*

1.遵義醫(yī)藥高等?？茖W校，貴州 遵義 563006；2.成都中醫(yī)藥大學，四川 成都 610075

順鉑(Cisplatin，DDP)是目前臨床上廣泛應用于多種實體瘤的一線鉑類抗腫瘤藥物[1]。但隨著順鉑劑量的增加，毒副作用亦增高，特別是腎毒性成為順鉑的劑量限制性[2]。因此，保留順鉑的抗癌作用，降低其腎毒性，是保證化療效果的重要環(huán)節(jié)，也是多年來藥理學、毒理學和臨床治療學等關(guān)注的熱點。濟生腎氣丸原方出自南宋著名醫(yī)家嚴用和的《濟生方》[3]，由熟地、附子、肉桂、澤瀉、茯苓等10味中藥組成，有溫補腎陽、化氣利水、消腫止渴、納氣固本的功用。千百年來，該方在臨床上多用于治療由腎陽虛所致的多種疾病，如腰痛腳腫、小便不利、痰飲喘咳等。本課題組在前期研究工作基礎上[4]，根據(jù)中醫(yī)對順鉑腎損傷的認識，結(jié)合現(xiàn)代研究，提出益腎健脾，通絡散瘀治療順鉑腎損傷，最后擬定濟生腎氣丸加味組方。筆者研究用順鉑經(jīng)腹腔注射制作大鼠急性腎損傷模型，通過觀察大鼠腎臟系數(shù)、血清尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、腎組織腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)等指標的變化，從氧化應激、炎癥反應等方面探討濟生腎氣丸加味對順鉑所致大鼠急性腎損傷的治療作用及其機理，為臨床用藥和進一步篩選有效方藥提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SPF級Wistar大鼠60只，雄性，8周齡，體重200～220 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[動物許可證號：SCXK(京)2016-0011]提供。

1.1.2 藥品與試劑 順鉑(齊魯制藥有限公司，批號：307026CF)；硫代硫酸鈉(上海新亞藥業(yè)有限公司，批號：H31020534)；濟生腎氣丸加味由熟地、附子、肉桂、黃芪、當歸、丹參、三七、牛膝、車前子等組成，藥物飲片購自北京同仁堂藥店。參照傳統(tǒng)水煎煮工藝，加工成煎劑，濃縮至相當于含生藥4 g·mL-1，每次煎煮大鼠3 d的給藥量，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；BUN試劑盒(批號：20170316)，Cr試劑盒(批號：20170311)，SOD試劑盒(批號：20170409)，MDA劑盒(批號：20170415)，購自南京建成生物工程研究所；大鼠TNF-α酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(批號：1704121)，大鼠TGF-β1酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(批號：1704121)，均為上海西唐生物科技有限公司進口分裝產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 酶標儀(DENLEY DRAGON Wellscan MK3型，美國Thermo公司)；洗板機(Wellwash 4 MK2型，美國Thermo公司)；紫外可見分光光度計(Cary50型，上?？茖W儀器有限公司)；石蠟切片機(RM2235型，徠卡顯微系統(tǒng)有限公司)；恒溫烘箱(DHG-9023A型，上海恒一科學儀器有限公司)；離心機(L535-1型，湘儀離心機儀器有限公司)；正置顯微鏡(CX41型，日本Olympus公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及處理 適應性喂養(yǎng)1周后，將60只Wistar大鼠隨機分為以下6組：正常對照組(Ⅰ組)、模型對照組(Ⅱ組)、陽性對照組(Ⅲ組)、濟生腎氣丸加味低劑量治療組(Ⅳ組)、濟生腎氣丸加味中劑量治療組(Ⅴ組)、濟生腎氣丸加味高劑量治療組(Ⅵ組)。根據(jù)文獻報道[5]，結(jié)合課題組前期工作以及預實驗，建立大鼠急性腎損傷模型。于實驗第1天給模型對照組、陽性對照組、濟生腎氣丸加味低、中、高劑量治療組大鼠一次性腹腔注射7 mg·kg-1順鉑造模，正常對照組腹腔注射同容積的生理鹽水。腹腔注射順鉑后，濟生腎氣丸加味低、中、高劑量治療組大鼠分別給予濟生腎氣丸加味水煎液10、20、40 g·kg-1灌胃，陽性對照組大鼠給予5%硫代硫酸鈉(STS)70 mg·kg-1肌內(nèi)注射，正常對照組、模型對照組給予同容積的生理鹽水灌胃，1次/d。連續(xù)14 d。

