孫琪+樸成玉+陳丹丹等

[摘要]目的：探討補(bǔ)骨脂酚對(duì)UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡因子p 53和caspase-3表達(dá)的影響及其機(jī)制。方法：四甲基噻唑藍(lán)[3-（4，5-Dimethyl-2-Thiazolyl）-2，5-Diphenyl Tetrazolium Bromide，MTT]法檢測(cè)不同濃度補(bǔ)骨脂酚對(duì)正常細(xì)胞增殖的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分為四組，空白組、模型組、雌二醇組及補(bǔ)骨脂酚組。以照射強(qiáng)度0.61mW/cm²，照射時(shí)間10min，建立HaCaT細(xì)胞凋亡模型；MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增值率；活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞中ROS含量變化；線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）檢測(cè)各組細(xì)胞線粒體膜電位變化；實(shí)時(shí)定量PCR（Reverse transcriptional PCR，RT-PCR）檢測(cè)各組細(xì)胞中caspase-3 mRNA表達(dá)水平；蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)各組細(xì)胞中p53、caspase-3蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：10^-6mol/L補(bǔ)骨脂酚組細(xì)胞增值率無明顯變化（P>0.05），但是可降低ROS含量、線粒體膜電位、caspase-3mRNA表達(dá)量、p53及caspase-3蛋白表達(dá)量（P<0.05）。結(jié)論：補(bǔ)骨脂酚可抑制UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制主要是通過降低細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量、降低細(xì)胞線粒體膜電位、抑制p53及caspase-3的表達(dá)。

[關(guān)鍵詞]補(bǔ)骨脂酚；UVB；HaCaT；凋亡；p53；caspase-3

[中圖分類號(hào)]R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2017）07-0037-04

紫外線包括UVA（長(zhǎng)波）、UVB（中波）及UVC（短波）三種不同波長(zhǎng)。其中UVB雖然波長(zhǎng)短，但是輻射強(qiáng)度大，可以穿透表皮，因此UVB越來越引起人們的關(guān)注。紫外線照射劑量超過皮膚承受能力，會(huì)引發(fā)皮膚炎癥、老化、凋亡甚至皮膚癌。豆科植物補(bǔ)骨脂干燥成熟種子中除了含有補(bǔ)骨脂素及異補(bǔ)骨脂素，還含有少量的補(bǔ)骨脂酚。補(bǔ)骨脂酚是補(bǔ)骨脂揮發(fā)油的主要成分，約占60%。研究表明，補(bǔ)骨脂酚具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗抑郁以及雌激素樣作用。近幾年來，補(bǔ)骨脂酚的研究越來越多，有報(bào)道稱，補(bǔ)骨脂酚對(duì)成纖維光老化衰老基因具有調(diào)控作用，與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相近。本研究選擇UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡模型作為研究對(duì)象，觀察補(bǔ)骨脂酚對(duì)UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡因子p53、caspase-3 mRNh及蛋白表達(dá)的影響。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料：細(xì)胞株為人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞，來源于上海中喬新舟有限公司。

主要儀器：SS-01B型UVB紫外光療儀（上海希格瑪高技術(shù)公司）；MK3型酶標(biāo)儀（上海熱電儀器有限公司）；SmartChemi500型一體式微型化學(xué)發(fā)光成像儀（北京賽智創(chuàng)業(yè)有限公司）。

試劑：補(bǔ)骨脂酚標(biāo)準(zhǔn)品（成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-15012210）；雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所）；DMEM培養(yǎng)液（Hyclone公司，批號(hào)：NZM1301）；胎牛血清（FBS）（Hyclone公司，批號(hào)：NYB0614）；四甲基噻唑藍(lán)（MTT）（Sigma公司，批號(hào)：021005）；線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）（碧云天生物技術(shù)）；小鼠抗人β-actin單克隆抗體（北京中杉金橋有限責(zé)任公司）；兔抗人p53多克隆抗體（南京恩晶生物科技有限公司）；兔抗人caspase-3多克隆抗體（博奧森生物有限公司）；羊抗小鼠二抗（博士德生物有限公司）；羊抗兔二抗（博士德生物有限公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1溶液配制：雌二醇溶液配制：將0.23mg雌二醇粉末放入到2ml無水乙醇中進(jìn)行混合，加入吐溫250μl，再使用DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行10倍稀釋，最終濃度達(dá)到1×10^-7mol/L，最后0.22Pm微孔濾膜過濾除菌，-20℃冰箱保存待用。

補(bǔ)骨脂酚溶液配置：精密稱取補(bǔ)骨脂酚2.54mg，用10μl二甲基亞砜（Dimethylsulfoxide，DMS0）將其充分溶解，再加I）MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基定容至10ml，濃度為10^-3mol/L，0.22μm濾膜濾過除去細(xì)菌及雜質(zhì)，DMEM培養(yǎng)液稀釋補(bǔ)骨脂酚，稀釋濃度分別為10 4mol/L、10^-5mol/L、10^-6mol/L、10^-7mol/L、10^-8mol/L、10^-9mol/L、10^-10mol/L、10^-11lmol/L等9個(gè)濃度，-20℃冰箱保存待用。

