呂鵬 徐嘉擎 王森 閆艷春

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學院研究生院，北京 100081；2. 沈陽農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，沈陽 110866）

苯并異噻唑啉酮（1，2-benzisothiazolin-3-one，BIT）是一種人工合成的化合物，對細菌、真菌及藻類等均有優(yōu)良的抑制活性，解決了一系列由微生物和藻類等引起的化工產(chǎn)品變質(zhì)，船舶的海洋污損等問題［1-3］。因此BIT作為高效殺菌劑和防腐劑，已經(jīng)被廣泛應用于乳膠制品、涂料（乳膠漆）、聚氨制品、照相洗液、造紙、油墨、皮革、潤滑油等工業(yè)產(chǎn)品中［4-6］。工業(yè)生產(chǎn)中的BIT隨著工業(yè)廢水被大量排放到環(huán)境水體中，已有研究顯示，萊茵河中濃度1μL/L 的BIT溶液儲存在室溫（23℃）下，其半衰期約為7 d在4℃下其半衰期約為22 d［7］。BIT在環(huán)境條件下的半衰期比較短，但是大量排放也導致了其在水體中的殘留，有數(shù)據(jù)顯示，在污水廠排污口、部分河流以及沿海水體中均有檢出，其濃度為10-250 ng/L［7-9］。

隨著BIT的廣泛使用，其對環(huán)境和生物體的負面影響也慢慢浮現(xiàn)出來。近年來，很多報道顯示BIT能導致人皮膚過敏和炎癥效應［10-12］。然而，BIT的大量使用和排放導致其在水體中廣泛存在，BIT對水生生物生存的影響也不容忽視。因此，越來越多研究證實了BIT對水生生物的毒性，對大型蚤類的 LC50為 1.35 mg/L［13］，對虹鱒魚的 LC50為 1.60 mg/L［14］。同時，實驗證實BIT對黑斑蛙胚胎96 h的LC50和TC50分別為2.99 mg/L和0.60 mg/L，最小生長抑制濃度（Minimum concentration to inhibit growth，MCIG）小于0.40 mg/L；對蝌蚪的96 h LC50為6.44 mg/L［15］。目前關于BIT暴露魚類的毒性數(shù)據(jù)非常少，但考慮到BIT在水體中廣泛存在，因此其在水生態(tài)中的毒性，特別是對水生生物的危害值得進一步關注。

斑馬魚（Danio rerio）作為毒理學研究領域中最常用的模式動物，有體型小、產(chǎn)卵量大、遺傳背景清晰、胚胎發(fā)育迅速且早期透明、便于觀察等優(yōu)點［16］。斑馬魚胚胎也越來越廣泛用于急性毒性實驗中，評價環(huán)境污染物的急性毒性［17］。斑馬魚胚胎暴露于環(huán)境污染物時，其機體氧化與抗氧化之間的平衡被破壞，將導致胚胎體內(nèi)產(chǎn)生過多活性氧（Reactive oxygen species，ROS）自由基［18］，從而造成機體的氧化損傷。已知的機體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)分為酶促反應系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)，然而酶促反應系統(tǒng)中的抗氧化相關酶活性，如過氧化氫酶（Catalase，CAT），超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD），谷胱甘肽-S轉移酶（Glutathione S-transferase，GST），以及丙二醛（Malondialdehyde，MDA）和ROS含量都作為生物指標，用來衡量氧化損傷程度［19-20］。目前，對于BIT造成氧化損傷和毒理機制的研究尚不明確。

本研究以模式動物斑馬魚胚胎為受試材料，根 據(jù) zFET（Zebrafish embryo toxicity test） 和 基 于OECD（Organization for Economic Co-operation and Development）的指導［21］，進行斑馬魚胚胎急性毒性實驗。并通過氧化應激指標的檢測以及相關基因表達量的實時熒光定量（qPCR）分析，探索其對斑馬魚胚胎的毒性機理。以此評價BIT的環(huán)境毒性效應，為BIT使用和環(huán)境管控提供數(shù)據(jù)支持和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 實驗所用AB品系斑馬魚購自國家斑馬魚資源中心（China Zebrafish Resource Center，CZRC）。

