楊小利，殷亞楠，胡文淼，張理斐，童麗，孫志平，程坤，王亞君

（1.河南省鄭州市第三人民醫(yī)院 兒科，河南 鄭州 450000；2.河南省鄭州市第二人民醫(yī) 院 神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450000）

腦缺血（ischemic cerebrovascular disease，ICVD）是由于腦組織中供血不足引起的。在世界范圍內(nèi)，每年有超過560萬人因?yàn)槟X缺血而導(dǎo)致殘疾或者死亡，嚴(yán)重威脅著人類健康[1]。在臨床上，腦缺血是第三大危害人類健康的疾病。有研究表明，腦缺血后的4.5 h后，若對腦缺血區(qū)域進(jìn)行再灌注會加重神經(jīng)細(xì)胞的損害程度，這被稱為腦缺血再灌注損傷[2]。由于腦缺血多是由于外界作用引起的，治療時往往超過了4.5 h[3]。腦缺血再灌注損傷是目前研究的熱點(diǎn)。

后膜骨架蛋白1（Homer 1）存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展[4]。Homer 1具有調(diào)控胚胎腦組織發(fā)育、調(diào)控大腦學(xué)習(xí)能力等生理作用。Homer 1可以分為Homer 1a、Homer 1b、Homer 1c。Homer 1a參與調(diào)控抑郁癥、癲癇等多種疾病的發(fā)生，是目前研究最多的Homer蛋白。有研究表明，Homer 1a在顱腦創(chuàng)傷中高表達(dá)[5]。目前尚未見Homer 1a與腦缺血再灌注損傷的相關(guān)研究。本研究復(fù)制Homer1a基因敲除小鼠腦缺血再灌注損傷模型，探討Homer 1a在腦缺血再灌注損傷中的作用，以期為治療腦缺血再灌注提供新思路。

1 材料與方法

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物40日齡Homer1a基因敲除小鼠10只和40日齡野生型小鼠20只購自于鄭州大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，體重18～22g。

1.1.2 主要儀器及試劑 水浴鍋（上海雷韻試驗(yàn)儀器制造有限公司），超凈工作臺（蘇州施威克環(huán)保科技有限公司），PCR儀[賽飛（中國）有限公司]，顯微鏡（上海上光新光學(xué)科技有限公司），石蠟切片機(jī)（德國LEICA公司），離心機(jī)（湖南邁達(dá)儀器有限公司），PVDF膜（美國Sigma公司），PBS（ 北京鼎國生物試劑有限公司），蛋白酶K（ 美國Sigma公司），IL-6單克隆抗體、IL-1β單克隆抗體、TNF-α單克隆抗體、GAPDH單克隆抗體、辣根過氧化物標(biāo)記的二抗

1.1 材料

（美國CTS公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠模型復(fù)制 實(shí)驗(yàn)分為3組，Homer1a基因敲除小鼠10只為實(shí)驗(yàn)組，野生型小鼠20只隨機(jī)分為兩組，分別為腦缺血組和對照組。所有的實(shí)驗(yàn)動物在構(gòu)建前均禁食1 d，飲水不限制。分別用濃度為3%的異氟烷麻醉實(shí)驗(yàn)組和腦缺血組的小鼠，連接麻醉 器，用濃度為1%的異氟烷與一氧化二氮N2O和氧氣O2混合維持麻醉。將小鼠四肢固定在手術(shù)操作板上，使小鼠仰臥，用碘消毒后，沿中線剪開皮膚，使頸部血管暴露。將血管周圍組織剝離后，順著頸總動脈找到分叉處。小心分離頸外動脈和頸內(nèi)動脈。用血管夾結(jié)扎靠近心段的頸總動脈處和靠近頸總動脈分叉處的頸外動脈。頸內(nèi)動脈打活結(jié)，分別牽拉頸內(nèi)動脈和頸外動脈，使頸內(nèi)動脈暫時性閉塞。用眼科剪在遠(yuǎn)離心端的頸總動脈處剪一個小口，插入拴線后，將拴線固定在頸內(nèi)動脈活結(jié)處的備線上?？p合后，將小鼠放在37℃的環(huán)境下2 h。觀察小鼠蘇醒后麻醉，把拴線抽出來，用Willis環(huán)對小鼠實(shí)現(xiàn)動脈缺血后再灌注。對照組的小鼠不插入拴線，操作步驟同實(shí)驗(yàn)組和腦缺血組。