JC-1染色工作液配置：將8ml純水加入到50μl JC-1（200×）中進(jìn)行混勻，再加入2ml JC-1染色緩沖液（5×）混勻即可。

JC-1染色緩沖液（1×）配置：取3ml JC-1染色工作液（5×）加入12ml純水，混勻，放于冰浴中保存待用。

1.2.2 HaCaT細(xì)胞凋亡模型的建立及分組：參照文獻(xiàn)，按每孔15×10³個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，將其分為空白組、模型組、10^-7mol/L雌二醇及10^-6mol/L補(bǔ)骨脂酚組。培養(yǎng)24h后，空白組及模型組分別加入新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；10^-7mol/L雌二醇及10^-6mol/L補(bǔ)骨脂酚組分別加入相應(yīng)的藥物溶液培養(yǎng)。24h后，空白組更換新的培養(yǎng)液，使用鋁箔紙蓋上繼續(xù)培養(yǎng)24h；模型組、10^-7mol/L雌二醇及10^-6mol/L補(bǔ)骨脂酚組棄去培養(yǎng)液，分別加入200μl磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Solution，PBS）覆蓋，選擇最佳照射時(shí)間10min進(jìn)行照射，棄去PBS后繼續(xù)加入新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h。最終，加入20μl MTT及150μl DMSO，酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞吸光值。endprint

1.2.3細(xì)胞增長(zhǎng)率測(cè)定：參照文獻(xiàn)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于96孔板，培養(yǎng)24h，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選定10^-11、10^-10、10^-9、10^-8、10、1^-7、10^-6、10^-4及10^-3mol/L九個(gè)濃度補(bǔ)骨脂酚加入96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24h，棄去舊培養(yǎng)液，繼續(xù)加入新培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，再加入20μl MTT及150μl DMSO，于492nm波長(zhǎng)處酶標(biāo)儀檢測(cè)每組間細(xì)胞的吸光值。細(xì)胞增殖率=給藥組OC值/空白組OD值（其值設(shè)為1）×100%。

1.2.4 ROS試劑盒檢測(cè)ROS含量：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，消化、離心，接種于6孔板后，進(jìn)行分組，分別為空白組、模型組、10^-7mol/L雌二醇及10^-6mol/L補(bǔ)骨脂酚組，于37℃5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72h后取出，棄掉培養(yǎng)液，加入1mlDCFH-DA（10μM/L）溶液，放于培養(yǎng)箱孵育20min，每隔5min顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。采用無血清的培養(yǎng)液洗滌3次，PBS清洗3次，加入胰蛋白酶進(jìn)行消化，培養(yǎng)液終止消化，離心，放于1.5ml離心管中，加入1mlPBS重懸細(xì)胞，濾網(wǎng)濾過。最后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞中ROS含量。

1.2.5線粒體膜電位試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞膜電位變化：建模成功后，收集每組細(xì)胞分別放于1.5ml離心管中，參照文獻(xiàn)，每管中分別加入0.5ml培養(yǎng)液及0.5ml JC-1染色工作液混勻，37℃培養(yǎng)箱中孵育20min，加入1ml JC-1染色緩沖液（1×）重懸，6009 4℃離心5min，棄上清，重復(fù)2次，再加入1ml JC-1染色緩沖液（1×）重懸，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 RT-PCR測(cè)定各組細(xì)胞中mRNA表達(dá)水平：建模成功后，Trizol試劑、氯仿、異丙醇、75%乙醇提取各組RNA，使用Nano-100微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度和濃度，計(jì)算所需體積數(shù)，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為eDNA，然后以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。caspase-3引物（F：5-TGGTTCATCCAGTCECl3TG-3，R：5-ATTCTGTTGCCAC-TITTCG-5）。

反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃ 5min，變性95℃ 30s，退火/延伸60℃ 60s，30個(gè)循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)的循環(huán)數(shù)即Ct值、融解曲線和擴(kuò)增曲線可從real-time PCR上直接讀取。β-actin作為各處理組的內(nèi)參基因，caspase-3等目的基因在處理組相對(duì)于對(duì)照組的AACt值計(jì)算得出：AACt=（Ct目的基因Ct內(nèi)參基因）處理組-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）對(duì)照組，按照公式可算出各組caspase-3等目的基因相對(duì)于對(duì)照組表達(dá)量：目的基因相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt。