1.1.2 試劑 苯并異噻唑啉酮（1，2-benzisothiazolin-3-one，BIT），純度99%，購自Sigma-Aldrich公司（CAS：2634-33-5，分子量151.2），分子式為C7H5NOS，為白色或淡黃色針狀晶體。

BIT暴露實驗處理液：將8 mg BIT溶于500 μL二甲基亞砜（DMSO）中，再用養(yǎng)魚水（除氯凈化，pH 7.0-7.5，電導率500-550 μs/cm）將其稀釋到1 L，制備8 mg/L的BIT儲液。根據(jù)預實驗結果，依次制備0、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0和8.0 mg/L的梯度暴露處理液，并以稀釋到0.05%的DMSO處理液作為0 mg/L對照組（預實驗表明，處理液中小于0.05%的DMSO不會對實驗結果產(chǎn)生影響）。

其他試劑：三卡因甲磺酸鹽麻醉劑（TMS，CAS：886-86-2，阿達瑪斯，中國）；甲醇（色譜純，F(xiàn)isher公司，美國），二甲亞砜（DMSO，CAS：67-68-5，索萊寶，中國）；氯化鈉，碳酸氫鈉等均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 儀器 斑馬魚養(yǎng)殖與繁育系統(tǒng)（北京愛生科技）；精密型PH試紙（美國Sigma）電導度測試儀（意大利哈納公司）；BPC-250F型生化培養(yǎng)箱（上海一恒）；熒光顯微鏡X83（日本奧林巴斯）；Agilent高效液相色譜分析儀（美國安捷倫）；Heal Force超純水系統(tǒng)（香港力康）；聚合酶鏈式擴增（PCR）儀（Bio-Rad），iQ7實時熒光定量（qPCR）儀（Bio-Rad）；一次性吸管和培養(yǎng)皿（江蘇康健華）；六孔細胞培養(yǎng)板（無錫NEST）。

1.2 方法

1.2.1 斑馬魚養(yǎng)殖 成年斑馬魚養(yǎng)殖于獨立的水循環(huán)系統(tǒng)中，系統(tǒng)含有凈化水和水質(zhì)自動控制系統(tǒng)，能保持系統(tǒng)中水的溫度為（28±0.5）℃，電導率為（500-550）μs/cm，pH為7.0-7.5，同時保持光周期為14 h（光）：10 h（暗）。根據(jù)斑馬魚生長狀態(tài)，每天喂食2-3次新鮮的豐年蟲幼蟲。

1.2.2 斑馬魚繁殖和胚胎收集 提前一個晚上將成年種魚按照雌雄比例2∶2裝入交配盒中，并用隔板將雌雄魚分開。第二天早上光周期開始后0.5 h將隔板抽出，待雌雄魚追尾交配0.5 h后收集胚胎，此時收集到的胚胎處于同一發(fā)育時期。將所有胚胎混合均勻，更換干凈的養(yǎng)魚水于培養(yǎng)皿中，受精3 h后（3 hours post-fertilization，3 hpf），選出存活且發(fā)育正常的胚胎，作為受試對象。

1.2.3 BIT工作液穩(wěn)定性檢測 采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）進行溶液穩(wěn)定性檢測，液相色譜條件，色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），流動相體積比（甲醇∶水=20∶80），流速為1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測波長為254 nm，進樣量2 μL。

BIT標準溶液制備：準確稱取10 mg的BIT溶于500 μL DMSO中，用超純水進行梯度稀釋，依次稀釋得到2、200和100 mg/L儲備溶液。再用100 mg/L的儲備液進行標準品準備，即稀釋到濃度為5、10、15、20、25 mg/L的標準溶液。對照組為0 mg/L，含0.05%的DMSO。

BIT標準溶液測定：取標準溶液1.2 mL于1.5 mL的離心管中，以12 000×g離心5 min，取1mL上清液，經(jīng)0.22 μm的濾膜過濾后加入液相色譜進樣瓶中。調(diào)好參數(shù)儀器，色譜工作站會自動輸出色譜曲線和色譜參數(shù)，輸出結果中色譜峰保留時間（t0）與峰面積（area）對應BIT標準溶液的濃度，由此繪制BIT溶液標準曲線。

