俞冬升，蔡大敏，陳婕妤，呂方怡，花扣珍，銀國利，王俊娟

(1.浙江省人民醫(yī)院 杭州醫(yī)學院附屬人民醫(yī)院骨科，浙江 杭州 310014；2.杭州醫(yī)學院解剖學與組織胚胎學教研室，浙江 杭州 310014)

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類具有自我更新、復制和多向分化潛能的細胞[1-2]。多項動物研究和早期臨床試驗[3-5]證明:異體MSCs移植可用于治療多種疾病。MSCs移植需要大量細胞，需要對分離的MSCs在移植前進行體外擴增[6]。隨著MSCs體外培養(yǎng)傳代次數的增加，其分化潛能和增殖能力逐漸降低，細胞呈現(xiàn)衰老的特征[7]，成為限制臨床應用的嚴重瓶頸。細胞形態(tài)的改變是細胞衰老的重要特征[8]。通常衰老的細胞體積增大，并呈現(xiàn)扁平狀。有研究[9-10]比較年老和年輕供者來源的骨髓MSCs特征顯示：與年輕供者比較，年老供者的MSCs雖具一定的增殖和分化能力，但細胞骨架流動性和重塑性降低，導致了細胞結合、物質轉運和物質代謝等功能明顯降低，同時細胞對外界理化環(huán)境刺激的反應遲緩，從而在功能上影響了MSCs在組織再生修復中的作用。然而細胞骨架影響MSCs衰老的具體機制尚未見相關報道。

細胞骨架由微絲、微管和中間纖維3種結構構成，其中微絲由纖維型肌動蛋白(fibrous actin，F(xiàn)-actin)聚合而成[11]，細胞骨架蛋白F-actin的聚合可以影響細胞的遷移、增殖和分化等能力[12-15]。本研究采用人骨髓間充質干細胞(human bone marrow mesenchymal stem cells ，hBMSCs)體外復制性衰老模型，探討F-actin及其下游分子YAP在hBMSCs復制性衰老中的變化，使用F-actin抑制劑處理hBMSCs，檢測hBMSCs中衰老相關指標的改變，初步闡明其相關分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器 本實驗所用細胞為hBMSCs，取自車禍患者截肢骨內的骨髓，已獲得杭州醫(yī)學院倫理委員會批準。DMEM培養(yǎng)基和胎牛培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶、牛血清白蛋白(BSA)、PBS、4%多聚甲醛、L-谷氨酰胺、鬼丙環(huán)肽Phalloidin和Actin-stain 555 Phalloidin(美國Cytoskeleton公司)，F(xiàn)-actin抑制劑Latrunculin B(美國Abcam公司)，YAP一抗和Ki67一抗(上海Santa Cruz 公司)， SA-β-Gal染液、成骨誘導液、成軟骨誘導液和成脂誘導液(美國Oricell cyagen公司)，488二抗(美國Abbkine公司)。生物安全柜(上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司)，超凈臺(蘇州醫(yī)療器械七廠)，80℃超低溫冰箱(美國Thermo公司)，冰凍切片機(德國Microm公司)，水浴鍋(美國Millipore公司)，PCR儀(美國Thermo Fisher公司)，滅菌鍋(上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司)，CO2培養(yǎng)箱和純水儀(美國Millipore公司)，烘箱和離心機(德國Eppendoff 公司)，倒置熒光電子顯微鏡(日本Olympus公司)，水浴鍋(上海醫(yī)療器械七廠)，高速離心機(德國Eppendoff公司)，電泳儀(北京六一生物科技有限公司)，Hitachi S-3000掃描電子顯微鏡(日本Hitachi公司)等。

1.2 hBMSCs的分離和培養(yǎng) 取車禍患者截肢骨中的骨髓，將取得的骨髓置于無菌肝素管中離心去上清，采用PBS液調整骨髓細胞濃度至1×106mL-1，按體積比1∶1分別加入Ficoll分離液和骨髓細胞懸液，1 800 r·min-1離心20 min，吸取界面單個核細胞，采用PBS洗滌2次，加入細胞培養(yǎng)液后以1×106cm-1的密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于含5%CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)。

1.3 hBMSCs三系分化能力的檢測 采用胰酶消化hBMSCs(37℃、2 min)后，采用含血清培養(yǎng)基終止胰酶作用，吹打離心(×200 g、5 min)去上清。將細胞重懸于含10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基后進行細胞計數。分別接種至相應孔板中，在成骨誘導液中誘導培養(yǎng)2周，成脂誘導液中誘導培養(yǎng)3周，成軟骨誘導液中誘導培養(yǎng)5周，誘導結束后棄去誘導液。分別用茜素紅染色、SO染色和油紅O染色確定誘導效果。

1.4 細胞分組 原代hBMSCs長滿后按1∶3傳代，在含5%CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)。細胞長至80%左右時將細胞分組，分為對照組(P2代hBMSCs，不進行任何處理)、 F-actin抑制劑組(2.5 μmol·L-1F-actin抑制劑Latrunculin B處理P2代hBMSCs 1 h)和P11代hBMSCs組(P2代hBMSCs連續(xù)傳代得到P11代hBMSCs)。