1.2.2 取材 于實驗第15天，將各組大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，3500 r·min-1離心15 min，吸出血清，-20 ℃低溫冰箱保存待測；采血后即刻摘取大鼠雙側(cè)腎臟，將左側(cè)腎臟從腎門處縱切成兩瓣，用10%中性甲醛溶液固定待測；取大鼠右側(cè)腎臟組織0.2 g，加入PBS緩沖液，按照1∶9比例進行勻漿，3500 r·min-1離心15 min后吸出上清液，4 ℃冰箱保存待測。

1.2.3 指標的測定

1.2.3.1 一般狀態(tài)觀察 根據(jù)當前中醫(yī)證候模型規(guī)范化研制成果[6]以及大鼠的生物學特性，主要觀察并記錄大鼠精神狀態(tài)、活動情況、皮毛光澤度、攝食量、體質(zhì)量、舌象、大小便等。

1.2.3.2 腎臟系數(shù)的測定 在麻醉狀態(tài)下處死大鼠，取出雙側(cè)腎臟，剔除被膜及結(jié)締組織后稱重，并計算腎臟系數(shù)。腎臟系數(shù)(%)= 雙側(cè)腎臟重(g)/體質(zhì)量(g)× 100%。

1.2.3.3 血清指標的測定 BUN測定采用二乙酰一肟法，Cr測定采用苦味酸法，SOD測定采用黃嘌呤氧化酶法，MDA測定采用硫代巴比妥酸法，按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.3.4 腎組織中TNF-α、TGF-β1含量的測定 采用酶聯(lián)免疫吸附測定法，具體步驟按照試劑盒說明書進行。

1.2.3.5 腎組織病理學觀察 取出已固定標本修塊，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，HE染色，于光學顯微鏡下觀察大鼠腎小球、腎小管、基底膜等的病理形態(tài)學變化。

2 結(jié)果

2.1 對一般狀態(tài)的影響 正常對照組大鼠精神狀態(tài)良好，活動自如，皮毛白亮、光澤度好，攝食、飲水量正常，體質(zhì)量增長平穩(wěn)，舌質(zhì)淡紅，苔薄白。模型對照組大鼠精神萎靡，弓背蜷縮，喜扎堆，皮毛雜亂枯槁，攝食、飲水量減少，體質(zhì)量逐漸減輕，大便稀軟，小便清長，爪甲輕度紫紺，舌質(zhì)淡嫩，舌面水滑。濟生腎氣丸加味各劑量治療組大鼠的精神狀態(tài)、活動情況、皮毛光澤度等優(yōu)于模型對照組。

2.2 對腎臟系數(shù)的影響 各組大鼠經(jīng)腹腔注射順鉑后，腎臟系數(shù)明顯升高，與正常對照組比較，除濟生腎氣丸加味中劑量治療組外，均有顯著或極顯著統(tǒng)計學差異(P<0.05，P<0.01)，提示順鉑造成了大鼠的腎臟損傷；而與模型對照組比較，濟生腎氣丸加味各劑量治療組的腎臟系數(shù)均極顯著降低(P<0.01)，提示聯(lián)用濟生腎氣丸加味水煎液，對順鉑所致的大鼠腎損傷有治療作用。如圖1所示。

2.3 對血清BUN、Cr、SOD、MDA含量的影響 造模14 d后，與正常對照組比較，模型對照組大鼠血清BUN、Cr、MDA含量升高，血清SOD含量下降，有極顯著性統(tǒng)計學差異(P<0.01)，表明順鉑誘發(fā)了大鼠氧化性損傷，并成功建立了大鼠急性腎損傷模型；而與模型對照組比較，濟生腎氣丸加味各劑量治療組的血清BUN、Cr、MDA含量下降，血清SOD含量升高，有極顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01)，表明低、中、高劑量濟生腎氣丸加味水煎液可提高防御氧自由基損傷的能力，改善大鼠腎功能損害情況。見表1。