BIT暴露溶液穩(wěn)定性檢測；使用液相色譜工作站，對配制好的BIT處理液進行檢測，得到的結果于標準曲線進行比對。對比后，配制處理液與標準溶液濃度差異不顯著的，進行后續(xù)暴露實驗。

1.2.4 BIT暴露實驗 將收集到的正常3 hpf的胚胎根據(jù)處理液濃度分成7組，每組設置3個平行。暴露處理在6孔板中進行，每個孔中加入10枚胚胎，每個處理包含60枚胚胎，并倒入10 mL處理液。采用半靜態(tài)暴露的方式進行處理，將培養(yǎng)皿置于恒溫生化培養(yǎng)箱中，暴露總時間為96 h（即從3-99 hpf），培養(yǎng)箱孵化度為（28±0.5）℃，處理液pH維持在7.0，電導率約510 μs/cm，溶氧量＞6 mg/L，胚胎處理過程中光∶暗=14∶10。每隔24 h更換2/3的處理液（吸出2/3，再加入2/3新鮮處理液），關注處理過程中處理液性質(zhì)，及時挑出死亡的胚胎，同時進行記錄。根據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)計算96-LC50。

1.2.5 胚胎發(fā)育形態(tài)學觀察 根據(jù)急性暴露試驗得到的96 h-LC50設立3個BIT 處理組，分別是0.75，1.50 和 3.0 mg/L（1/5 LC50、2/5 LC50、4/5 LC50），1組溶劑對照組0 mg/L。胚胎發(fā)育過程中每隔12 h取胚胎樣品進行無傷鏡檢，統(tǒng)計并拍照記錄畸形，發(fā)育不良的胚胎。處理48 h，統(tǒng)計胚胎孵化情況，計算48 h孵化率。處理96 h，統(tǒng)計胚胎畸形情況，計算96 h-TC50，并從處理組中挑選10個發(fā)育正常的胚胎（n=3），測量體長數(shù)據(jù)。

1.2.6 氧化應激分析 分別設置0，0.75、1.50和3.0 mg/L的BIT暴露組。暴露96 h后，每個處理組下選取胚胎20枚，每組3個平行。收集胚胎，液氮速凍，放于-80℃保存。

氧化應激指標檢測：GST測定試劑盒（比色法）、CAT測定試劑盒（可見光法）、MDA測定試劑盒（TBA法）、T-SOD測試盒（羥胺法）、ROS測定試劑盒（DCFH-DA法）、總蛋白（TP）測定試劑盒（帶標準品，考馬斯亮藍法）試劑盒均購自南京建成生物研究所。將收集到的樣品制備成5%的組織勻漿液，根據(jù)說明書進行CAT、GST、SOD酶活和TP、ROS、MDA含量檢測。

基因表達分析：總RNA提取采用TRIzol 試劑盒（TaKaRa）。在OD260nm下估算總RNA濃度，OD260/280和1.2%瓊脂糖凝膠電泳評估RNA質(zhì)量。使用反轉錄試劑盒，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）進行總RNA的cDNA制備，待檢測的目標基因引物由上海生工公司合成（表1），所有引物經(jīng)驗證后得到擴增效率在 90%-110%之間。QPCR 使用 SYBR Premix Ex Taq II 試劑盒（TaKaRa）。三步法QPCR 程序為：95℃ 10 min；95℃ 30s，60℃30 s，72℃ 20 s，共 34 個循環(huán) ；72℃ 5 min，。每組包含3個生物學重復和3個孔重復，基因表達的差異倍數(shù)通過2-ΔΔCt方法計算。1.2.7 統(tǒng)計分析 胚胎急性毒性實驗過程中，每隔24 h記錄胚胎死亡數(shù)，處理48 h后統(tǒng)計胚胎孵化率，處理96 h后統(tǒng)計胚胎存活率和畸形率，并在顯微鏡下觀察畸形狀況，測量正常胚胎96 h的體長數(shù)據(jù)，并分析胚胎運動，反應等行為學特征。數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用SPSS22，方差齊性通過Levene方法檢測，并進行單因素方差分析（one-way ANOVA），Tukey’s檢驗進行事后多重檢驗。P＜0.05表示差異顯著，P ＜0.01表示差異極顯著，數(shù)據(jù)表示方法均為平均值±標準誤（SE）。

