟲群落如食細(xì)菌線蟲和食真菌線蟲顯著降低，而以植物寄生線蟲為優(yōu)勢(shì)屬的線蟲開始破壞寄主植物，致使土壤不利于作物生長，進(jìn)而造成減產(chǎn)［33］。由此可見致使作物連作的主要影響因素是真菌病害及線蟲病害，而細(xì)菌數(shù)量會(huì)逐漸降低，真菌病害逐年嚴(yán)重，這也與Heatmap圖細(xì)菌豐度變化較小的趨勢(shì)吻合。由此推測(cè)，連作土壤中細(xì)菌并不能夠占據(jù)主導(dǎo)地位，對(duì)連作的影響并不明顯，相較真菌的優(yōu)勢(shì)性來看，細(xì)菌在土壤中發(fā)揮的作用較小。本研究結(jié)果表明大豆連作2年較連作0年硝化細(xì)菌和固氮菌數(shù)量均有減少的變化趨勢(shì)。由此推測(cè)在短期連作種植過程中，不同作物根際微生物類群的變化規(guī)律各不相同，難以用來推斷細(xì)菌在作物連作所存在普遍現(xiàn)象。

本研究應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)探究連作2年與連作0年土壤中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化。通過對(duì)兩種大豆種植模式根際土壤分析可知，連作0年土壤的多樣性指數(shù)高于連作2年土壤，這表明大豆的連作種植對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有重要影響，但相對(duì)豐度較低且變化并不顯著，證明在連作土壤中細(xì)菌并不能占據(jù)主導(dǎo)地位發(fā)揮作用。因此，也有必要研究長期連作過程細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的組成及多樣性隨著連作年限的延長發(fā)生的變化。

4 結(jié)論

研究結(jié)果與其他相關(guān)研究報(bào)道有相似之處，發(fā)現(xiàn)連作后土壤的有益細(xì)菌增加，如：鞘氨醇單胞菌、固氮菌、纖維素分解菌等。同時(shí)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)連作2年土樣的微生物多樣性要低于連作0年，推測(cè)短期大豆連作雖然使細(xì)菌菌群多樣性降低，但是在大豆連作2年時(shí)并沒有產(chǎn)生嚴(yán)重的連作障礙現(xiàn)象，土壤中細(xì)菌菌群豐度也并未發(fā)生顯著變化。

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