辛胡 顏岳輝 丁雪梅 劉潮 高永 代冬琴唐利洲 王海波

（1. 西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，昆明 650224；2. 曲靖師范學(xué)院 云南高原生物資源保護與利用研究中心 云南省高校云貴高原動植物遺傳多樣性及生態(tài)適應(yīng)性重點實驗室，曲靖 655011）

小桐子（Jatropha curcas L.）又名麻瘋樹、黃腫樹（廣東）、膏桐（云南）、桐油樹（臺灣）、假花生（廣西），發(fā)源于加勒比海的海島，現(xiàn)廣泛分布和栽培于熱帶、亞熱帶等地區(qū)［1-2］，在我國主要分布于廣西西南部和西部、云南南部和東南部等地區(qū)［3］。它屬大戟科（Euphorbiaceae）麻瘋樹屬（Jatropha）多年生木本油料植物，其種子含油量高，流動性好，是加工生物柴油的優(yōu)質(zhì)原料，且耐干旱貧瘠，是干熱河谷地區(qū)理想的生態(tài)造林樹種［4-5］，被世界公認為生物能源樹種。其油被改性后適用于各種柴油機，并在閃點、凝固點、硫含量、一氧化碳排量及顆粒值等關(guān)鍵技術(shù)均優(yōu)于國內(nèi)零號柴油，達到歐洲二號排放標準。另外，其種仁可作為傳統(tǒng)的肥皂及潤滑油原料［6］，有瀉下和催吐功效［7-8］，油麩可作農(nóng)藥及肥料［9］，兼具經(jīng)濟價值及良好的開發(fā)前景［10］。

生物與非生物逆境脅迫下，植物通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，并結(jié)合靶基因上游特定順式作用元件從而激活或抑制抗逆相關(guān)基因以特定的時空與強度進行轉(zhuǎn)錄表達，進而抵抗不利環(huán)境［11］。目前，已經(jīng)鑒定的植物抗逆轉(zhuǎn)錄因子包括 MYB、WRKY、ZFP、AP2/ERF、bHLH、NAC、VOZ、CAMTA及 EIN3等［12-13］。其中，MYB基因家族及MYB結(jié)構(gòu)域基因進化時間較長，且存在于所有真核生物中，是植物界最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一［14］，參與植物細胞分化、葉片等器官的形態(tài)建成、次生物質(zhì)代謝、細胞周期調(diào)節(jié)及環(huán)境因子的應(yīng)答等過程［15］。根據(jù)MYB結(jié)構(gòu)域的數(shù)量及分布，MYB基因一般分為4種類型，其中，R2R3-MYB是植物中分布最為廣泛的一種MYB基因［16-17］，而R1R2R3-MYB（3R-MYB）主要存在于動物體中，參與動物細胞周期的調(diào)節(jié)等過程［18-19］，但在植物中數(shù)量較少，一般含有4-5個［20］，4R-MYB在大部分動植物中僅含有1個，而且人們對其功能的了解甚少。本研究基于小桐子基因組數(shù)據(jù)庫，對MYB基因家族在全基因組水平進行了鑒定，并克隆到一個MYB基因家族基因JcMYB308，順式作用元件與qRT-PCR分析顯示其可能參與小桐子多種非生物脅迫如低溫的應(yīng)答過程，本研究為進一步對該基因進行功能驗證及轉(zhuǎn)基因研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料及處理 本實驗選用的小桐子種子取自云南省楚雄州元謀縣。選取飽滿的小桐子種子，1.5% CuSO4溶液消毒15 min后，用無菌水漂洗3-5次，置于26℃的恒溫培養(yǎng)箱中吸漲24 h。隨后，將吸漲的種子于無菌水中漂洗2-3次后，置于墊有5層無菌水濕潤濾紙的托盤中，在相對濕度（RH）為75%、26/20℃、16/8 h光周期的恒溫培養(yǎng)箱中萌發(fā)5 d。選取發(fā)芽較好的種子播于消毒的培養(yǎng)土中，并于相同條件的恒溫培養(yǎng)箱中生長約15 d，直至第2片真葉展開。隨后將生長15 d后的小桐子幼苗置于相對濕度（RH）為75%、12℃、16/8 h光周期的低溫培養(yǎng)箱中進行低溫脅迫處理，分別取低溫脅迫0.5、3、12、24、48 h與對照（正常培養(yǎng)）的第2片真葉、莖及根，置于貼好標簽的自封袋中，液氮速凍后存于-80℃冰箱中用于RNA的提取。

