時小紅，文乾鈞，彭茜茜，王永武，楊云生

復(fù)發(fā)性口腔潰瘍(recurrent oral ulcer，ROU)是一種以口腔黏膜炎性反應(yīng)或增生為病理特征的口腔疾病，屬于中醫(yī)學(xué)“口瘡、口瘍”范疇。目前ROU發(fā)病機(jī)制不明，復(fù)發(fā)率高，無明確治療方法，嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量和身心健康[1]。據(jù)報道，ROU臨床患病率約20%，特定人群則達(dá)到60%[2]。近年來，潰瘍愈合質(zhì)量逐漸成為評價ROU治療效果的重要指標(biāo)。本課題組相關(guān)人員前期以糞便類粗提物及糞便中藥為基礎(chǔ)進(jìn)行了臨床觀察及古代文獻(xiàn)搜集整理工作[3-5]，發(fā)現(xiàn)糞便類中藥在改善潰瘍類疾病患者臨床癥狀、提高再生黏膜成熟度、改善愈合質(zhì)量、降低復(fù)發(fā)率等方面顯示出特有的優(yōu)勢及較好的臨床療效。本文就微生態(tài)與ROU發(fā)病的關(guān)系及相關(guān)機(jī)制等方面的國內(nèi)外進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 發(fā)病特征

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，ROU發(fā)病與細(xì)胞免疫、體液免疫和自身免疫等免疫因素，環(huán)境因素，變態(tài)反應(yīng)，遺傳因素，體內(nèi)銅鋅比例失調(diào)，內(nèi)分泌功能紊亂，鐵缺乏，微循環(huán)障礙，自主神經(jīng)功能紊亂，系統(tǒng)性疾病等多種因素有關(guān)[6]。菌群紊亂誘發(fā)ROU的病理相關(guān)機(jī)制已成為近5年來新的研究方向。

1.1 舌苔菌群及環(huán)境 舌苔作為口腔的一部分，常用于監(jiān)測口腔健康和疾病的發(fā)生發(fā)展，其表面的微生態(tài)也逐漸引起研究者的關(guān)注[7]。舌背黏膜良好的微氧環(huán)境為微生物的定植、生長和繁殖提供了適宜場所。舌背黏膜聚集了大量細(xì)菌，舌背上平均每個細(xì)胞可以附著100個細(xì)菌，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于口腔其他部位細(xì)菌的分布數(shù)量，使得舌背形成了一個相對完整而獨(dú)立的微生態(tài)系統(tǒng)。推測苔體生態(tài)位中的菌群、定植菌等在ROU中的致病性可能成為ROU潛在的診斷標(biāo)志物。

已有研究開始關(guān)注口腔中舌苔菌群變化與疾病的關(guān)聯(lián)，尤其是苔色與菌群定植的關(guān)系。例如，在一些研究舌苔與糜爛性胃炎的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌可作為黃苔的潛在診斷標(biāo)記，采用復(fù)方中藥干預(yù)后，芽孢桿菌消失[8]。

有關(guān)ROU相關(guān)菌群及功能的研究指標(biāo)呈現(xiàn)出主觀、分散、非特異性等特征，尚不能全面、客觀、真實(shí)地反映ROU菌群失衡的本質(zhì)，但進(jìn)一步深入研究已陸續(xù)開展。以往對口腔微生物群落結(jié)構(gòu)的研究多采用細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)，但人類口腔中超過半數(shù)的細(xì)菌在現(xiàn)有條件下是不可培養(yǎng)的，現(xiàn)代系統(tǒng)分子生物學(xué)技術(shù)可使我們對以往不能培養(yǎng)的細(xì)菌有更深入的了解[9]。16S rRNA是細(xì)菌體內(nèi)存在特有的rRNA，是原核微生物的標(biāo)志性保守基因[10]。16S rRNA基因序列比對鑒定技術(shù)是一種建立在基因文庫及生物信息學(xué)技術(shù)上的較為成熟的細(xì)菌快速鑒定方法，可對舌苔上細(xì)菌群落的變化進(jìn)行定量分析及綜合鑒定，被認(rèn)為是最適于細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定研究的指標(biāo)[11]，可作為后續(xù)宏基因組學(xué)、代謝組學(xué)等組學(xué)研究的基礎(chǔ)。