1.5 免疫熒光染色觀察各組hBMSCs中Ki67陽性細胞、F-actin的形態(tài)和聚合情況及YAP在細胞內的亞細胞定位 待各組細胞分別長滿至約60%，吸去培養(yǎng)基，PBS清洗3次，每次5 min。4%多聚甲醛溶液固定15 min后，PBS洗去多余固定液。采用0.2%Triton X-100透膜5 min，采用PBS清洗3次，每次5 min。用5% BSA室溫封閉30 min，用1%BSA稀釋一抗(YAP、Ki67和Acti-stain 555 Phalloidin)，加入稀釋好的一抗，置于濕盒里孵育，4℃過夜。次日，采用PBS洗滌3次，每次5 min。在孵育了YAP、Ki67一抗的樣本中加入1%BSA稀釋的488二抗(山羊抗鼠)避光孵育1 h后，采用PBS洗滌3次。加入DAPI進行細胞核染色5 min，采用PBS洗滌3次，每次5 min。采用免疫熒光封片劑封片，暗盒保存。在激光共聚焦顯微鏡下觀察hBMSCs中Ki67陽性細胞、F-actin的形態(tài)和聚合情況及YAP在細胞內的亞細胞定位。

1.6 SA-β-Gal染色檢測各組hBMSCs中SA-β-Gal染色陽性細胞數 待各組hBMSCs分別長至約70%，吸去培養(yǎng)基，采用PBS洗滌細胞2次，加入1 mL SA-β-Gal染色固定液固定15 min。PBS洗滌3次，每次5 min，每孔加入1 mL 染色工作液，37℃孵育過夜。普通光學顯微鏡下觀察顯示細胞衰老的SA-β-Gal染色陽性細胞數。

2 結 果

2.1 hBMSCs的成骨、成脂和成軟骨分化能力 成功分離并培養(yǎng)得到hBMSCs，人骨髓中分離得到的hBMSCs為類成纖維細胞(圖1A，見插頁一)，細胞融合時呈現(xiàn)螺旋旋渦樣生長。細胞分別在成骨、成脂和成軟骨誘導液中誘導后采用茜素紅染色、油紅O染色和SO染色檢測誘導效果。成骨分化誘導后茜素紅染色陽性(圖1B，見插頁一)，成脂肪分化誘導后油紅O染色陽性(圖1C，見插頁一)，成軟骨分化誘導后SO染色陽性(圖1D，見插頁一)，證明分離得到的hBMSCs具有成骨、成脂和成軟骨分化的能力。

2.2 各組hBMSCs中Ki67陽性細胞數和SA-β-Gal染色陽性細胞數 通過Ki67熒光染色標記各組hBMSCs中處于增殖周期中的細胞，通過SA-β-Gal染色標記各組細胞中衰老的細胞。與對照組比較，P11代hBMSCs組SA-β-Gal染色陽性細胞數明顯增多，而Ki67陽性細胞數明顯減少。見圖2(插頁二)。

2.3 各組hBMSCs中F-actin的形態(tài)和聚合情況及YAP在細胞內的亞細胞定位 對照組hBMSCs中的微絲纖維束較多較粗，F(xiàn)-actin長度較長，YAP主要集中在細胞核(YAP在細胞核內為活化態(tài))；P11代hBMSCs組細胞中的微絲纖維束明顯減少，F(xiàn)-actin長度變短，YAP主要集中在胞漿(YAP在胞漿為失活態(tài))；同時hBMSCs中YAP出核的細胞SA-β-Gal染色陽性；F-actin抑制劑組F-actin聚合異常，YAP出核失活，SA-β-Gal染色陽性細胞數明顯增多。見圖3～5(插頁二)。

3 討 論

干細胞衰老影響體外培養(yǎng)的MSCs數量和質量，傳代次數較多的MSCs臨床療效明顯不如傳代次數較少的MSCs，使得MSCs衰老成為其臨床應用的制約因素[16]。研究[17]表明：細胞衰老是老年性疾病的關鍵致病因子，因此研究MSCs的衰老及相關分子機制具有重要意義。研究[8]顯示:MSCs在傳代過程中伴隨細胞形態(tài)表現(xiàn)的改變，而細胞骨架蛋白決定了細胞的形態(tài)結構。本研究結果表明：隨著細胞代數的增加，細胞表面積明顯增大，微絲纖維束減少，F(xiàn)-actin長度變短、變細且聚合減少。

YAP作為一種多功能轉錄共激活因子，在MSCs周期進程中起關鍵作用[18]。同時，YAP也被認為參與了細胞的衰老過程，YAP表達隨著細胞傳代次數的增加而逐漸降低，通過敲除YAP可直接誘導人胚肺成纖維細胞和肝臟衛(wèi)星細胞的衰老[19-20]。本研究結果顯示：YAP在不同代數hBMSCs中的亞細胞定位呈現(xiàn)明顯差異，且YAP出核的細胞SA-β-Gal染色陽性。

YAP的生物活性可受F-actin調控，細胞中F-actin的聚合差異可以導致YAP的細胞定位不同，從而影響細胞的遷移、增殖或分化[11-14，21]。因此本文作者探討了F-actin是否通過調節(jié)YAP活性影響hBMSCs的衰老。本研究結果顯示：F-actin抑制劑可以促進YAP出核失活，同時明顯增加SA-β-Gal染色陽性的細胞。

綜上所述，F(xiàn)-actin和YAP參與了hBMSCs的衰老過程，F(xiàn)-actin抑制劑可以抑制F-actin聚合，進一步調節(jié)YAP的出入核從而影響hBMSCs的衰老。本研究結果從分子生物學角度為MSCs的衰老提供了新的認知，MSCs具有廣闊的臨床應用前景。

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