表1 檢測基因及引物信息

2 結果

2.1 BIT標準曲線及處理液穩(wěn)定性

標準溶液濃度為0、5、10、15、20和25 mg/L，HPLC分析得到BIT的保留時間為3.72 min，峰面積（x），質(zhì)量濃度（y），得到其回歸方程：y = 42.081x- 24.124，R2=0.998，（圖1）所示。配制的處理液檢測結果與標準曲線對比后，差異不顯著（P＜0.05，單因素方差分析，Turkey’s事后多重檢驗）（表2）。

圖1 BIT水溶液標準曲線

表2 不同處理組BIT工作液濃度分析

2.2 斑馬魚胚胎急性暴露

對斑馬魚胚胎進行BIT暴露處理48 h（51 hpf）后，發(fā)現(xiàn)BIT對斑馬魚毒性效應符合劑量-效應曲線。胚胎孵化率在所有處理組中都顯著降低了（圖2-A），統(tǒng)計48 h存活率高于50%的處理組（1.0、2.0、3.0和4.0 mg/L），其中1.0 mg/L 和2.0 mg處理組顯著降低，分別為38%和24%（P＜0.05）。3.0 mg/L和4.0 mg/L處理組極顯著降低，分別為17%和9%（P＜0.01）。對照組胚胎的死亡率低于1%，表明胚胎質(zhì)量較高，得到的數(shù)據(jù)經(jīng)logistic非線性擬合后，得到擬合曲線（圖2-B），R2=0.987 8，計算得到BIT對斑馬魚胚胎96h-LC50為3.65 mg/L。安全濃度采用通用算法：96h-LC50×0.01=0.03 mg/L。

圖2 BIT暴露對胚胎孵化率（A）和存活率（B）的影響

2.3 BIT致畸效應及形態(tài)學觀察

根據(jù)急性毒性實驗結果，將斑馬魚胚胎暴露于0、0.75、1.5和3.0 mg/L的BIT處理液中。與對照組相比，暴露組中胚胎畸形率顯著提高（P＜0.05，單因素方差分析，Turkey’s事后多重檢驗），正常發(fā)育的胚胎（圖3-A），體軸彎曲（圖3-B），心包囊腫和卵黃囊腫（圖3-C），尾部畸形（圖3-D）所示。根據(jù)所得到的畸形率數(shù)據(jù)，進行了logistic擬合，計算得到96 h-TC50為1.31 mg/L。同時，測量了96 h斑馬魚的體長數(shù)據(jù)（表3）所示，結果顯示BIT對斑馬魚胚胎的發(fā)育具有抑制作用，0.75 mg/L濃度下胚胎體長顯著下降，1.5 mg/L和3.0 mg/L濃度下胚胎體長極顯著降低（單因素方差分析，Turkey’s事后多重檢驗）。

2.4 BIT氧化應激效應

BIT處理到96h后，和對照組相比SOD的酶活在處理組1.5 mg/L和3.0 mg/L中都顯著下降了（* P＜0.05，**P＜0.01，Turkey’s）（ 圖 4-A）。CAT 酶 活隨著BIT處理濃度增加而顯著下調(diào)，3.0 mg/L處理組中極顯著下調(diào)（圖4-B）。GST酶活在處理組1.5 mg/L和3.0 mg/L中都顯著上調(diào)（圖4-C）。MDA含量則顯著升高了，且在1.5 mg/L和3.0 mg/L處理組中極顯著升高（圖4-D）。經(jīng)BIT暴露后，ROS在斑馬魚體內(nèi)的含量呈現(xiàn)遞增趨勢，和對照組相比，在0.75 mg/L和1.5 mg/L處理組中顯著增加到122.8%和144.2%，在3.0 mg/L處理組中極顯著增加到172.3%（圖4-E）。

