陳秋秋+劉海霞+肖朋

[摘要]目的：觀察不同靜水壓力作用下大鼠顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨細(xì)胞TRPM7和Fas蛋白的表達(dá)情況，探討不同靜水壓力可能對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡的影響。方法：將軟骨細(xì)胞隨機(jī)分組，分別給予不同大小和時(shí)間的壓力刺激。Western Blot檢測每組TRPM7和Fas蛋白量。結(jié)果：加壓時(shí)間為1h、2h時(shí)，6～10kPa實(shí)驗(yàn)組的Fas蛋白量均低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05；當(dāng)壓力值為20kPa/2h、30kPa/1h或2h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05；當(dāng)壓力為20kPa/1h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。加壓時(shí)間分別為1h、2h時(shí)，6～20kPa實(shí)驗(yàn)組的TRPM7蛋白量均低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05；當(dāng)壓力值為30kPa/2h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05；但壓力值為30kPa/1h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。結(jié)論：較小壓力范圍內(nèi)，可能抑制軟骨細(xì)胞的凋亡；壓力條件超過一定界限后，可能對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用。

[關(guān)鍵詞]顳下頜關(guān)節(jié)；軟骨細(xì)胞；靜水壓力；凋亡

[中圖分類號(hào)]R782.6 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1008-6455（2017）07-0044-04

在顳下頜關(guān)節(jié)的一些疾病中，存在以髁突軟骨細(xì)胞（mandibular condylar cartilage cells，MCCs）凋亡過度而致軟骨細(xì)胞層變薄為特征的退行性變化，可能與關(guān)節(jié)內(nèi)壓異常增大有關(guān)。前期研究發(fā)現(xiàn)大鼠應(yīng)激狀態(tài)下咬肌肌肉異常活動(dòng)度的大小與顳下頜關(guān)節(jié)組織病理改變存在正相關(guān)關(guān)系，即肌肉異常牽引力度越大，關(guān)節(jié)病變?cè)絿?yán)重。也有研究表明顳下頜關(guān)節(jié)對(duì)負(fù)荷首先表現(xiàn)為細(xì)胞的增殖，其中以軟骨細(xì)胞最為活躍，隨負(fù)荷增加，損傷過程大于修復(fù)過程，出現(xiàn)軟骨基質(zhì)的進(jìn)行性破壞。目前，關(guān)節(jié)內(nèi)壓可能引起髁突軟骨細(xì)胞凋亡的體外實(shí)驗(yàn)成為國內(nèi)外基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)，本研究旨在通過對(duì)髁突軟骨細(xì)胞施加不同時(shí)間和大小的靜水壓力，觀察TRPM7和Fas蛋白的表達(dá)變化，探討不同靜水壓力可能對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的影響。

1材料和方法

1.1材料：PMSF、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天），30%丙烯酰胺、TEMED、SDS上樣緩沖液（Amreseo），電轉(zhuǎn)液（西格瑪奧貿(mào)易有限公司），蛋白marker（14-120KD）（北京全氏金生物技術(shù)有限公司），蛋白marker（10-250KD）（fermentas），PVDF膜（0.45um）（Millipore）、兔抗GAPDH 37KD（杭州賢至生物有限公司），兔抗TRPM7 213KD（abeam），兔抗FAS 48KD（Santa Cruz），HRP標(biāo)記羊抗兔二抗（LTD），ECL底物液（Thermo），X光膠片（柯達(dá)），顯影定影試劑盒（武漢巴菲爾生物）。

1.2方法

1.2.1制備MCCs：無菌條件解剖大鼠下頜骨，眼科組織剪剖離髁突軟骨并剝離軟骨表面的纖維被膜，然后將軟骨切成1mm×1mm×1mm大小組織塊，0.2%Ⅱ膠原酶避光消化18～20h，獲取MCCs。而后制備細(xì)胞懸液接種于100mm培養(yǎng)皿中，“+”鋪勻，待細(xì)胞長滿皿底80%左右時(shí)進(jìn)行傳代。

1.2.2施加靜水壓力：參考Ryuichi Kunii等的加壓方法，取生長良好的第3代細(xì)胞，待生長達(dá)對(duì)數(shù)期時(shí)，隨機(jī)分為兩組，F(xiàn)as組和TRPM7組。采用加壓氣囊裝置向培養(yǎng)瓶內(nèi)充氣至壓力表指針達(dá)到要求的壓強(qiáng)強(qiáng)度，立即移入培養(yǎng)孵箱并計(jì)時(shí)。加壓時(shí)間設(shè)置為1h、2h，每時(shí)間點(diǎn)給予OkPa、6kPa、8kPa、10kPa、20kPa、30kPa的壓力，以O(shè)kPa作為對(duì)照。每組每壓力條件下設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，當(dāng)加壓結(jié)束后，立即收集細(xì)胞用Western Blot檢測蛋白，每孔重復(fù)測量3次。

