何秀娟，林 燕，李 萍

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院 北京市中醫(yī)研究所，北京 100010)

糖尿病足潰瘍(diabetic foot ulcer，DFU)遷延難愈，造成極高的致殘和致死率。中性粒細(xì)胞是機(jī)體固有免疫的第一道防線，通過吞噬、脫顆粒、分泌細(xì)胞因子和形成中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)發(fā)揮防御作用。中性粒細(xì)胞活化后形成NETs發(fā)揮捕獲和消滅病原體作用，這是固有免疫的重要發(fā)現(xiàn)。NETs是把雙刃劍，參與多種疾病的病理生理過程。新近研究表明，糖尿病激活了中性粒細(xì)胞生成NETs，過多或持續(xù)存在的NETs導(dǎo)致糖尿病足潰瘍創(chuàng)面愈合遲緩[1- 2]。

1 中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)的特征

NETs作為一種不同于細(xì)胞凋亡和壞死的死亡方式在1996年被Takei等發(fā)現(xiàn)[3]，其形成過程在2004年被命名為NETosis[4]。NETs是中性粒細(xì)胞受到刺激活化后釋放到胞外的一種DNA網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其間鑲嵌有組蛋白、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)、組織蛋白酶G、鈣網(wǎng)蛋白、蛋白酶3、乳鐵蛋白、正五聚蛋白3、明膠酶、LL37和肽聚糖結(jié)合蛋白等具有殺菌和增加通透性作用的蛋白[5]，這些蛋白鑲嵌在DNA骨架上大大增加了其局部濃度[4]。因此NETs的形成被認(rèn)為是固有免疫的重要事件。目前發(fā)現(xiàn)NETosis有3種形式：1)伴隨著中性粒細(xì)胞死亡的NETosis，被稱為自殺性NETosis(suicidal NETosis)，持續(xù)2～4 h，也是目前報(bào)道最多的模型，但是分子過程并未完全明確[6]；2)核DNA釋放的重要NETosis，中性粒細(xì)胞形成NETs不破壞核膜和質(zhì)膜，

時(shí)間在5～60 min，并且其不依賴于活性氧(reactive oxygen species, ROS)和Raf/MERK/ERK途徑[7]；3)線粒體DNA釋放的重要NETosis，GM-CSF和脂多糖刺激后形成并依賴ROS[8]。參與創(chuàng)面修復(fù)的NETosis主要是自殺性NETosis[9]，多由PMA誘導(dǎo)，當(dāng)核膜與胞質(zhì)顆粒膜融合，NE降解染色質(zhì)內(nèi)起連接作用的組蛋白H1，肽?；彼崦搧啺访?(peptidylarginine deiminase 4，PAD4)催化核心組蛋白H3或H4的精氨酸進(jìn)行瓜氨酸化，使染色質(zhì)解聚，形成DNA 和抗菌蛋白混合物，并隨著胞膜破裂，排至細(xì)胞外形成網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)，此時(shí)中性粒細(xì)胞死亡[10]。

NETs的形成依賴ROS和NADPH氧化酶[11]。ROS是NE進(jìn)入細(xì)胞核的先決條件。使用蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)激活劑(PMA或H2O2)刺激人髓樣白血病細(xì)胞系PLB- 985后可生成NETs，而刺激缺乏NADPH氧化酶2(NOX2)的X-連鎖慢性肉芽腫髓樣白血病細(xì)胞系PLB- 985(X-CGD PLB- 985)后無NETs生成，但加入H2O2可促其生成少量NETs[12]。Raf-MEK-ERK通路是NADPH氧化酶的上游通路[13]，二酰甘油可以激活PKC，其類似物可以誘導(dǎo)產(chǎn)生NETs，而其類似物又可以被PKC和c-Raf、MEK和ERK的抑制劑所抑制，阻礙活性氧的生成。Raf-MEK-ERK通路可上調(diào)抗凋亡蛋白Mcl- 1來抑制中性粒細(xì)胞的凋亡而使其發(fā)生NETosis。RIPK1-RIPK3-MLKL信號(hào)通路在PMA誘導(dǎo)NETs生成ROS的下游發(fā)揮作用[14]。使用RIPK1和MLKL抑制劑(NEC- 1和NSA)處理PMA刺激的人中性粒細(xì)胞后都未見核膜和質(zhì)膜破裂，熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)Nec- 1處理的細(xì)胞形成NETs和釋放DNA數(shù)量減少。同時(shí)PMA刺激人中性粒細(xì)胞后RIPK3表達(dá)和MLKL磷酸化增加。與野生型小鼠相比，RIPK3基因敲除小鼠的中性粒細(xì)胞經(jīng)PMA刺激后NETs數(shù)量至少減少50%。但是也有相反的觀點(diǎn)認(rèn)為NETs形成不需要RIPK3-MLKL信號(hào)通路參與[15]，兩者使用的實(shí)驗(yàn)方法類似，但是PMA刺激時(shí)間不同，由此說明NETs的研究目前還沒有標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)方法和數(shù)據(jù)分析方法，建立NETs研究的金標(biāo)準(zhǔn)是目前需要解決的問題。

