1.復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院門診草藥房，上海 200090；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院閔行分院，上海 200241

洋川芎內(nèi)酯I是傘形科植物川芎LigusticumChuanxiongHort.的主要活性成分之一[1]。藥理研究表明，洋川芎內(nèi)酯I能夠透過血腦屏障對腦部疾病尤其是偏頭痛發(fā)揮一定的治療作用[2-3]。藥動學(xué)表明，洋川芎內(nèi)酯I經(jīng)口服給藥后，能被快速吸收進入血液循環(huán)，并不同程度地分布到各組織中[4]。

藥物在體內(nèi)轉(zhuǎn)運、轉(zhuǎn)化過程中，可與組織蛋白(包括受體)和體液蛋白相結(jié)合，因此在組織和體液中除含有游離的藥物外，還含有結(jié)合的藥物。藥物與血漿蛋白的結(jié)合與藥物的體內(nèi)過程密切相關(guān)。如藥物與血漿蛋白呈濃度依賴性結(jié)合時引起非線性藥代動力學(xué)。與藥物相結(jié)合的血漿蛋白主要是白蛋白、α1-酸性糖蛋白和脂蛋白[5]。白蛋白主要與有機酸類藥物結(jié)合，α1-酸性糖蛋白主要與有機堿類藥物結(jié)合。由于血漿蛋白中白蛋白含量最高，故有時單獨研究其與藥物的結(jié)合情況。因此，藥物與血漿蛋白的結(jié)合率是藥代動力學(xué)研究的重要參數(shù)，它對藥物的組織分布、生物轉(zhuǎn)化、代謝等均產(chǎn)生重要影響，是新藥臨床評價不可缺少的指標，尤其對毒性藥物的臨床應(yīng)用具有極其重要的指導(dǎo)意義。實驗采用快速平衡透析裝置結(jié)合液相質(zhì)譜聯(lián)用分析方法測定洋川芎內(nèi)酯I與大鼠和人血漿蛋白結(jié)合率，為進一步臨床研究提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 儀器 Thermo Dionex Ultimate 3000 高效液相色譜儀(美國Thermo Fisher公司)；Thermo TSQ Vantage三重四級串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher公司)；XS205型電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；DKZ-1型電子恒溫孵育箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；Thermo Scientific平衡透析系統(tǒng)(美國Thermo Fisher公司)；Vortex-Genie 2型渦旋儀(美國MoBio公司)；Millipore Elix 5純水儀(密理博中國有限公司)。

1.2 材料 洋川芎內(nèi)酯I(純度>98%，成都德銳生物科技有限公司)；甲苯磺丁脲(純度>98%，中國食品藥品檢定研究院)；紫杉醇(純度>98%，中國食品藥品檢定研究院)；大鼠血漿(由單位藥理實驗室提供，所用抗凝劑為EDTA-K2)；甲醇、乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純；水為Millipore Elix 5純水儀純化水。

1.3 標準品溶液的配制 精密稱取洋川芎內(nèi)酯I對照品適量，用DMSO配成濃度為40 mM的儲備液，移取儲備液適量用DMSO稀釋成400 μM、2000 μM的工作液，備用。精密稱取紫杉醇對照品適量，用DMSO配成濃度為40 mM的儲備液，移取儲備液適量用DMSO稀釋成400 μM的工作液，備用。

1.4 內(nèi)標溶液的配制 精密稱取甲苯磺丁脲對照品適量，用DMSO配成濃度為10 mM的儲備液，移取儲備液適量用乙腈稀釋成1μM的工作液，備用。

1.5 分析條件 紫杉醇的分析方法與文獻報道一致[6]。洋川芎內(nèi)酯I分析方法如下：色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱 (50 × 2.1 mm i.d., 1.7 μm)；柱溫45 °C；流動相為水與乙腈梯度洗脫：0～1 min，10%～50%乙腈；1～1.8 min，50%～90%乙腈；1.8～2.2 min,10%乙腈。流速：0.4 mL/min；進樣體積：10μL。

