曾新宇，曲亞明，利顯民，王富森

（廣東省深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院 耳鼻咽喉科，廣東 深圳 518101）

隨著社會因素和生物因素的不斷變化，急慢性咽喉炎、聲帶息肉和聲帶小結等炎癥性聲帶疾病的發(fā)病率逐年升高，嚴重影響患者的生活質量，成為耳鼻喉科的常見疾病[1]。根據(jù)文獻報道[2]，在心肌缺血再灌注損傷導致的炎癥、膿毒癥誘導的急性肝損傷中，toll樣受體4（toll-like receptor4，TLR4）/核轉錄因子kappa B（nuclear transcription factor kappa B，NF-κB）信號通路在炎癥反應的調控方面發(fā)揮重要作用。TLR4可導致NF-κB激活并入核，從而啟動白細胞介素6（interleukin 6，IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）等炎癥因子基因的表達[3-5]。然而炎癥性聲帶疾病患者的TLR4/NF-κB信號通路是否發(fā)揮作用尚未見報道。本文旨在闡明炎癥性聲帶疾病患者病理組織中TLR4/NF-κB信號通路的表達變化，為炎癥性聲帶疾病的防治提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2015年6月-2017年1月在深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科就診斷的炎癥性聲帶疾?。ń?jīng)HE染色證實）手術患者的聲帶病變組織（疾病組）和正常聲帶組織（對照組）（喉癌手術中切?。└?0例。符合本院倫理委員的標準并得到委員會的批準，所有入選者都已簽訂知情同意書。排除標準：疾病組和對照組中均排除孕婦、合并其他感染性疾病、外傷、腫瘤及嚴重肝腎功能不全等患者。疾病組男29例，女21例；年齡33～56歲，平均（42.6歲）。對照組男26例，女24例；年齡30～52歲，平均（40.5歲）。兩組患者一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

1.2 研究方法

1.2.1 手術患者聲帶病變組織HE染色 將手術切除的聲帶病變組織取出后，用生理鹽水沖洗，洗凈后將組織塊放入液氮中，進行冷凍切片，并進行蘇木素-伊紅染色（HE染色），顯微鏡下觀察聲帶病變組織的病理學變化。

1.2.2 ELISA檢測TNF-α、IL-6、白細胞介素1β（IL-1β）的含量 按照ELISA試劑盒說明書進行實驗：①標準品的加樣與稀釋（倍比稀釋法）；②加樣：分別設空白孔（空白孔不加樣品及酶標試劑，其余各步驟操作相同）和待測樣品孔；③37℃溫育30 min；④配洗液、洗滌5次，1 min/次；⑤加酶標試劑；⑥溫育、洗滌5次，1 min/次；⑦加試劑顯色；⑧加終止液終止；⑨測定：以空白孔調零，用酶標儀在相應波長下測定光密度（OD）值，通過標準曲線計算樣品中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測TLR4 mRNAA 的表達 在Pubmed數(shù)據(jù)庫中查詢TLR4并獲取其編碼序列，采用Premer Premier 5.0軟件設計引物，引物序列見附表。采用離心柱型總RNA提取試劑盒，按說明書提取總RNA；按逆轉錄試劑盒說明書配制反應體系，將RNA逆轉錄為cDNA，逆轉錄的反應條件為：42℃ 60 min，70℃ 5 min；以cDNA為模板進行實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitattiivvee real-time polymerase chain reaction，qRT-PCRR） 檢測，反應體系為 ：cDNA 2μl，正反向引物各 0.8μl，ddH2O 8.9μl， 熒 光 mix 12.5μl， 共 25μl。PCR 反應條件為 ：95℃ 10 min ；95℃ 15 s，59℃ 30 s，72℃30 s，40個循環(huán)。以GAPDH表達量為參照，進行相對定量分析。

1.2.4 Western blot檢測TLR4蛋白的表達水平 采用全蛋白提取試劑盒提取疾病組和對照組組織全蛋白，取20μl全蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳，半干轉恒壓轉膜15 V 20 min，5%脫脂奶粉搖床上孵育封閉2 h，與anti-TLR4或anti- NF-κB p65或NF-κB p-p65 于4℃搖床上孵育過夜，HRP標記二抗常溫搖床上孵育2 h，洗膜后于凝膠成像分析儀上成像分析，TLR4的表達量以β-actin表達量為參照進行計算，計算TLR4與β-actin條帶灰度值的比值并進行分析。NF-κB p65的磷酸化水平以NF-κB p65和NF-κB p-p65的表達量進行計算。