1.2.7 Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平：建模成功后，按300μl/瓶加入RIPA裂解液，使用前2～3min需向裂解液內(nèi)加入3μl PMSF（終濃度1mM），選用BCA試劑盒測(cè)蛋白濃度，電泳75min，轉(zhuǎn)膜35min，封閉液封閉2h，一抗（1：300）孵育，于4℃條件下過夜。次日，二抗（1：10 000）孵育1h，加入TBST后放于床上震蕩，重復(fù)3次，在膜上滴加發(fā)光工作液，把膜置于化學(xué)發(fā)光成像儀內(nèi)，曝光并拍照，分析圖像結(jié)果，應(yīng)用Lane ID凝膠分析系統(tǒng)分析條帶灰度（IOD），分析并獲得各條帶的灰度值，目的蛋白的表達(dá)水平根據(jù)靶條帶的灰度值與內(nèi)參（β-actin）的灰度值的比值來反映。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS23.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料均用（x±s）表示，將用單因素方差分析（one-wayANOVA）進(jìn)行分析，經(jīng)組間比較方法，兩兩比較采用LSD法。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同濃度補(bǔ)骨脂酚對(duì)細(xì)胞增殖率的影響：如表1所示，與空白組相比，10^-11、10^-10、10^-9、10^-8、10^-7mol/L補(bǔ)骨脂酚組細(xì)胞增殖率明顯上升（P<0.01），10^-5、10^-4、10^-3mol/L補(bǔ)骨脂酚組細(xì)胞增殖率明顯降低（P<0.05），10^-6mol/L補(bǔ)骨脂酚組細(xì)胞增值率無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2補(bǔ)骨脂酚作用于光老化模型對(duì)細(xì)胞活性的影響：如表2所示，與空白組相比，模型組細(xì)胞增殖率明顯下降（P<0.01）；與模型組相比，10^-7mol/L雌二醇組及10^-6mol/L補(bǔ)骨脂酚組細(xì)胞增殖率明顯上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 ROS含量測(cè)定結(jié)果：如表3所示，與空白組相比，模型組ROS含量明顯升高（P<0.01）；與模型組相比，10^-7mol/L雌二醇組及10^-6mol/L補(bǔ)骨脂酚組ROS含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.4線粒體膜電位測(cè)量結(jié)果：如表4所示，與空白組相比，模型組線粒體膜電位明顯增加（P<0.01）；與模型組相比，10^-7mol/L雌二醇組及10^-6mol/L補(bǔ)骨脂酚組線粒體膜電位明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.5各組細(xì)胞中caspase-3 mRNA表達(dá)量測(cè)定結(jié)果：如表5所示，與空白組相比，模型組中easpase-3 mRNA表達(dá)量升高（P<0.01）；與模型組相比，10^-7mol/L雌二醇組及10^-6mol/L補(bǔ)骨脂酚組caspase-3 mRNA表達(dá)量均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

2.6各組細(xì)胞中p53、easpase-3蛋白表達(dá)量測(cè)定結(jié)果：如表6及圖1所示，與空白組相比，模型組中P53及caspase-3蛋白表達(dá)量明顯上升（P<0.01）；與模型組相比，10^-7mol/L雌二醇組及10^-6mol/L補(bǔ)骨脂酚組中p53及easpase-3蛋白表達(dá)量明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

3討論

皮膚易遭受紫外線輻射誘發(fā)細(xì)胞凋亡。因角質(zhì)形成細(xì)胞位于皮膚表皮層，紫外線主要誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡。其中p53可以被UVB誘導(dǎo)的DNA損傷所激活，細(xì)胞凋亡主要是由多個(gè)信號(hào)通路調(diào)控的死亡過程，p53蛋白在細(xì)胞的凋亡過程中占有重要的作用。p53蛋白和半胱氨酸鹽酸天冬氨酸蛋白-3（caspase-3）是促凋亡基因，在DNA損傷、細(xì)胞凋亡、癌基因的激活等方面發(fā)揮重要作用。caspase-3蛋白酶作為細(xì)胞凋亡的終極指標(biāo)，是參與細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶，其中，caspase-3可以促使各種凋亡因子被激活，一旦被激活，可以使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。p53參與調(diào)控線粒體凋亡通路，主要是通過對(duì)線粒體膜上Bcl-2家族蛋白成員的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，使線粒體膜電位發(fā)生改變，最終導(dǎo)致激活caspases-3以及啟動(dòng)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)。

為了闡明補(bǔ)骨脂酚對(duì)HacaT細(xì)胞凋亡保護(hù)作用的機(jī)制，本研究繼續(xù)觀察補(bǔ)骨脂酚對(duì)凋亡相關(guān)基因（p53、caspase-3）表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，模型組凋亡相關(guān)基因p53、caspase-3表達(dá)水平顯著升高，該結(jié)果與模型組HaCaT細(xì)胞凋亡水平顯著升高相一致。而給予10^-7mol/L雌二醇及10^-6mol/L補(bǔ)骨脂酚治療后，與模型組相比，治療組HaCaT細(xì)胞凋亡水平顯著降低。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)補(bǔ)骨脂酚對(duì)HaCaT細(xì)胞凋亡保護(hù)作用的機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)p53及caspase-3相關(guān)基因的表達(dá)。通過本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，可以將補(bǔ)骨脂酚應(yīng)用于天然化妝品中，為預(yù)防紫外線對(duì)皮膚的破壞奠定一定的理論基礎(chǔ)。endprint