ESI 離子源；正離子檢測模式；離子源參數(shù)設(shè)置如下：噴霧電壓 (spray voltage) 2.5 kV；噴霧溫度 (vaporizer temperature) 200 ℃；鞘氣流速(sheath gas) 40 unit；輔助氣流速 (aux gas) 10 unit；毛細管溫度 (capillary temperature) 300 ℃；碰撞氣(collision gas, argon) 1.5 mTorr；質(zhì)譜掃描模式：選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)，洋川芎內(nèi)酯Im/z225.2→m/z119.3, CE 24 eV；甲苯磺丁脲m/z271.1→m/z155.3, CE 24 eV。所有操作以及數(shù)據(jù)處理由Xcalibur (version 2.2)軟件控制。

1.6 透析液樣品預(yù)處理 在孵育時間結(jié)束時，分別從血漿室或緩沖液室中精密吸取50 μL，分別加入等量的空白PBS緩沖液或空白血漿，混合均勻后加入250 μL的內(nèi)標溶液，渦旋混合45 min，12000 rpm離心10 min后移取上層有機相于96-孔板中，吸取10 μL進行LC-MS/MS分析。

1.7 血漿蛋白結(jié)合率測定 采用平衡透析法，透析膜在超純水中浸泡1 h，然后再在20%的乙醇溶液中浸泡過夜，實驗前透析膜用超純水清洗3遍。精密移取4 μL洋川芎內(nèi)酯I工作溶液于1.5 mL離心管中，加入796 μL空白血漿，渦旋混合均勻后，移取50 μL該樣品于另一離心管中，作為T0樣品在室溫下放置8 h后同“1.6透析液樣品預(yù)處理項下處理”。該樣品用于測定其回收率。另取150 μL 上述血漿樣品于RED透析管的一側(cè)，在另一側(cè)加入等體積的磷酸緩沖液。每個樣品平行3份，用膠帶覆蓋密封，置于37℃恒溫水浴箱中孵育8 h。孵育結(jié)束后，按“1.6透析液樣品預(yù)處理項下處理”測定血漿室和緩沖液室中藥物濃度。陽性對照(紫杉醇)處理方法相同。

1.8 數(shù)據(jù)處理 血漿蛋白結(jié)合率以及回收率根據(jù)如下公式計算得到。

血漿蛋白結(jié)合率 (%)=100%×(C血漿-C緩沖液)/C血漿

回收率(%)=100%×(C血漿+C緩沖液)/C0

C血漿：透析達到平衡時血漿中待測物濃度；C緩沖液：透析達到平衡時緩沖液中待測物濃度；C0：T0樣品中待測物濃度。

2 結(jié)果

2.1 專屬性 在擬定的分析條件下樣品中的內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾洋川芎內(nèi)酯、紫杉醇以及內(nèi)標的測定，保留時間分別為2.51、3.67 min，如圖1所示。

2.2 線性關(guān)系考察 取空白血漿45 μL，加入等體積的空白緩沖液，混合均勻后，加入標準系列工作溶液10μL，配成濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 μM的系列濃度溶液，按照1.6項下的方法處理后進樣分析。以待測物的濃度為橫坐標，待測物與內(nèi)標峰面積的比值為縱坐標，以加權(quán)最小二乘法(1/x2)進行線性回歸，得回歸方程為y=0.0425+0.075x,相關(guān)系數(shù)為r2=0.9989(圖2)，結(jié)果表明在0.05～10 μM濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 精密度測定結(jié)果