2.5 氧化應激相關基因表達分析

BIT暴露后，斑馬魚胚胎體內(nèi)的抗氧化相關基因的表達量受到了干擾。和對照組相比，CAT基因的表達量在0.75 mg/L處理組中顯著上調(diào)到2.56倍，在1.5 mg/L和3.0 mg/L處理組中極顯著上調(diào)到3.83和4.21（圖5-A）。GSTP2的表達水平也在1.5 mg/L處理組中顯著上調(diào)到2.65，3.0 mg/L處理組中極顯著上調(diào)到3.22（圖5-B）。COX1的表達量在0.75 mg/L和1.5 mg/L處理組中顯著上調(diào)到1.45和1.72，在3.0 mg/L處理組中極顯著上調(diào)到2.21（圖5-C）。UCP2基因的表達量在1.5 mg/L處理組中顯著上調(diào)到3.48，在3.0 mg/L處理組中極顯著上調(diào)到5.36（圖5-D）。NQO1的表達量在1.5 mg/L和3.0 mg/L處理組中顯著下調(diào)到0.64和0.51倍（圖5-E）。Mn-SOD的表達量在1.5 mg/L和3.0 mg/L處理組中顯著下調(diào)到了0.74和0.68（圖5-F）。

圖3 BIT致畸效應分析、鏡檢和數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

表3 苯并異噻唑啉酮（BIT）對96 h斑馬魚胚胎體長的影響

抗細胞凋亡基因BCL2和促細胞凋亡基因BAX相互拮抗，在調(diào)節(jié)細胞凋亡中起著重要作用。BIT暴露處理后，BCL2基因表達量在1.5 mg/L處理組中顯著下調(diào)到0.78，在3.0 mg/L處理組中極顯著下調(diào)到0.68（圖5-G）。BAX基因表達量在0.75 mg/L處理組中顯著上調(diào)到1.25，在1.5 mg/L和3.0 mg/L處理組中極顯著上調(diào)到1.64和1.76（圖5-H）。

3 討論

工業(yè)防腐劑在日常生產(chǎn)和生活中使用量巨大，特別是近年來新興的異噻唑啉酮類化合物及其衍生物，苯并異噻唑啉酮（BIT）正是其中一種廣泛使用的防腐劑。隨著這類化合物越來越多的導致過敏反應和疾病，使人們開始關注其危害。本研究主要關注其對水生生物的毒性作用，通過對斑馬魚胚胎的急性暴露實驗，分析BIT的毒性和毒理機制。

在本研究中，首先對BIT水溶液和處理液的穩(wěn)定性進行了評估。HPLC的結果顯示，每次暴露實驗處理液的濃度沒有顯著的差異，且濃度保持恒定，說明在整個斑馬魚胚胎暴露實驗過程中，處理液性質(zhì)是穩(wěn)定的。而且使用DMSO作為助溶劑，在其濃度保持在0.05%以下，對實驗結果無顯著影響。有報道顯示，助溶劑如甲醇，乙醇，DMSO等含量低于0.1%時，其對實驗結果不會產(chǎn)生顯著影響［22-23］。

急性暴露實驗采用梯度濃度的BIT對3 hpf的斑馬魚胚胎進行處理，96 h的暴露周期內(nèi)，持續(xù)對胚胎死亡數(shù)和發(fā)育狀況進行統(tǒng)計分析。研究發(fā)現(xiàn)，BIT對斑馬胚胎孵化具有強烈抑制作用，當濃度≥1.0 mg/L時，就能顯著抑制胚胎孵化，而且不能在暴露72 h前順利孵化的胚胎全部死亡。與具有環(huán)境雌激素效應能促進胚胎孵化的污染物如乙二醇等不同［24］，BIT表現(xiàn)出強烈孵化抑制，同時阻礙胚胎正常發(fā)育。致死率擬合曲線表現(xiàn)出明顯的劑量-效應曲線關系，同時得到BIT對斑馬魚胚胎的96 h-LC50為3.65 mg/L，根據(jù)《全球化學品統(tǒng)一分類和標簽制度》（Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals，GHS）以及“危險化學品魚類急性毒性分級試驗方法”，判定BIT具有高毒［25］。