1.1.2 實驗的主要試劑 本研究中大腸桿菌 Trans1-T1（DH5α）、TransZol Up、DNase I、TransStart Taq DNAPolymerase、氨芐青霉素（Amp）、X-gal、IPTG、2× Easy Taq PCR SuperMix（+dye）、EasyPure Plasmid MiniPrep Kit、pEASY-T1 Cloning Kit、Trans 2K Plus II DNA Marker、TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix、TransStart Top Green qPCR SuperMix等購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物合成及測序由華大基因有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 小桐子MYB基因家族全基因組成員鑒定及序列分析 從GenBank下載小桐子最新注釋蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，通過Pfam（http://pfam.xfam.org/）下載MYB結(jié)構(gòu)域的隱馬可夫模型（PF02701），利用Hmmer3.0軟件的Hmmsearch程序?qū)π⊥┳拥鞍踪|(zhì)數(shù)據(jù)庫進行比對（閾值E＜1e-10，序列相似性＞50%），得到候選的小桐子MYB蛋白質(zhì)序列，并手工去除重復(fù)序列。將非冗余的候選序列利用Pfam與CDD在線工具分析MYB蛋白結(jié)構(gòu)域做進一步篩選，得到最終的小桐子MYB家族蛋白序列。將鑒定的小桐子MYB蛋白序列利用ClustalX（Version2.0）進行序列相似性比對，然后用MEGA6.0軟件通過鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，并采用自展法（Bootstrap）進行檢驗。

1.2.2 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成 利用兩步裂解法提取小桐子對照與12℃低溫脅迫0.5、3、12、24、48 h的根、莖及葉片的總RNA，并利用DNase I消化RNA中的殘余基因組DNA，得到純化的總RNA。分別取3 μg總RNA，以Anchored Oligo（dT）為逆轉(zhuǎn)錄引物，利用 TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix合成第一鏈 cDNA。

1.2.3 小桐子JcMYB308基因cDNA片段的克隆 以1.2.2反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，使用雙封閉熱啟動DNA聚合酶TransStart Taq DNA Polymerase進行PCR擴增，引物序列為：JcMYB308_F1：5'-AACCCATTTGCCTTGTCT-3'；JcMYB308_R1：5'-CTCCATCGCCAGTCTTCA-3'。擴增條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，51.8℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃后延伸20 min。切膠回收目的條帶（約700 bp），與克隆載體pEASY-T1連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，涂Amp抗性LB平板，過夜培養(yǎng)，進行藍白斑篩選。挑取單菌落進行菌落PCR驗證陽性克隆，提取重組質(zhì)粒命名為pEASY-T1-JcMYB308。

1.2.4 小桐子JcMYB308基因的序列分析 利用BioEdit軟件將克隆的小桐子JcMYB308基因cDNA序列翻譯成氨基酸序列，用在線工具ProtParam計算其理論分子量、等電點等基本參數(shù)。將獲得的小桐子JcMYB308基因?qū)enBank小桐子基因組序列（Annotation release 101）進行tblastn檢索得到其基因與CDS序列，同時下載其它植物的MYB308基因序列、CDS序列及氨基酸序列。利用在線軟件GSDS（Gene Structure Display Server，http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）進行CDS序列與基因序列比對以確定基因內(nèi)含子與外顯子的結(jié)構(gòu)并繪制基因結(jié)構(gòu)圖。將小桐子JcMYB308蛋白序列與其它植物MYB308進行序列相似性比對，然后用MEGA6.0軟件通過鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。利用GenBank的CDD工具對比對文件進行結(jié)構(gòu)域分析并利用GenDOC軟件繪圖。

1.2.5 小桐子JcMYB308基因的熒光定量表達分析 利用1.2.2中獲得的小桐子各器官低溫脅迫條件下的cDNA為模板，以18S rRNA為內(nèi) 參（GenBank登 錄 號：AY823528）， 利 用TransStart Top Green qPCR SuperMix進 行 小 桐子JcMYB308基因的qRT-PCR擴增，使用儀器為 Roche Lightcycler 96，20 μL反 應(yīng) 體 系， 每 個樣品重復(fù)3次。JcMYB308基因擴增引物序列JcMYB308_F2（5'-AACCCATTTGCCTTGT-3'），JcMYB308_R2（5'-CAGCAGCCTTCACCAT-3'）；內(nèi)參基因18S rRNA擴增引物序列18S rRNA_F（5'-AGAAACGGCTACCACATC-3'），18S rRNA_R（5'-CCAAGGTCCAACTACGAG-3'）。 擴 增 條 件 為 ：94℃預(yù)變性30 s；94℃變性10 s，50.8℃退火15 s，72℃延伸15 s，45個循環(huán)，之后增加溶解曲線程序：95℃ 10 s，65℃ 60 s，97℃ 1 s，連續(xù)檢測信號。采用2-ΔΔCt方法進行基因差異表達分析。組織差異表達分析以葉片的表達量為基準，低溫差異表達分析以對照（CK）的表達量為基準。