1.2.3蛋白樣品的制備：①提取細(xì)胞總蛋白：倒凈培養(yǎng)液，每瓶加3ml預(yù)冷的PBS（4℃）洗滌細(xì)胞3次，棄PBS后把培養(yǎng)瓶置于冰上，加400μ裂解液/瓶，冰上裂解30min，收集細(xì)胞碎片和裂解液，4℃下12000rpm離心5min，0.5ml的離心管分裝離心后的上清，-20℃保存；②蛋白濃度的測定：稀釋蛋白樣品和BSA標(biāo)準(zhǔn)品，用DG一3022A酶標(biāo)儀測定0D568，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度和相應(yīng)的OD值計(jì)算直線回歸方程，根據(jù)蛋白樣品OD值，利用回歸方程計(jì)算出樣品蛋白濃度；③蛋白變性：將提取的蛋白上清與5x蛋白上樣緩沖液，放入沸水中進(jìn)行沸水浴10min。

1.2.4電泳分離實(shí)驗(yàn)：①配制電泳膠：12%分離膠（總體系20m1）、8%分離膠（總體系20m1）、濃縮膠5%（總體系6m1）；②電泳分離：將制備好的膠固定到電泳槽上，儲(chǔ)液池中倒入電泳液，將制備好的蛋白樣品和MAKER加入上樣孔，各樣品總蛋白量為40μg，行電泳分離。

1.2.5電轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)膜儀內(nèi)放好夾緊板后的黑色板—纖維墊—濾紙—凝膠—PVDF膜—濾紙—纖維墊—白色板，黑色板對(duì)應(yīng)黑色負(fù)極，加滿電轉(zhuǎn)液開始轉(zhuǎn)膜。

1.2.6免疫印跡顯色：采用ECL顯色系統(tǒng)。將PVDF膜浸泡于TBST中，室溫?fù)u床封閉2h，將PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育過夜。洗去一抗加入二抗，37℃搖床孵育2h。TBST充分洗滌PVDF膜，以便洗去二抗，滴加工作液于PVDF膜上，待熒光帶明顯后，覆上保鮮膜，X光膠片壓片后行顯影和定影，沖洗膠片。

1.2.7蛋白表達(dá)量測定：晾干后掃描膠片，用BandScan分析膠片灰度值，以抗大鼠GAPDH作為內(nèi)參，F(xiàn)as/GAPDH和TRPM7/GAPDH作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，不同壓力時(shí)間下，組內(nèi)進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。endprint

2結(jié)果

不同壓力條件下Fas和TRPM7，總蛋白各有一條灰色條帶，灰度值不同，加壓1h、2h后，檢測各組蛋白含量。

2.1 Fas蛋白表達(dá)量測定結(jié)果：①隨著壓力值的增大，F(xiàn)as蛋白表達(dá)呈先下降后增高趨勢，見圖1～2；②當(dāng)靜水壓力為6kPa、8kPa、10kPa，實(shí)驗(yàn)組每組蛋白量均低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05；③當(dāng)靜水壓力為20kPa/2h、30kPa/1h、30kPa/2h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組蛋白量均高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05；④但20kPa/1h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的蛋白量與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。見表1。

2.2 TRPM7蛋白表達(dá)量測定結(jié)果：①隨著壓力值的增大，TRPM7蛋白表達(dá)呈先下降后增高趨勢，見圖3～4；②當(dāng)靜水壓力為6kPa、8kPa、10kPa、20kPa，實(shí)驗(yàn)組每組蛋白量均低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05；③當(dāng)靜水壓力為30Kpa/2h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組蛋白量均高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05；④但30kPa/1h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的蛋白量與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。見表2。

3討論

顳下頜關(guān)節(jié)紊亂?。═emporomandibular disorders，TMD）是多種致病因素共同作用所致的一組疾病的總稱，共同作用因素包括原始因素、始動(dòng)因素（誘因）和持續(xù)作用因素。近年來國內(nèi)外研究著重于強(qiáng)調(diào)行為和社會(huì)心理因素對(duì)TMD的影響。有研究表明當(dāng)壓力負(fù)荷過大或者持續(xù)過久時(shí)，可對(duì)關(guān)節(jié)軟骨造成損傷，單一或反復(fù)的損傷是引起骨關(guān)節(jié)炎的始動(dòng)因素。前期研究發(fā)現(xiàn)精神壓力對(duì)TMD病變可產(chǎn)生影響，其可能機(jī)制是精神緊張引起全身肌肉收縮，進(jìn)而將力量傳遞給下頜骨（articulatio mandibularis，OR），增加顳下頜關(guān)節(jié)（Tempromendibular Joint，TMJ）腔內(nèi)壓力，造成軟骨病變。髁突軟骨退行性病變是TMD的病理改變之一，髁突軟骨細(xì)胞作為髁突軟骨唯一細(xì)胞成分，其增殖和凋亡直接影響TMJ的生理病理狀態(tài)。有相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明力學(xué)刺激對(duì)軟骨細(xì)胞的生長分化起著重要作用，也有學(xué)者利用不同靜水壓力施加于TMJ滑膜細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)靜水壓力達(dá)到或超過一定范圍時(shí)大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞出現(xiàn)線粒體腫脹、胞質(zhì)空泡樣變等超微結(jié)構(gòu)改變，并出現(xiàn)類似包涵體的凋亡小體，且變化程度隨壓力增大而加重，推測其機(jī)制可能與壓力激活凋亡基因有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過模擬軟骨細(xì)胞體內(nèi)生存環(huán)境，觀察不同靜水壓力作用下Fas和TRPM7蛋白表達(dá)情況，從而探究壓力作用下軟骨細(xì)胞凋亡可能存在的變化規(guī)律。