圖4 氧化應激指標生化檢測

根據(jù)BIT對斑馬魚胚胎的96 h半致死濃度，設計了3個濃度梯度（1/5LC50、2/5LC50和4/5LC50，即0.75、1.5和3.0 mg/L）用于發(fā)育毒性和生理生化指標檢測。結果表明，與對照組相比，暴露組胚胎畸形率隨BIT濃度增加，呈現(xiàn)出升高趨勢。在所有的畸形中，體軸彎曲和尾部畸形是主要形式。導致體軸畸形的主要原因可能是，細胞增殖出現(xiàn)異常［26］，而且在最近的研究中發(fā)現(xiàn)col8a1a和stat1a基因表達受到干擾，將導致斑馬魚脊椎出現(xiàn)畸形發(fā)育［27-28］，BIT可能干擾了此類基因的表達。經(jīng)統(tǒng)計擬合分析未成功孵化、畸形和發(fā)育不良的胚胎后，得到了96 h-TC50為1.31 mg/L。同時，測量BIT暴露96 h后斑馬魚胚胎體長數(shù)據(jù)，體長顯著變短說明BIT對斑馬魚胚胎生長具有很強的抑制作用，能抑制體軸縱向發(fā)育，這種抑制效應可能與葉酸代謝受到影響有關［29-30］。

斑馬魚胚胎在不同濃度BIT暴露96 h后，通過檢測抗氧化生理指標以及相關酶編碼基因的表達來研究BIT對斑馬魚胚胎氧化應激的影響。ROS在機體內(nèi)一般處于穩(wěn)定的動態(tài)平衡中，同時有傳導信號的功能，機體在面臨氧化應激過程中，會產(chǎn)生過多的ROS從而導致機體的氧化損傷［31］。BIT誘導了ROS的產(chǎn)生，說明其造成了斑馬魚體內(nèi)的氧化壓力?？寡趸谝坏婪较蛴蒘OD和CAT共同組成，Mn-sod是編碼SOD的重要基因之一，可以衡量SOD的表達量，主要功能是清除O2-生成 H2O2和O2［32］。CAT能夠?qū)2O2分解成O2和H2O，編碼基因是cat［33］。在本研究中，兩種酶活性呈現(xiàn)了不同程度的下調(diào)，表明第一道抗氧化防線受到了抑制，過量的ROS抑制了這兩種酶的活性。GST可以催化親核性的谷胱甘肽GS（H）與各種親電子外源化學物的結合反應，是一類具有II相解毒酶和抗氧化酶的雙重功能的抗氧化酶，其編碼基因為gstp-2。許多外源化學物在生物轉化第一相反應中極易形成某些生物活性中間產(chǎn)物，它們可與細胞生物大分子重要成分發(fā)生共價結合，對機體造成損害。谷胱甘肽與其結合后，可防止發(fā)生此種共價結合，起到解毒作用［34］。BIT能夠顯著提高GST活力，表明BIT能誘導胚胎產(chǎn)生解毒反應，同時說明機體內(nèi)產(chǎn)生了過量的氧化代謝有害物。但是，當BIT濃度達到3.0 mg/L時，GST活力增量變小了，可能是在此濃度下，產(chǎn)生過量的ROS對GST的解毒能力產(chǎn)生了抑制效應。過量的ROS還能引起脂質(zhì)過氧化反應，MDA是膜脂過氧化反應后的重要產(chǎn)物之一，它能間接反映機體細胞受自由基攻擊的程度［35］。BIT處理后的胚胎中MDA含量都顯著高于對照組，并隨濃度呈現(xiàn)劑量-效應關系，此現(xiàn)象表明BIT誘導機體產(chǎn)生的ROS引起了脂質(zhì)過氧化，隨后可能引起細胞凋亡。