2 結(jié)果

2.1 小桐子MYB基因家族全基因組成員鑒定及序列分析

自GenBank下載小桐子最新注釋蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，結(jié)合Pfam與CDD結(jié)構(gòu)域分析共鑒定到213個小桐子MYB基因家族成員，其中1R-MYB 86個、R2R3-MYB 122個、3R-MYB 4個、4R-MYB 1個，JcMYB-308基因?qū)儆赗2R3-MYB亞家族中的一員。同時，對小桐子MYB家族進行理化性質(zhì)分析表明：小桐子213個MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)序列長度分布在88-2 039 aa之間，等電點分布在4.49-10.33之間。聚類分析顯示小桐子MYB家族分為6個亞家族（圖1）。

2.2 小桐子JcMYB308基因片段cDNA的克隆

以小桐子低溫脅迫48 h的葉片提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板擴增JcMYB308基因片段。結(jié)果表明，擴增產(chǎn)物約713 bp，與預(yù)期設(shè)計引物結(jié)果一致（圖2-A）。將目的條帶切膠回收后與T/A克隆載體pEASY-T1連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)菌落PCR 鑒定陽性克隆（圖2-B），之后陽性克隆過夜培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒（圖2-C）。

2.3 小桐子JcMYB308基因的序列分析

利用BioEdit 軟件將克隆的小桐子 JcMYB308 基因的部分 cDNA序列翻譯成氨基酸序列（圖 3）。

圖1 通過ClustalX序列比對MEGA6.0鄰接法構(gòu)建的小桐子MYB基因家族進化樹

從GenBank下載其它植物的MYB308蛋白序列，通過ClustalX2.0序列比對，并利用MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹顯示，MYB308蛋白在N端序列保守性較高，分別鑒定到2個MYB結(jié)構(gòu)域，而中部與C端的序列一致性相對較小（圖4）。單子葉植物和雙子葉植物單獨聚類為兩個分支，而小桐子與同屬大戟科的蓖麻親緣關(guān)系最近，序列一致性為62.7%（圖5）。

為了分析小桐子JcMYB308基因的結(jié)構(gòu)特征，構(gòu)建了JcMYB308與其它物種MYB308基因內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)圖和系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，所有考察的植物MYB308基因都含有2個外顯子，且都包含5'和3'非編碼區(qū)（5'-UTR和3'-UTR）。其中，小桐子JcMYB308基因5'-UTR區(qū)域長度約為1 791 bp，與其它植物MYB308基因結(jié)構(gòu)差異較為顯著（圖6）。

2.4 小桐子JcMYB308基因的表達分析

據(jù)文獻報道，MYB類轉(zhuǎn)錄因子中包含與植物抗逆性相關(guān)的基因［21］。通過實時熒光定量PCR對小桐子JcMYB308基因進行組織差異與低溫脅迫表達分析。結(jié)果表明，JcMYB308基因在根、莖、葉器官中均有表達，但存在組織差異性。其中，在小桐子根中表達量較高；其次是莖，而在葉片中表達量相對較低（圖7-A）。另外，小桐子JcMYB308基因在葉片、莖及根中都屬于低溫誘導(dǎo)表達基因，在葉中，在低溫脅迫的0.5 h-12 h持續(xù)誘導(dǎo)高表達，并在低溫脅迫12 h達到最大表達量，較對照提高6.73倍（圖7-B），而在莖與根中，均在低溫脅迫24 h達到最大表達量，分別較對照提高18.17倍與10.93倍（圖7-C、D），說明JcMYB308基因與小桐子的抗冷性形成直接相關(guān)。

圖2 小桐子JcMYB308基因cDNA片段克隆

圖3 小桐子JcMYB308基因的部分cDNA及對應(yīng)的氨基酸序列

3 討論

MYB類轉(zhuǎn)錄因子家族特有的MYB結(jié)構(gòu)域是一段含有約51-53個氨基酸殘基的肽段，包含一系列高度保守的氨基酸殘基和間隔序列［22］。其廣泛分布于真核生物中，也是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一［23］。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，小桐子MYB基因家族包含213個成員，其中R2R3-MYB成員122個。目前Katiyar 等［24］報道水稻和擬南芥中分別包含155和197個MYB成員，其中發(fā)現(xiàn)水稻中含R2R3-MYB基因109個；Du等［25-27］在玉米和大豆中分別鑒定到157和244個R2R3-MYB成員；Willcins等［28］在楊樹中鑒定到192個R2R3-MYB成員；Li等［22］在黃瓜基因組中鑒定到55個R2R3-MYB基因。而本研究構(gòu)建進化樹分析顯示，胡楊、黃瓜與小桐子同屬雙子葉分支，表明它們的親緣關(guān)系、生物學(xué)功能比較近，但數(shù)據(jù)剖析結(jié)果與之相反，數(shù)量相差較大，反而與單子葉植物相接近。但一些研究者也發(fā)現(xiàn)，有些雙子葉植物與小桐子R2R3-MYB成員數(shù)量相差甚少，如Matus等［29］在葡萄中鑒定到108個R2R3-MYB成員；Katiyar［24］等于擬南芥中發(fā)現(xiàn)其有126個R2R3-MYB成員。因此，可以推知，MYB基因家族成員雖然分布在不同物種中，隨著親緣關(guān)系的近與遠其數(shù)量有一定的變化，但對于大多數(shù)單、雙子葉植物來說，它們的親緣關(guān)系出現(xiàn)交叉性。