1.2 口腔微生物 人體與微生物、微生物與微生物之間存在能量流動、物質(zhì)交換和基因傳遞?？谇痪鹤鳛榭谇坏幕窘M成成分，在人類進(jìn)化中與人體共生，在宿主的免疫動態(tài)平衡中起重要作用。口腔是胃腸道的起始部，其內(nèi)的微生物群落是口腔的基本組成成分，包括細(xì)菌、真菌、古細(xì)菌、原生動物及病毒等，其中僅細(xì)菌就超過13門700種，是僅次于腸道的人體第二大微生物群落棲息地[12-13]。多樣性減少以及相互生存/抑制的生態(tài)失衡等微生態(tài)菌群的改變即會引起口腔疾病。

隨著ROU中醫(yī)臨床循證依據(jù)的積累，復(fù)方中藥臨床療效的跟蹤，微生物群落在ROU中的致病性逐漸成為研究熱點(diǎn)[14-15]。Krajden等[16]早在1983年就首次從胃炎患者的牙菌斑中培養(yǎng)出幽門螺桿菌(Hp)，并推測口腔有可能是Hp在人體內(nèi)除胃以外的重要聚集地。有學(xué)者認(rèn)為，病毒感染可作為一種誘因參與到ROU發(fā)病，病毒受刺激后活化病毒抗原在上皮中表達(dá)，通過復(fù)制直接引發(fā)或造成局部免疫異常，導(dǎo)致ROU患者黏膜損害和潰瘍形成[17-18]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，ROU患者口腔內(nèi)的Hp與消化道內(nèi)的Hp可以相互轉(zhuǎn)移，ROU發(fā)生與Hp單一菌體的脂多糖、尿素酶及空泡毒素所產(chǎn)生的作用相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，ROU患者Hp的陽性率為44.5%，正常群體則為10.2%，其中ROU患有消化性潰瘍的比例為24.9%，而無ROU的患者此比例則為4.2%，提示ROU發(fā)病與Hp感染、消化性潰瘍等有一定關(guān)聯(lián)[19]。

研究發(fā)現(xiàn)，革蘭陰性球菌、鏈球菌和韋榮氏菌數(shù)量的變化與ROU的發(fā)生存在一定關(guān)系，并可影響潰瘍恢復(fù)，患者唾液中的革蘭陰性球菌會引發(fā)復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的發(fā)生，當(dāng)菌群的數(shù)量產(chǎn)生一定變化后，數(shù)目的改變會直接影響口腔中的微生態(tài)平衡，這也是口腔潰瘍反復(fù)發(fā)生的最主要原因之一[20]。

另有研究發(fā)現(xiàn)，在口腔病變狀態(tài)下，一種被稱為梭桿菌的口腔細(xì)菌可進(jìn)入血液，通過表面蛋白分子定植病灶，精準(zhǔn)地靶向病變部位，加速病情進(jìn)展[21]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，口腔存在Siphoviridae、Myoviridae、Podoviridae等大量噬菌體，是組成人體病毒群落的主要成分[22]。唾液、齦菌斑的病毒群都以噬菌體為主，后者對口腔細(xì)菌群的數(shù)量與功能進(jìn)行著多方面的調(diào)控，是口腔微生態(tài)的重要調(diào)控與驅(qū)動力量，起著調(diào)節(jié)人體免疫、維持微生態(tài)平衡、調(diào)控代謝等作用。一項(xiàng)基于16S rRNA基因組測序技術(shù)的隊列研究，收集不同時段健康成人口腔唾液進(jìn)行病毒基因組檢測，結(jié)果表明每個受試者都有一個獨(dú)特而穩(wěn)定的口腔病毒譜，可望用于相關(guān)疾病的診斷、治療與療效評價[23]?？谇徊《救菏д{(diào)也很可能是ROU重要的生物學(xué)基礎(chǔ)與病理結(jié)果之一。