1.2.2 行為學(xué)評分 腦缺血再灌注后的各組小鼠進(jìn)行行為學(xué)評分。評分標(biāo)準(zhǔn)為0～5分制。小鼠可以直線行走記為0分；小鼠對側(cè)的前爪不能自由活動記為1分；身體無意識的向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈記為2分；小鼠的身體不自主的向一邊傾斜記為3分；小鼠昏迷記為4分；小鼠死亡記為5分。行為學(xué)評分在1～3分認(rèn)為腦缺血再灌注模型復(fù)制成功。

1.2.3 TTC染色計算小鼠腦梗死體積 各組小鼠腦缺血再灌注損傷后24 h，脫臼處死。放置于冰上，斷頭取出腦組織，洗滌后放在腦槽中，腦組織切片，每片厚度控制在1 mm左右，放在濃度為2%的TTC生理鹽水中，放置于室溫下?lián)u床緩慢震蕩，避光反應(yīng)30 min。取出腦切片，觀察腦梗死區(qū)域，分析計算腦梗死體積。

1.2.4 Tunel法檢測細(xì)胞凋亡 各組小鼠腦缺血再灌注損傷后24 h，常規(guī)方法制作腦組織石蠟切片。分別將石蠟切片放置于二甲苯中浸泡15 min。在95%、90%和80%濃度 的酒精中浸泡3 min。用PBS洗滌3次，5 min/次，放置于濃度為30%的過氧化氫H2O2溶液中浸潤20 min。用PBS洗滌3次，5 min/次，加入蛋白酶K放置于37℃孵育40 min，加入PBS洗滌3次，5 min/次。取適量Tunel染液于切片上，放置于37℃孵育60 min。用PBS洗滌3次，5 min/次。滴加丙三醇C3H8O3封片，放置在顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。隨機(jī)選取5個視野，計算細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 GFAP法檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞 小鼠腦組織切片脫蠟止水后，放置于檸檬酸高壓鍋內(nèi)，沸水煮沸60 s，放置于修復(fù)液40 s，小心滴加抗體后，用PBS洗滌3次×5 min，加入過氧化物后放在避光處室溫孵育20 min，PBS洗滌后，滴加驢血清放置于室溫下封閉50 min。加入以1︰100稀釋的一抗在4℃孵育過夜，加入熒光素酶標(biāo)記的二抗，在室溫條件下孵育60 min，加入PBS洗滌后，加入HOECHST溶液，孵育10 min，丙三醇封片。顯微鏡下觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞，隨機(jī)選取5個視野計數(shù)星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量。