Fas又稱Apo-1，是存在于細(xì)胞膜上的Ⅰ型跨膜蛋白，F(xiàn)as與其相應(yīng)的配體結(jié)合后可傳遞一種細(xì)胞凋亡信號(hào)，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的一系列生化反應(yīng)或形態(tài)學(xué)改變。Fas及配體也是近年來研究細(xì)胞凋亡最為熱點(diǎn)的膜表面分子，故研究探討其在細(xì)胞凋亡中的變化對(duì)闡明TMD病理機(jī)制具有深遠(yuǎn)意義。Fas基因是公認(rèn)的凋亡活化基因，在凋亡活化階段發(fā)揮重要作用。Fas及配體在關(guān)節(jié)軟骨中高表達(dá)，故Fas途徑常被認(rèn)為是軟骨細(xì)胞凋亡途徑之一。王擁軍等人。也證實(shí)了Fas通路能誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的髁突軟骨細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重凋亡。本研究在壓力時(shí)間為1h、2h時(shí)，6～10kPa組的Fas蛋白較0kPa組低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該結(jié)果提示軟骨細(xì)胞凋亡在較小壓力條件下可能是呈抑制狀態(tài)的。這與張曼等人的研究結(jié)果即力學(xué)刺激對(duì)髁突軟骨細(xì)胞的生物學(xué)反應(yīng)具有重要意義，也可能是髁突保持終生改建能力的重要生物學(xué)基礎(chǔ)之一相一致。同時(shí)，適度的負(fù)重對(duì)維持關(guān)節(jié)的正常結(jié)構(gòu)、功能和生理改建是必須的，具有重要意義。這一觀點(diǎn)與本研究結(jié)果也相符。當(dāng)壓力值為20kPa/1h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與0kPa組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但當(dāng)壓力值不變，時(shí)間延長為2h，實(shí)驗(yàn)組蛋白高于0kPa組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。當(dāng)加壓時(shí)間為1h不變，延長壓力時(shí)間為30kPa時(shí)，實(shí)驗(yàn)組蛋白又高于0kPa組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。本結(jié)果表明當(dāng)壓力值和/或時(shí)間超過一定界值時(shí)可抑制Fas蛋白的表達(dá)，即過度的壓力刺激可能促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持王世東的觀點(diǎn)，即健康狀態(tài)下的關(guān)節(jié)軟骨可以承受一定時(shí)間和一定強(qiáng)度的外力，一旦超過一定強(qiáng)度或時(shí)間，可對(duì)關(guān)節(jié)軟骨造成損傷，損傷程度與力的大小、類型、程度及持續(xù)時(shí)間有關(guān)。

TRPM7（transient receptor potential melastatin-7）是存在于細(xì)胞膜上的壓力敏感通道，參與多種生理功能，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞死亡等，近年來對(duì)其研究較為深入。TRPM7通道在2003年被Arts證實(shí)：在缺糖缺氧條件下，該通道在神經(jīng)元死亡過程中起重要作用。該通道可能也在軟骨細(xì)胞凋亡機(jī)制中起到重要作用。本研究在壓力值為1h、2h時(shí)，6～20kPa組的TRPM7蛋白較0kPa組低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示較小的壓力條件可能對(duì)軟骨細(xì)胞的凋亡有抑制作用。壓力值為30kPa/1h時(shí)，兩組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但當(dāng)時(shí)間調(diào)整為2h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組比0kPa組蛋白量高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05。提示該壓力條件下，軟骨細(xì)胞凋亡可能是增長的。上述實(shí)驗(yàn)提示我們一定壓力負(fù)荷內(nèi)，可抑制軟骨細(xì)胞TPPM7蛋白表達(dá)，當(dāng)壓力超過一定界值后，該蛋白表達(dá)增加。這與Fas蛋白表達(dá)變化規(guī)律基本一致，我們推測TRPM7也可能參與了壓力作用下MCCs的凋亡。

4結(jié)論

本次研究根據(jù)體外培養(yǎng)的髁突軟骨細(xì)胞在不同條件靜水壓力下，觀察軟骨細(xì)胞Fas和TRPM7蛋白變化規(guī)律，探討了不同壓力可能與髁突軟骨細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系：①適當(dāng)壓力范圍時(shí)，可抑制Fas蛋白和TRPM7蛋白的表達(dá)，有可能與軟骨細(xì)胞凋亡受抑制有關(guān)；②壓力超過一定范圍后，F(xiàn)as蛋白和TRPM7蛋白表達(dá)均上調(diào)，有可能與軟骨細(xì)胞凋亡增加有關(guān)。即Fas通路和TRPM7通路都有可能參與髁突軟骨細(xì)胞凋亡，但仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)此結(jié)論。這或許為TMD的臨床防治提供思路。endprint