葛宇松，馬成永，徐晏雯，林永忠

（大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 大連 116023）

社會(huì)老齡化日益嚴(yán)重，老年期癡呆的患者逐漸增多，其中阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是其中最常見(jiàn)的癡呆類型。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)年齡≥65歲老年人中AD的患病率為3%～8%，并且隨著年齡的增長(zhǎng)，患病率將逐漸上升[1]。AD主要表現(xiàn)為隱匿起病，不可逆進(jìn)行性加重的認(rèn)知功能損傷包括記憶、視空間能力、語(yǔ)言表達(dá)能力等領(lǐng)域障礙，以及常伴隨的非認(rèn)知性神經(jīng)精神癥狀，其特征性病理學(xué)改變是神經(jīng)元纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangle，NFT）、大量老年斑（senile plaque，SP）形成及神經(jīng)元缺失[2-3]，其中SP核心及主要成分為β-淀粉樣蛋白（β-amyloid peptide，Aβ）。

近幾年中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)與AD發(fā)病機(jī)制的緊密聯(lián)系及相互作用日益受到關(guān)注。研究顯示，在AD的炎癥反應(yīng)過(guò)程中，Aβ可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)和釋放多種與炎癥相關(guān)的活性物質(zhì)，包括白細(xì)胞介素1（interleukin-1，IL-1）、IL-6、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）等，加劇神經(jīng)細(xì)胞的退行性變，而抑制炎癥反應(yīng)可以有效緩解Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷[2，4-5]。Toll樣受體 4（toll-like receptor 4，TLR4）信號(hào)通路是目前已知的 重要的炎性通路之一，近 來(lái)研究也證實(shí)TLRs信號(hào)通路參與AD的演變過(guò)程，且TLR4在Aβ介導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用中具有重要作用[6-7]，而抑制TLR4信號(hào)通路可以緩解Aβ介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[8-9]。TAK-242是TLR4的特異性抑制劑，在腦缺血、腦出血及創(chuàng)傷性腦損傷中都起到神經(jīng)保護(hù)作用[10-12]，然而其是否可以抵抗Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷仍然未知。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)雙側(cè)海馬注射聚集態(tài)的Aβ25-35復(fù)制AD模型，腹腔注射TAK-242進(jìn)行干預(yù)，觀察TAK-242的治療是否可以促進(jìn)海馬神經(jīng)細(xì)胞的存活，以及對(duì)大鼠海馬組織中TLR4信號(hào)通路蛋白及炎癥因子表達(dá)的影響，從而了解TAK-242的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

健康Wister大鼠共30只，雌雄不限，體重200～250 g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部提供。所有動(dòng)物按照自然晝夜，自由進(jìn)食進(jìn)水，20～25℃、標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料常規(guī)飼養(yǎng)。Aβ25-35（用無(wú)菌生理鹽水將Aβ25-35稀釋成5μg/μl，37℃下孵育2 d，使其變?yōu)榫奂瘧B(tài)的Aβ25-35）、二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，TAK-242（TAK-242溶于1% DMSO生理鹽水溶液，終濃度為0.4 mg/ml）購(gòu)自美國(guó)MCE公司，TLR4多克隆抗體購(gòu)自武漢三鷹公司，髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德公司，β-肌動(dòng)蛋白和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，IL-1β和TNF-α酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型的復(fù)制Wister大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（雙側(cè)海馬分別注入生理鹽水+腹腔注射1% DMSO生理鹽水）、模型組（雙側(cè)海馬分別注入Aβ+腹腔注射1% DMSO生理鹽水）和藥物組（雙側(cè)海馬分別注入Aβ+腹腔注射TAK-242/1% DMSO生理鹽水），每組10只。將Wister大鼠用10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔麻醉后，顱頂正中切開(kāi)皮膚，暴露頭骨，俯臥位固定于腦立體定向儀上，雙側(cè)顱骨分別鉆孔，深達(dá)硬腦膜。定位：前囟后3.5 mm，中逢左右2.0 mm， 顱骨平面向下2.7 mm，即為海馬注射點(diǎn)。模型組和藥物組每側(cè)海馬注射2μl（10μg）Aβ25-35，并留針5 min，對(duì)照組注射相應(yīng)劑量生理鹽水。TAK-242按5 mg/（kg·d）一次性給予大鼠腹腔注射，從海馬注射前1天開(kāi)始至海馬注射后7 d結(jié)束，對(duì)照組和模型組按同樣時(shí)間注射相應(yīng)劑量的1% DMSO生理鹽水。各組大鼠均于海馬注射后7 d處死。