1.2.6 Western blot檢測IL-1β、TNF-α、IL-6表達(dá)水平 各組中小鼠腦缺血再灌注后24 h，取出小鼠腦組織，用剪刀剪碎后放在勻漿器中，取適量的裂解液加入到勻漿器后，在冰上研磨。將研磨的組織液轉(zhuǎn)移到EP管中，4℃，10 000 r/min離心10 min。轉(zhuǎn)移蛋白上清液至新的EP管中，根據(jù)BCA蛋白濃度檢測試劑盒操作步驟檢測提取的蛋白濃度。將蛋白與loading buffer充分混合后，放在100℃中煮沸5 min使蛋白充分變性。取50μl變性蛋白加入到上樣孔中，80 V電壓電泳30 min后，調(diào)整電壓為120 V至電泳結(jié)束。取出蛋白凝膠在自來水下小心沖洗后，按照常規(guī)方法4℃轉(zhuǎn)膜。PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉后，分別依次與一抗二抗孵育，PBST洗滌后，加入顯色液，在暗室中曝光，拍照，分析蛋白表達(dá)含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計量資料3組數(shù)據(jù)的比較采用方差分析，在方差分析有意義的基礎(chǔ)上，再采用LSD-t檢驗(yàn)兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)評分結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組、腦缺血組、對照組中小鼠腦缺血再灌注損傷后24 h，根據(jù)行為學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分，評分越高說明小鼠腦缺血再灌注損傷越嚴(yán)重。結(jié)果顯示，正常組評分＜1，腦缺血組和實(shí)驗(yàn)組小鼠行為學(xué)評分在介于1～3之間，說明成功復(fù)制了腦缺血再灌注小鼠模型。實(shí)驗(yàn)組小鼠行為學(xué)評分高于腦缺血組，說明Homer1a基因敲除小鼠腦缺血再灌注損傷較腦缺血組更為嚴(yán)重。見圖1。

2.2 各組腦梗死情況

各組小鼠腦缺血再灌注損傷后24 h，取出腦組織，切片后，TTC染色觀察小鼠腦梗死情況。結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組與腦缺血組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組小鼠腦梗死體積較腦缺血組增多；實(shí)驗(yàn)組和腦缺血組與正常組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組與腦缺血組小鼠腦梗死體積較正常組增多。見圖2。

2.3 各組細(xì)胞凋亡情況

圖1 腦缺血再灌注小鼠行為學(xué)評分結(jié)果

圖2 腦缺血再灌注小鼠中腦梗死體積百分比

各組小鼠腦缺血再灌注損傷后24 h，取出腦組織，切片后，Tunel法檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果。結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組與腦缺血組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組小鼠腦組織細(xì)胞凋亡情況高于腦缺血組；實(shí)驗(yàn)組和腦缺血組與正常組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組與腦缺血組小鼠腦組織中細(xì)胞凋亡情況多于正常組。見圖3。

圖3 腦缺血再灌注小鼠腦組織中細(xì)胞凋亡情況

2.4 星形膠質(zhì)細(xì)胞檢測結(jié)果

腦缺血再灌注損傷會引發(fā)星型膠質(zhì)細(xì)胞的增生和活化，進(jìn)而產(chǎn)生GFAP蛋白，本研究中腦組織切片與GFAP蛋白一抗和二抗孵育后，在顯微鏡下觀察GFAP陽性細(xì)胞數(shù)即為星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組和腦缺血組分別與正常組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組和腦缺血組小鼠腦組織中星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)都高于正常組，而實(shí)驗(yàn)組小鼠腦組織中星型膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量低于腦缺血組，這可能與Homer 1a蛋白和星形膠質(zhì)細(xì)胞膜受體相互作用有關(guān)。見圖4。

2.5 各組IL-1β、TNF-α、IL-6表達(dá)

各組中小鼠腦缺血再灌注后24 h，取出小鼠腦組織，經(jīng)蛋白提取，Western blot檢測細(xì)胞中IL-1β、TNF-α、IL-6表達(dá)。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠腦組織中IL-1β、TNF-α、IL-6表達(dá)水平與腦缺血組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組高于腦缺血組；實(shí)驗(yàn)組和腦缺血組小鼠腦組織中IL-1β、TNF-α、IL-6表達(dá)水平與正常組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組與腦缺血組均高于正常組。見圖5。

圖4 各組星型膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)結(jié)果

圖5 腦缺血再灌注小鼠中IL-1β、TNF-α、IL-6的表達(dá)