圖5 氧化應激效應相關基因表達量

為了進一步闡述BIT導致斑馬魚胚胎氧化應激的機理和毒理效應，本研究通過qPCR檢測了相關基因的表達量。結果表明，高濃度的BIT暴露96h后能夠下調(diào)Mn-sod的表達量，這說明高濃度BIT導致過量的ROS產(chǎn)生，同時抑制了該基因的表達。過氧化氫酶編碼基因cat在BIT脅迫下顯著上調(diào)，表明機體在BIT脅迫下代謝產(chǎn)生的過量H2O2能誘導cat的表達。gstp-2的表達顯著上調(diào)了，這說明高濃度BIT的暴露導致機體產(chǎn)生了氧化應激反應，產(chǎn)生了很多氧化應激代謝副產(chǎn)物，gstp-2基因表達上調(diào)以此產(chǎn)生更多的GST作用于解毒過程。

細胞色素c氧化酶亞基I的編碼基因是cox-1，是線粒體內(nèi)呼吸鏈電子傳遞的終末復合物，也是線粒體氧化能力的關鍵調(diào)節(jié)物［36］。解偶聯(lián)蛋白2的編碼基因是ucp-2，可以讓氧化磷酸化過程解偶聯(lián)，從而減少ATP的合成［37］。細胞色素c氧化酶和解偶聯(lián)蛋白2編碼基因的上調(diào)，說明了BIT暴露下可以促進呼吸鏈的活性，同時能夠提高ROS產(chǎn)生，過量的ROS可能導致細胞的凋亡［31，34］?；騯cp-2表達的上調(diào)，能促進氧化磷酸化過程，以此抵抗BIT造成氧化損傷。NAD（P）H脫氫酶1的編碼基因是nqo-1，是一種位于線粒體內(nèi)膜催化電子從NADH傳遞給輔酶Q的酶［38］。在BIT暴露實驗中，nqo-1基因表達量顯著下調(diào)了，表明機體產(chǎn)生的過量ROS對nqo-1的表達具有抑制作用。總的來說，BIT暴露后的斑馬魚胚胎，其體內(nèi)呼吸鏈的活性增強，但是呼吸鏈中產(chǎn)生的過量ROS反作用于相關基因，導致基因表達量受到干擾，在高濃度BIT暴露下，最終導致不能承受氧化損傷，從而引起細胞凋亡等一系列機體功能性障礙。

細胞凋亡調(diào)控基因bcl-2編碼抗凋亡調(diào)控因子BCL2，而bax基因編碼促凋亡因子BCL2偶聯(lián)蛋白X，兩種基因相互作用，維持著體內(nèi)細胞凋亡的平衡［39］。BIT暴露后的胚胎，其體內(nèi)bcl-2表達量顯著下調(diào)，bax顯著上調(diào)，表明機體調(diào)節(jié)細胞凋亡的動態(tài)平衡向著促凋亡方向移動了。細胞凋亡的平衡被打破，但是正常的細胞凋亡程序可以清除體內(nèi)受損或完成了作用的細胞，是機體的一種自我保護措施［40］。

4 結論

本研究表明，BIT對斑馬魚胚胎為高毒性，并造成氧化損傷。其中，CAT、SOD、GST和MDA，以及相關基因都可作為氧化損傷檢測的有效生物指標。MDA 和ROS含量在一定的程度上相互補充，BIT暴露下，它們在斑馬魚胚胎中含量表現(xiàn)出明顯的劑量-效應關系。BIT破壞機體內(nèi)ROS 的平衡，使機體受到嚴重損害。細胞凋亡相關基因（bcl-2 和bax）表達受到干擾，說明斑馬魚胚胎暴露于BIT，其引起了細胞凋亡，最終引起胚胎死亡。但是，其中一些生物指標在低濃度BIT暴露下表現(xiàn)出了不一致性，這可能與機體自我調(diào)節(jié)和卵膜保護有關。BIT暴露下對斑馬魚和其他水生生物的毒害作用不容忽視，同時需要進一步研究其長期暴露下的生態(tài)風險

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