1.2.2 標(biāo)本采集 ①各組5只大鼠麻醉后迅速開(kāi)胸，生理鹽水灌注心臟后以4%多聚甲醛液灌注至動(dòng)物四肢變硬，斷頭取腦，樣本置于4%多聚甲醛中固定24 h，以注射針道為中心做冠狀切腦，酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋。連續(xù)冠狀切片，片厚6μm。相鄰切片分別作Nissl染色。②各組5只大鼠麻醉后，斷頭取腦，冰上分離雙側(cè)海馬組織，-70℃冰箱保存。左側(cè)進(jìn)行Western blot檢測(cè)；右側(cè)進(jìn)行ELISA檢測(cè)。

1.2.3 NISSL染色 取各組大鼠切面相同的切片，石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，染色于硫堇-石碳酸30 min，37℃溫箱加熱。梯度酒精粉色脫水后，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。對(duì)Nissl染色的結(jié)果進(jìn)行海馬錐體神經(jīng)元計(jì)數(shù)，即在低倍鏡下（×40）確定海馬CA3區(qū)位置，然后在高倍鏡下（×400）連續(xù)數(shù)2個(gè)視野的海馬錐體神經(jīng)元數(shù)目，取其均值，每只動(dòng)物數(shù)3張切片，取其均值，為該只大鼠海馬CA3區(qū)錐體神經(jīng)元數(shù)。

1.2.4 Western blot檢測(cè) 取保存的冷凍組織，低溫提取蛋白，Lowry法測(cè)定蛋白濃度。取50μg蛋白上樣到10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠，電泳（120 V，1.5 h）。待溴酚藍(lán)進(jìn)入凝膠底部后，把蛋白質(zhì)再印跡到硝酸纖維素膜上，封閉，將膜與溶于封閉液中的一抗（兔抗TLR4抗體1∶500、兔抗MyD88抗體1∶300和小鼠抗β-actin抗體1∶300）4℃孵育過(guò)夜，洗滌，最后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，洗滌后用ECL發(fā)光液曝光顯影，將蛋白印跡顯影圖掃描，利用圖像分析軟件Scion Image對(duì)蛋白帶進(jìn)行光密度分析。以β-actin作為內(nèi)對(duì)照，以對(duì)照組目的條帶與β-actin灰度值比值為1，計(jì)算各組目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。作為TLR4和MyD88蛋白的半定量指標(biāo)。

1.2.5 ELIS A取保存的冷凍組織，用0.01 mmol/L PBS（pH=7.2～7.4），勻漿后4℃離心，取上清，用ELISA檢測(cè)IL-1β和TNF-α水平，操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用Tukey's檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TAK-242對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元損傷的影響

3組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=21.618，P=0.000）。對(duì)照組大鼠海馬CA3區(qū)細(xì)胞帶無(wú)明顯受損，神經(jīng)細(xì)胞密集，排列完整。模型組大鼠海馬CA3區(qū)較對(duì)照組神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞帶結(jié)構(gòu)喪失，細(xì)胞減少明顯，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；藥物組大鼠較模型組上述表現(xiàn)明顯改善，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖 1、2。

2.2 TAK-242對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)大鼠海馬TLR4和MyD88表達(dá)的影響

3組大鼠TLR4和MyD88蛋白表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=53.006和26.129，均P=0.000）。對(duì)照組TLR4和MyD88蛋白表達(dá)量較低。與對(duì)照組相比，模型組TLR4和MyD88蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），藥物組上述指標(biāo)表達(dá)亦高于對(duì)照組（P＜0.05）。與模型組相比，藥物組TLR4和MyD88表達(dá)降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖 3。