MYB基因家族不僅參與植物的大部分生長發(fā)育過程［31］，還在植物體內(nèi)參與調(diào)控其生物的合成及信號傳導(dǎo)的過程，如調(diào)節(jié)花青素、類黃酮、木質(zhì)素的合成、毛狀體的分化、抗逆信號的傳導(dǎo)等［16-17］。在研究中我們發(fā)現(xiàn)，小桐子JcMYB308基因?qū)儆赗2R3-MYB亞家族中的一員。諸多文獻報道，R2R3-MYB亞家族所含轉(zhuǎn)錄因子與植物的多種非生物脅迫應(yīng)答如低溫密切相關(guān)。如Cominelli等和Seo等［32-33］研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥中AtMYB60和AtMYB96在ABA信號傳遞過程中起調(diào)控作用，具有調(diào)控氣孔導(dǎo)度、提

高植物抗旱和抗病能力的功能；其中AtMYB30、AtMYB60、AtMYB96及VvMYB60的共同特點是都參與抗逆信號的傳遞與調(diào)控過程；Ding等［34］報道了擬南芥基因AtMYB15的過量表達可以提高擬南芥對ABA的敏感性，并提高了植物的抗旱性。本研究通過基因結(jié)構(gòu)和進化分析顯示及qRT-PCR分析結(jié)果初步斷定JcMYB308基因可能參與小桐子抗冷性的形成過程，它在不同組織中均有表達，其中于葉中，在低溫脅迫0.5 h-12 h持續(xù)誘導(dǎo)高表達；還發(fā)現(xiàn)它的表達于某一時段或時刻高表達后又開始趨于下降，若作圖呈現(xiàn)鐘罩性。對此現(xiàn)象我們認為，小桐子生活于干熱河谷地區(qū)，由于缺乏對低溫的適應(yīng)能力，對其植株于12℃進行低溫處理，達到最大抗性的低溫訓(xùn)化時間后其體內(nèi)的生理生化活動依次減弱，所以表達量下降。此外，Agarwal等［21］在擬南芥中也發(fā)現(xiàn)AtMYB15參與抗寒基因的表達調(diào)控；Van等［35］研究表明與之聚類于同一亞家族的AtMYB72與植物誘導(dǎo)系統(tǒng)性抗性獲得有關(guān)。雖然本實驗研究的小桐子R2R3-MYB亞家族成員之一MYB308基因在其它物種中報道甚少，但基于以上研究充分證實，MYB

類轉(zhuǎn)錄因子家族與植物的耐脅迫性密切相關(guān)。就當前的研究而言，MYB基因家族雖作為一個大家族，數(shù)量甚多，但與植物抗冷性相關(guān)的基因僅有一小部分。本研究結(jié)果有助于更好地了解MYB轉(zhuǎn)錄因子在小桐子中對低溫響應(yīng)的作用。

圖4 植物MYB308氨基酸多序列比對

圖5 小桐子JcMYB308與其他物種MYB308轉(zhuǎn)錄因子的進化分析

圖6 植物MYB308的基因結(jié)構(gòu)分析

圖7 小桐子JcMYB308基因的表達模式分析

4 結(jié)論

本研究基于小桐子最新注釋全基因組數(shù)據(jù)庫，通過生物信息學(xué)鑒定得知小桐子全基因組共含213個MYB基因家族成員，聚類為6個亞家族，其中MYB308基因?qū)儆赗2R3-MYB亞家族成員。利用RTPCR成功克隆了小桐子JcMYB308基因，其克隆片段長度為713 bp，基因結(jié)構(gòu)具有較高的保守性，均含有兩個外顯子，進化樹顯示其與同屬大戟科的蓖麻親緣關(guān)系最近，序列一致性為62.7%。qRT-PCR表達分析表明，小桐子JcMYB308基因的表達存在組織表達特異性，在根中表達量較高，而在葉片中表達量相對較低，在根與莖中低溫脅迫24 h時達到最大表達量。

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