2 中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)與糖尿病

在糖尿病或高血糖狀態(tài)下，中性粒細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激并產(chǎn)生白細(xì)胞介素6(IL- 6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等細(xì)胞因子，傾向于產(chǎn)生NETs。Ⅱ型糖尿病患者血漿中NETs組分(NE、單-寡核小體和 dsDNA)明顯升高，此外，單-寡核小體與糖化血紅蛋白(HbA1c)水平呈正相關(guān)，血清中IL- 6濃度和dsDNA呈正相關(guān)。因此有人提出假說，NETosis失調(diào)和高血糖，氧化應(yīng)激，炎性反應(yīng)和糖尿病并發(fā)癥密切相關(guān)[16]。此外，如果把非糖尿患者的中性粒細(xì)胞放在高葡萄糖(25 mmol/L)條件下培養(yǎng)，和低糖組(5 mmol/L)及甘露糖(25 mmol/L)組相比，更易于產(chǎn)生NETosis。由于無能量的糖不影響NETosis，這個(gè)現(xiàn)象可以用糖酵解導(dǎo)致活性氧生成增多來解釋。所以NETs在高糖條件生成增多不依賴于糖尿病的類型和來源[7]。

3 中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)與糖尿病足潰瘍

糖尿病激活了中性粒細(xì)胞發(fā)生自殺性NETosis，NETs過多或持續(xù)存在導(dǎo)致創(chuàng)面愈合遲緩。NETosis延緩了DFU的創(chuàng)面愈合。DFU患者血液中NETs組分(NE、組蛋白、NGAL及蛋白酶3)和傷口的NE水平明顯升高，血清和傷口的NE水平都與感染相關(guān)并能預(yù)測傷口愈合是否遲緩。DFU患者血液中中性粒細(xì)胞發(fā)生自發(fā)性NETosis增多。糖尿病小鼠創(chuàng)面局部PAD4活性升高，組蛋白瓜氨酸化，活體鏡檢也發(fā)現(xiàn)其切除性傷口床發(fā)生NETosis。糖尿病小鼠與正常小鼠相比，其創(chuàng)面瓜氨酸化的H3升高(H3Cit, NET標(biāo)志之一)，并且創(chuàng)面愈合延遲。因此，Ⅰ型和Ⅱ型糖尿患者及小鼠的中性粒細(xì)胞都被激活并產(chǎn)生NETs，PAD4水平升高，從而導(dǎo)致創(chuàng)面愈合遲緩[2]。

NETosis在體內(nèi)受到雙機(jī)制的調(diào)控，包括脫氧核糖核酸酶1(DNase1) 的消化和巨噬細(xì)胞的吞噬作用。巨噬細(xì)胞呈表型依賴和時(shí)間依賴調(diào)控NETosis。巨噬細(xì)胞可以吞噬發(fā)生NETosis 的中性粒細(xì)胞，尤其是M2型巨噬細(xì)胞。體外把巨噬細(xì)胞和發(fā)生NETosis 的中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，NETs降解后巨噬細(xì)胞呈表型依賴性應(yīng)答，M2型巨噬細(xì)胞可分泌MIF，CCL2/MCP- 1，CCL3/MIP- 1a和CCL4/MIP- 1b等促炎因子誘導(dǎo)炎性反應(yīng)，M1型巨噬細(xì)胞在PAD4的作用下釋放DNA到細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)胞外的DNA增多，這些DNA在半胱天冬酶激活的脫氧核糖核酸酶(caspase-activated DNase，CAD)的作用下被降解并在24 h內(nèi)被清除。從NETS是把雙刃劍的角度看，細(xì)胞外DNA 的暫時(shí)升高和隨后的被清除機(jī)制非常合理[17]。最新研究發(fā)現(xiàn)糖尿病db/db小鼠創(chuàng)面巨噬細(xì)胞由M1型到M2型轉(zhuǎn)化障礙是其愈合遲緩的主要原因之一[18]。糖尿病創(chuàng)面M1型巨噬細(xì)胞持續(xù)存在導(dǎo)致細(xì)胞外的DNA持續(xù)增多，如不能及時(shí)被清除，會(huì)加重組織損傷；M2型細(xì)胞減少導(dǎo)致其吞噬發(fā)生NETosis 的中性粒細(xì)胞能力下降，都導(dǎo)致創(chuàng)面愈合遲緩。