圖1 各組大鼠海馬CA3區(qū)的神經(jīng)元 （Nissel染色×400）

圖2 各組大鼠海馬CA3區(qū)的神經(jīng)元比較

2.3 TAK-242對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)大鼠海馬IL-1β和TNF-α表達(dá)的影響

3組大鼠IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=51.539和69.299，均P=0.000）。對(duì)照組IL-1β和TNF-α的含量較低，與對(duì)照組相比，模型組IL-1β和TNF-α表達(dá)量升高（P＜0.05）；與模型組相比，藥物組IL-1β和TNF-α表達(dá)量降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖 4。

圖3 各組海馬TLR4和MyD88蛋白的表達(dá)

圖4 各組海馬IL-1β和TNF-α的表達(dá)

3 討論

AD是中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性退行性疾病，其主要病理特征之一是在大腦皮層和海馬出現(xiàn)大量的老年斑，其主要成分是Aβ。在體和離體實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)Aβ可以誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)等，而炎癥反應(yīng)越來(lái)越受到關(guān)注。在AD腦內(nèi)，Aβ1-40/Aβ1-42形成了β折疊的核心片段，發(fā)揮毒性作用。而研究證實(shí)，Aβ25-35可以產(chǎn)生同樣的毒性作用[13]，因此可以應(yīng)用Aβ25-35作為AD的研究工具。

本實(shí)驗(yàn)采用雙側(cè)海馬注射聚集態(tài)的Aβ25-35復(fù)制AD模型，采用Nissl染色可見(jiàn)模型組海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞帶受損，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞數(shù)減少，由此可見(jiàn)模擬AD腦內(nèi)Aβ對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷成功，與既往研究一致[14]。而應(yīng)用TAK-242治療的藥物組明顯改善海馬神經(jīng)細(xì)胞的損傷，保護(hù)海馬神經(jīng)元抵抗Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性。

TLR4是膜蛋白家族一員，是非特異性免疫反應(yīng)中一類重要的模式識(shí)別受體，能過(guò)激活下游多種信號(hào)分子的表達(dá)，促進(jìn)致炎因子如IL-1、TNF-α的釋放，其在神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)中具有重要作用。在體及離體實(shí)驗(yàn)研究均顯示TLR4參與AD的炎癥反應(yīng)，在其發(fā)病機(jī)制和病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要角色[4]，且抑制Aβ誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可以起到神經(jīng)保護(hù)作用[5]。

TLR4信號(hào)傳導(dǎo)通路包括MyD88依賴途徑和非MyD88依賴途徑，其中MyD88依賴性途徑主要介導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，在傳遞上游信息和疾病發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[15]。TLR4活化后與MyD88結(jié)合，依次激活下游信號(hào)分子IL-1受體相關(guān)激酶、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6，最終激活NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑，啟動(dòng)細(xì)胞因子（如IL-1、TNF-α等）的轉(zhuǎn)錄、翻譯，致使炎癥因子大量釋放[16]。 IL-1β具有多種細(xì)胞活性，如細(xì)胞增殖，分化和凋亡，并且在腦內(nèi)高表達(dá)。其可以引起APP表達(dá)增多，加重Aβ的沉積和Tau磷酸化水平[17]。TNF-α是誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中的一個(gè)重要因子，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡并促進(jìn)淀粉樣前體蛋白（amyloid pre cursor protein，APP）和Aβ的產(chǎn)生[5]。此外，炎癥因子可通過(guò)上調(diào)APP蛋白水解酶β-分泌酶和γ-分泌酶的表達(dá)活性來(lái)增加腦內(nèi)Aβ產(chǎn)生和沉積[18]。由此推斷，Aβ和炎癥因子間形成一個(gè)惡性循環(huán)，加重AD腦內(nèi)的病理變化。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Aβ可以引起大鼠海馬組織TLR4、MyD88蛋白，以及IL-1β和TNF-α表達(dá)增高，而TAK-242降低Aβ誘導(dǎo)的上述蛋白表達(dá)變化。結(jié)合Nissl染色結(jié)果可以得出，TAK-242作為TLR4特異性抑制劑可以通過(guò)下調(diào)TLR4/MyD88信號(hào)通路，減少IL-1β和TNF-α炎癥因子的釋放，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用。此外，TAK-242目前已經(jīng)應(yīng)用于膿毒癥的臨床2期實(shí)驗(yàn)研究中，在人體中具有良好的安全性[19]，這為AD的治療提供新的思路，并可能帶來(lái)治療方法的新進(jìn)展。

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