3 討論

腦缺血是一種臨床上常見的疾病。高血壓、高血脂、動脈粥樣硬化、應(yīng)激、外力刺激等都可以引起腦缺血的發(fā)生[6]。腦缺血死亡率極高，是一種嚴(yán)重危害人類生命健康的疾病。Homer是一種廣泛存在于哺乳動物腦組織中的支架蛋白。Homer蛋白參與調(diào)控多種信號通路，在突觸的發(fā)育過程中具有重要作用[7-8]。Homer蛋白在精神分裂、智力發(fā)育、創(chuàng)傷性腦損傷、阿爾茨海默病、腦膠質(zhì)瘤、癲癇等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用[9]。Homer 1a屬于Homer蛋白家族中的一員。已經(jīng)有研究表明，神經(jīng)元細(xì)胞受到機(jī)械損傷時，Homer 1a表達(dá)上調(diào)，與代謝性谷氨酸受體作用后，對神經(jīng)元細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用[10-11]。

當(dāng)發(fā)生腦缺血再灌注損傷后，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死是細(xì)胞死亡的2種方式。細(xì)胞凋亡主要發(fā)生在損傷程度較輕的區(qū)域，這些區(qū)域細(xì)胞缺血的時間較短[12-13]。而細(xì)胞壞死則發(fā)生在損傷程度較為嚴(yán)重的區(qū)域，這些區(qū)域細(xì)胞缺血時間較長，屬于缺血的核心區(qū)域[14]。本研究中，用TTC和Tunel法分別檢測了腦缺血再灌注小鼠腦組織中腦梗死情況和細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠腦梗死體積和細(xì)胞凋亡數(shù)目較腦缺血組明顯增多，這提示，Homer1a基因敲除小鼠細(xì)胞腦缺血再灌注損傷程度較為嚴(yán)重。Western blot檢測腦缺血再灌注小鼠腦組織中炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6表達(dá)均高于正常組，而基因敲除小鼠中炎癥因子的表達(dá)量高于單純腦缺血再灌注組，進(jìn)一步說明了缺失Homer1a基因，會加重腦缺血再灌注損傷。

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞是腦組織中數(shù)量最多的細(xì)胞，而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞具有給神經(jīng)元細(xì)胞提供營養(yǎng)的作用[15]。星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量占神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的50%，是腦缺血再灌注損傷中最早受到影響的細(xì)胞。研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的具有抗氧化作用的谷胱甘肽可以調(diào)控谷氨酸的攝取和釋放[16]，從而促進(jìn)紅細(xì)胞生成素的合成。另外星形膠質(zhì)細(xì)胞還可以作用于水通道蛋白，對鈣離子興奮性、神經(jīng)信號的整合、神經(jīng)元的橋接等發(fā)揮抑制作用[17-18]。興奮性氨基酸谷氨酸的異常增多，會對神經(jīng)元產(chǎn)生興奮性毒性，損害神經(jīng)元細(xì)胞。另一方面，星形膠質(zhì)細(xì)胞可以通過調(diào)節(jié)鈉離子通道調(diào)控谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，作用于谷氨酸的重新攝取，減輕了谷氨酸引起的興奮性毒性[19-20]。本研究中，腦缺血再灌注小鼠中星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量多于正常組，而基因敲除后的腦缺血再灌注小鼠腦組織中星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和活化數(shù)目較單純腦缺血再灌注小鼠明顯降低，這提示，Homer1a基因敲除后對星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化和增生具有一定的抑制作用。這可能與Homer 1a蛋白調(diào)控谷氨酸受體有關(guān)。谷氨酸受體在腦缺血再灌注的星形膠質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)，而谷氨酸受體又與星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡有關(guān)。Homer 1a在這一系列過程中具有連接作用，導(dǎo)致Homer 1a蛋白和谷氨酸受體之間的平衡失調(diào)，抑制了星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，本研究成功復(fù)制了腦缺血再灌注小鼠模型，Homer1a基因敲除加重腦缺血再灌注損傷。Homer 1a對腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。這為進(jìn)一步研究腦缺血再灌注損傷奠定了基礎(chǔ)。

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