2.3 準確度與精密度 取空白血漿45 μL，加入等體積的空白緩沖液，混合均勻后，加入標準系列工作溶液10 μL，配成濃度為0.1、1、8 μM的質(zhì)控樣本，按照1.6項下的方法處理后進樣分析。每一濃度6樣本連續(xù)考察3 d，制作標準曲線。測得濃度與標示濃度比較，球的方法的準確度與精密度，結(jié)果表明日內(nèi)、日間精密度RSD(%)均小于15%，準確度RE(%)在± 10%以內(nèi)，表明該方法精密度與準確度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗 分別考察血漿樣品和緩沖液樣品在室溫、37 ℃條件下放置24 h的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，血漿樣品和緩沖液樣品在上述條件下穩(wěn)定性良好。

2.5 平衡透析時間的確定 洋川芎內(nèi)酯I在37 ℃條件下與大鼠和人空白血漿孵育2、4、6、8、24 h后測定透析內(nèi)外液中待測物與內(nèi)標峰面積的比值，結(jié)果顯示孵育8 h后，洋川芎內(nèi)酯I與血漿蛋白結(jié)合達到平衡。因此孵育時間選擇8 h。

2.6 陽性對照結(jié)果 以紫杉醇與血漿蛋白結(jié)合率作為陽性對照。驗證本實驗使用的平衡透析系統(tǒng)的可行性，結(jié)果樣品孵育8 h后紫杉醇與大鼠和人血漿蛋白結(jié)合分別為92.3%～94.5% 和93.8%～97.2%。與文獻報道的范圍88%～98%一致。

2.7 洋川芎內(nèi)酯I血漿蛋白結(jié)合率測定 洋川芎內(nèi)酯I在37 ℃條件下與空白血漿孵育8 h后，對血漿側(cè)和緩沖液側(cè)樣品處理后進行分析。結(jié)果如表2所示，表明洋川芎內(nèi)酯I與大鼠和人血漿蛋白結(jié)合率較高，大于80%。且隨著濃度的升高，結(jié)合率無顯著性差異。

表2 洋川芎內(nèi)酯I與大鼠和人血漿蛋白結(jié)合率 (n=3)

3 討論

藥物在血液中可以與包括血漿蛋白在內(nèi)的多種生物大分子形成復(fù)合物，但只有游離型藥物能夠產(chǎn)生藥理效應(yīng)。藥物血漿蛋白結(jié)合率是藥物體內(nèi)的重要參數(shù)之一。藥物的血漿蛋白結(jié)合不僅影響到藥物的分布，而且還影響到藥物的代謝和排泄等過程，更與藥理作用密切相關(guān)。洋川芎內(nèi)酯I在大鼠血漿中蛋白結(jié)合率在83.5%～86.5%，在人血漿中蛋白結(jié)合率為82.1%～83.9%，屬于和血漿蛋白高度結(jié)合的化合物，并且這種高結(jié)合率與濃度之間沒有相關(guān)性。高度結(jié)合化合物在臨床上會有一些特異性的體內(nèi)過程：延緩藥物經(jīng)腎排泄，延緩進入細胞外液，從而影響藥物的分布，故在設(shè)計最佳給藥方案時，常需考慮藥物的血漿蛋白結(jié)合率。實驗采用Thermo Scientific平衡透析裝置，與傳統(tǒng)的平衡透析系統(tǒng)相比，透析膜的表面積與體積比率高，能夠縮短平衡時間，且操作簡單。透析管為一次性使用，可以避免交叉污染。

高血漿蛋白結(jié)合的藥物臨床使用容易產(chǎn)生安全性問題，只要有影響血漿蛋白結(jié)合的因素產(chǎn)生，游離藥物濃度可能成倍增加，造成副作用或毒性。一般認為血漿蛋白結(jié)合率高于80%的藥物屬于高蛋白結(jié)合率藥物[5]。實驗結(jié)果表明，洋川芎內(nèi)酯I的蛋白結(jié)合率高于80%，屬于高蛋白結(jié)合藥物，提示在臨床用藥中要注意其它藥物與洋川芎內(nèi)酯I之間的相互作用，避免藥物相互作用引起洋川芎內(nèi)酯I游離血藥濃度的波動而導(dǎo)致毒副作用。

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