表1 各組大鼠血清BUN、Cr、SOD和MDA含量比較

注：與正常對照組(Ⅰ組)比較，#P﹤0.05，##P﹤0.01；與模型對照組(Ⅱ組)比較，▲P﹤0.05，▲▲P﹤0.01；與陽性對照組(Ⅲ組)比較，△P﹤0.05，△△P﹤0.01；與濟生腎氣丸加味低劑量治療組(Ⅳ組)比較，*P﹤0.05，**P﹤0.01。

2.4 對腎組織中TNF-α、TGF-β1含量的影響 模型對照組大鼠腎組織中TNF-α、TGF-β1含量上升，與正常對照組比較，有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01)；濟生腎氣丸加味各劑量治療組的TNF-α、TGF-β1含量低于模型對照組，均有顯著或極顯著統(tǒng)計學差異(P<0.05，P<0.01)。見表2。

組別TNF-α/pg·mL-1TGF-β1/pg·mL-1Ⅰ組1283±6131485±1025Ⅱ組3940±1370##3621±1478##Ⅲ組2324±742#▲▲2304±1001▲Ⅳ組2708±1362##▲▲2322±1399▲Ⅴ組2063±859▲▲2290±1364▲Ⅵ組1659±795▲▲?2106±968▲▲

注：與正常對照組(Ⅰ組)比較，#P﹤0.05，##P﹤0.01；與模型對照組(Ⅱ組)比較，▲P﹤0.05，▲▲P﹤0.01。

2.5 對腎臟組織病理學的影響 光學顯微鏡下觀察，正常對照組大鼠腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)清楚、正常，腎間質(zhì)及腎小球無充血和炎細胞浸潤；模型對照組大鼠腎小球囊腔增大，腎臟皮髓交界處呈現(xiàn)程度不等的腎小管擴張，腎小管上皮細胞變性、壞死脫落，腎小管基底膜裸露，腎小管腔內(nèi)有大量紅染物質(zhì)，出現(xiàn)蛋白管型；濟生腎氣丸加味各劑量治療組大鼠腎小球、腎小管、腎間質(zhì)等病變，與模型對照組相比有明顯不同程度好轉(zhuǎn)。如圖2所示。

3 討論

順鉑所致腎損傷的發(fā)生機制是一個復雜的過程，包括細胞毒性、氧化應激損傷、炎癥反應、細胞凋亡等多個方面[7]。血清BUN和Cr濃度可反映腎小球的濾過功能，腎臟系數(shù)變化可反映毒物對腎臟的綜合毒性作用，故本研究以血清BUN、Cr和腎臟系數(shù)作為判斷大鼠腎臟損傷程度的標志[8]。順鉑進入細胞后，一方面，產(chǎn)生大量自由基，造成線粒體氧化損傷，功能喪失；另一方面，通過直接或間接與谷胱甘肽(GSH)結(jié)合而引起細胞內(nèi)GSH耗竭，同時還可抑制谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、SOD等的活力，使細胞內(nèi)抗氧化能力減弱而引發(fā)氧化應激[9]。SOD是體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)，可保護細胞不受氧自由基的損傷；MDA既是脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物，又是繼發(fā)損害的毒性產(chǎn)物，這兩項指標的測定，可以反映氧化應激損傷的輕重程度。有研究表明，TNF-α在順鉑所致腎損傷中起到非常重要的作用，不僅參與炎癥反應，還介導細胞凋亡；順鉑還可引起腎組織細胞纖維化，這也是其引起腎損傷的原因之一[10]。因此，本實驗選用炎性細胞因子TNF-α和目前公認的最強致纖維化因子TGF-β1[11]，來判斷大鼠腎臟炎癥反應輕重和腎間質(zhì)纖維化程度。