附表 TLR4及GAPDH進行qRT-PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，結果以均數(shù)±標準差（±s）表示。兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 手術患者聲帶病變組織病理改變

聲帶組織表面覆蓋無角化鱗狀上皮，間質水腫，見少量淋巴細胞浸潤，符合聲帶炎癥，見圖1。

2.2 兩組TNF-α、IL-6、IL-1β的含量比較

疾病組與對照組患者病理組織中TNF-α、IL-6和IL-1β含量比較，采用t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=5.250、7.569和11.040，均P=0.000），疾病組TNF-α、IL-6和IL-1β含量高于對照組。見圖2。

圖1 手術患者聲帶息肉病理切片 （HE染色）

2.3 兩組TLR4 mRNA及蛋白的表達

疾病組TLR4 mRNA及蛋白的表達水平降低，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=6.484和4.533，P=0.000和 0.011），見圖 3。

2.4 兩組NF-κB p65磷酸化水平

疾病組與對照組病理組織中NF-κB p65磷酸化水平比較，采用t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.049，P=0.016），疾病組NF-κB p65磷酸化水平高于對照組，見圖4。

圖2 兩組TNF-α、IL-6、IL-1β的含量比較

圖3 兩組TLR4 mRNA及蛋白的表達

圖4 兩組NF-κB p65磷酸化水平比較

3 討論

Toll樣受體（toll-like receptors，TLRs）是模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）家族的主要成員，是一種識別高度保守的病原相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），能將細胞外抗原識別信息向細胞內傳遞并引發(fā)炎癥反應，構成抗感染的第一道防線[6]。TLRs家族有超過13個亞型，其中TLR4是最早被發(fā)現(xiàn)的，它是識別多種PAMPs的關鍵亞型，尤其是革蘭陰性細菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）[7]。最近的研究發(fā)現(xiàn)[8]，TLR4也可結合損傷組織和壞死細胞釋放的內源性分子。因此，無論在感染性和非感性刺激導致的炎癥反應中，TLR4都是一個非常關鍵的受體。GUEDIA等[9]研究表明，在LPS介導的胃腸運動障礙中，HIV和TLR4相互作用促進炎癥反應的發(fā)生并促進免疫反應激活；YANG等[10]研究表明，TLR4在心肌梗死、缺血再灌注損傷和心力衰竭等非感染性疾病中發(fā)揮重要作用。隨著社會的進步與發(fā)展，現(xiàn)代人的壓力越來越大，不良的生活習慣、過度用嗓、空氣污染及多種新病原體出現(xiàn)等感染或非感染性因素都可成為炎癥性聲帶疾病的病因，因此，TLR4可能在炎癥性聲帶疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。本次研究結果顯示：疾病組患者病理組織中TLR4 mRNA及蛋白的表達水平高于對照組，提示TLR4在炎癥性聲帶疾病中發(fā)揮作用。

NF-κB被認為是控制炎癥反應的核心因子[11]，其家族主要由5個亞單位組成：p50、p52、p65、RelA/B和c-Rel，其中p65為NF-κB發(fā)揮功能所必需[12]。TLR4經(jīng)過一系列構象變化及細胞內傳遞作用激活一個非常重要的轉錄因子，即NF-κB，使NF-κB p65亞單位上的S536磷酸化，結合到靶向的DNA，通過調控多種基因表達進而促進多種炎癥介質和細胞因子的表達，發(fā)揮防御和免疫調節(jié)作用[13-14]。本研究結果顯示：疾病組患者病理組織中NF-κB p65磷酸化水平高于對照組，提示NF-κB的激活是炎癥性聲帶疾病炎癥反應的機制之一。TLR4/NF-κB信號通路的炎癥因子主要有TNF-α、IL-6、IL-1β[14]等，本研究結果顯示：疾病組患者病理組織中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量高于對照組，說明炎癥性聲帶疾病患者病理組織中TLR4/NF-κB信號通路發(fā)生活化。

綜上所述，TLR4/NF-κB信號通路可能在炎癥性聲帶疾病中發(fā)揮作用，本研究為炎癥性聲帶疾病的治療提供了干預靶點。

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