NETs是把雙刃劍，除捕殺病原體外也損傷自身組織和細(xì)胞。NETs的細(xì)胞毒性與組蛋白、NE和MPO密切相關(guān)，應(yīng)用這些蛋白的抑制劑后NETs的細(xì)胞毒性明顯降低[19]。高濃度的NE降解創(chuàng)面的基質(zhì)導(dǎo)致愈合遲緩，NETs和組蛋白可直接導(dǎo)致上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞損傷[20]。這樣的毒性環(huán)境造成野生型小鼠創(chuàng)面角質(zhì)細(xì)胞增生緩慢。因?yàn)檎Ｆつw不表達(dá)PAD4，所以PAD4的異常表達(dá)很大程度由于其來源于浸潤的中性粒細(xì)胞。對于創(chuàng)面修復(fù)，使用NETosis來防御微生物可能并不非常有效，比如糖尿病創(chuàng)面經(jīng)常感染的葡萄球菌屬，可通過產(chǎn)生DNase破壞NETs的DNA 骨架來逃避捕殺。

4 藥物干預(yù)NETs形成和降解治療糖尿病足潰瘍

抑制NETosis或破壞NETs可減輕NETs引起的慢性炎性反應(yīng)從而促進(jìn)糖尿病性創(chuàng)面愈合。野生型小鼠切除性皮膚創(chuàng)面產(chǎn)生大量的NETs，而PADi4-/-小鼠(小鼠的PAD4由PADi4基因編碼)卻沒有產(chǎn)生NETs。和野生型小鼠相比，PADi4-/-小鼠創(chuàng)面愈合加快，并不受糖尿病影響。使用PAD4 抑制劑處理可減少小鼠創(chuàng)面結(jié)網(wǎng)的中性粒細(xì)胞促進(jìn)傷口愈合[1]。用DNase作用于NETs后，可導(dǎo)致NETs解體并失去抗菌作用。用DNase1處理可促進(jìn)糖尿病和正常血糖小鼠創(chuàng)面愈合[1]。抑制PAD4來抑制NETs形成或者通過DNase1降解NETs可能成為創(chuàng)面愈合新的治療靶點(diǎn)。

5 展望

NETs是中性粒細(xì)胞功能的重大發(fā)現(xiàn)，近十年來，人們對通過NETs 研究發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)給予了厚望。糖尿病患者的中性粒細(xì)胞、炎性反應(yīng)和組織損傷的相關(guān)性已得到初步證實(shí)，NETosis和糖代謝的機(jī)制還需要深入研究。目前NETosis標(biāo)志或NETs檢測方法的金標(biāo)準(zhǔn)還沒有建立，不同實(shí)驗(yàn)室發(fā)表的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也不完全一致[21]。這些為今后深入研究NETs與糖尿病足潰瘍帶來了一定難度，但是可以肯定通過調(diào)控NETs為糖尿病足潰瘍的治療展現(xiàn)了新的前景和曙光。

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新聞點(diǎn)擊

高蛋白飲食無法抵擋糖尿病

據(jù)美國WebMD醫(yī)學(xué)新聞網(wǎng)(2016- 10- 15)報(bào)道，雖然許多人相信高蛋白飲食有助于減重，但一項(xiàng)新研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)際上它可能阻礙了減重所帶來的重要健康益處。

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用高蛋白飲食減重時(shí)，胰島素敏感性并沒有改善。胰島素敏感性是可以降低糖尿病與心臟病風(fēng)險(xiǎn)的因子。

2型糖尿病患者的細(xì)胞會(huì)逐漸喪失胰島素敏感性，胰島素敏感性是對代謝激素的反應(yīng)能力，通常都是伴隨著肥胖產(chǎn)生這種情形，所以改善胰島素敏感性是減重的副產(chǎn)物之一。

然而，研究調(diào)查人員Bettina Mittendorfer發(fā)現(xiàn)，吃高蛋白飲食減重的女性其胰島素敏感性沒有改善；節(jié)食但吃標(biāo)準(zhǔn)量蛋白質(zhì)的女性其胰島素敏感性改善了25%～30%。

Mittendorfer解釋，這些發(fā)現(xiàn)很重要，因?yàn)樵S多過重或肥胖者的胰島素?zé)o法有效控制血糖值，最終導(dǎo)致糖尿病。

研究人員也發(fā)現(xiàn)，在節(jié)食時(shí)攝取大量蛋白質(zhì)對于保持肌肉沒有多大的益處。

有專家認(rèn)為，身體是需要蛋白質(zhì)的，但如果攝取的蛋白質(zhì)超過身體所需，而且有腎臟問題的話，則可能會(huì)有害。這些蛋白質(zhì)可能轉(zhuǎn)為脂肪貯存，熱量增加，造成體質(zhì)量也增加。

該研究結(jié)果刊登在2016- 10- 11《細(xì)胞報(bào)告》。