順鉑所致腎損傷，根據(jù)其臨床表現(xiàn)，屬中醫(yī)“藥毒”、“腎虛”、“水腫”等范疇。藥毒留滯機體，損傷脾腎，水液輸布障礙，清陽不升，濁陰不降，久則氣血逆亂，脈絡瘀阻。針對此病機，課題組選用濟生腎氣丸加味組方，以解化療藥順鉑所致的腎損傷。方中熟地滋補腎陰、填精益髓，加附子、肉桂之辛熱，助命門之火以溫陽化氣，乃“陰中求陽”之治[12]；黃芪、白術(shù)益氣健脾，促進脾胃運化和氣機升降恢復；山茱萸、山藥補脾腎而益精血；茯苓、澤瀉、車前子利水滲濕泄?jié)幔划敋w、丹參、三七、丹皮、川牛膝養(yǎng)血活血、通經(jīng)散瘀。諸藥相合，溫而不燥，滋而不膩，助陽之弱以化水，滋陰之虛以生氣，共奏益腎健脾、通絡散瘀之效。

實驗結(jié)果顯示，1次性腹腔注射7 mg·kg-1順鉑的方法，成功建立了大鼠腎損傷動物模型。濟生腎氣丸加味能降低順鉑所致腎損傷模型大鼠的血清BUN、Cr、MDA水平，下調(diào)腎臟系數(shù)及腎組織中TNF-α、TGF-β1含量，提高血清SOD活力，改善腎臟組織病理學變化，且高劑量濟生腎氣丸加味治療組效果尤佳，說明濟生腎氣丸加味水煎液可有效保護順鉑引起的腎損傷，其作用機制可能與濟生腎氣丸加味具有抗氧化作用，下調(diào)炎癥細胞因子表達，減輕炎癥反應，阻止巨噬細胞浸潤到腎間質(zhì)區(qū)，延緩間葉細胞轉(zhuǎn)變和成纖維細胞發(fā)生纖維化。

綜上所述，濟生腎氣丸加味可用于治療順鉑所致的腎損傷，但有關(guān)該方的保護作用機理及臨床應用還有待于進一步研究探討。

[1]周金玲,楊玉芳,黃振光,等.三七總皂苷通過HIF-1α/BNIP3途徑增強線粒體自噬保護大鼠順鉑腎損傷[J].中國藥學雜志,2017,52(3):196-200.

[2]丁斗,董小君,王敏,等.尿β2-微球蛋白在順鉑所致腎毒性中的早期監(jiān)控[J].甘肅中醫(yī)學院學報,2013,30(2):5-7.

[3]李經(jīng)緯,余瀛鰲,蔡景峰,等.中醫(yī)大詞典[M].2版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2006:1335.

[4]錢寧,董小君,郭科男,等.護腎Ⅰ號對順鉑致貴州小型豬腎損傷的預防作用及機制探討[J].山東醫(yī)藥,2008,48(24):33-34.

[5]趙華葉,戚姝婭,李朝峰,等.艾迪注射液對順鉑所致大鼠腎毒性的保護作用研究[J].中國藥學雜志,2016,51(22):1947-1952.

[6]秦川.實驗動物學[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2010:234-240.

[7]張啟龍,聶克.順鉑致腎損傷中炎癥介質(zhì)作用機制的研究進展[J].山東醫(yī)藥,2016,56(11):90-92.

[8]連燕娜,高麗萍.益氣補腎方藥對順鉑致大鼠腎毒性及順鉑抗腫瘤活性的影響[J].中國臨床藥理學與治療學,2016,21(1):50-54.

[9]李貞,高麗萍.氧化應激在順鉑腎毒性中的作用[J].廣東醫(yī)學,2010,31(19):2600-2602．

[10]楊桂染,劉娜,胡艷華,等.加味黃連阿膠湯對順鉑腎毒性大鼠腎組織Ⅲ型膠原表達的影響[J].中醫(yī)藥導報,2013,19(9):13-15．

[11]董小君,丁斗,劉厚穎,等.加味苓桂術(shù)甘湯對腎纖維化大鼠腎組織TGF-β1表達的影響[J].中國民族民間醫(yī)藥,2016,25(12):53-54.

[12]李美珍,董小君,袁曉紅.方劑學[M].北京:科學技術(shù)文獻出版社,2015:130-131.