基于16S rRNA基因的分子生物學(xué)技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于口腔微生物群落結(jié)構(gòu)的研究中，經(jīng)由此項(xiàng)技術(shù)鑒定發(fā)現(xiàn)了健康人口腔內(nèi)與白介素8(IL-8)高水平釋放相關(guān)的指示性細(xì)菌，這對于早期預(yù)測口腔疾病十分重要[24]。適時進(jìn)行口腔疾病微生態(tài)干預(yù)的細(xì)菌療法概念也應(yīng)運(yùn)而生，出現(xiàn)了利用益生菌對口腔細(xì)菌的影響來治療口腔疾病的研究[25]。人體微生物可通過生物合成產(chǎn)生多種重要次級代謝產(chǎn)物等天然產(chǎn)物分子來發(fā)揮抗菌活性。如新近發(fā)現(xiàn)的牙齦卟啉單胞菌(Pg)，可在不影響腸道菌群的情況下誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生牙周炎，若使用失活的Pg處理小鼠，可使小鼠產(chǎn)生Pg特異性抗體，并在牙周炎引起的免疫及代謝失調(diào)中起保護(hù)作用[26]。

2 微生態(tài)干預(yù)療效及機(jī)制

2.1 復(fù)方中藥干預(yù) ROU的微生態(tài)失調(diào)總的治療以恢復(fù)菌群運(yùn)動，達(dá)到平衡為原則。本課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，糞便類中藥及其微生態(tài)提取物對難治和初治潰瘍性ROU等療效顯著。

目前認(rèn)為，復(fù)方中藥對于微生態(tài)菌群的干預(yù)可能通過改變菌群的組成，改善菌群失調(diào)等來實(shí)現(xiàn)。菌群可能將草藥中的化學(xué)成分轉(zhuǎn)化為有不同生物活性/毒性及不同生物利用度的代謝產(chǎn)物，也可能介導(dǎo)草藥不同成分之間的相互作用從而產(chǎn)生療效[27]。為了解決藥草殘留引起的環(huán)境污染和中藥殘留的巨大浪費(fèi)，有研究者選擇植物乳桿菌(HM218749)，對健胃消食片的藥草殘留進(jìn)行再利用；建立Hp感染小鼠模型，評價其抗Hp的作用；利用尿素酶活性試驗(yàn)、組織學(xué)成像、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和變性凝膠梯度電泳(DGGE)，對藥渣發(fā)酵的Hp活性進(jìn)行研究[28]，結(jié)果表明，該藥草殘留發(fā)酵上清液能有效抑制尿素酶活性，減緩胃區(qū)細(xì)胞浸潤，顯著降低治療組白介素-6 (IL-6)、IL-8、TNF-α的生成。此外，DGGE的結(jié)果表明，在受感染的模型中，草本殘留物發(fā)酵上清液對正常情況下的微生物菌群的恢復(fù)是有益的，因此，發(fā)現(xiàn)益生菌具有很好的開發(fā)藥草殘留的潛力，在治療Hp感染方面有很大的潛力。有利于感染了Hp細(xì)菌的動物模型菌群恢復(fù)正常。這為ROU患者口腔內(nèi)Hp的鑒定與檢出后的后續(xù)治療提供了新方向。2015年Xu等[29]采用葛根芩連湯治療糖尿病患者，并對治療前后患者糞便樣品進(jìn)行DNA高通量測序和生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)藥物的療效與菌群結(jié)構(gòu)的變化密切相關(guān)，這為解釋中藥復(fù)方的臨床效果提供了一條新的證據(jù)鏈。該研究發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方處理組的菌群結(jié)構(gòu)距離開始治療前越遠(yuǎn)，臨床療效越好，而在后8周末出現(xiàn)變化，但臨床癥狀持續(xù)改善，即菌群結(jié)構(gòu)顯著變化在先，臨床癥狀顯著改善在后，提示菌群的變化可能是癥狀改善的原因之一。這項(xiàng)研究還確認(rèn)了與癥狀改善呈正負(fù)相關(guān)的細(xì)菌種類，如Faecalibacterium prausnitzii等有益菌明顯升高，且具有藥物劑量依賴性，或可成為可用的益生菌。

很多中藥的成分及其配伍特征比較復(fù)雜，然而在進(jìn)行藥代研究過程中卻發(fā)現(xiàn)這些成分在血液中的含量非常少甚至檢測不到。中藥的作用靶點(diǎn)有可能是腸道菌群通過多藥配伍組合促進(jìn)腸道微生態(tài)等共生菌從病理狀態(tài)向生理狀態(tài)切換，對宿主免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)進(jìn)行調(diào)節(jié)，以提高宿主的防御力，從而表現(xiàn)出良好的慢病治療效果[30-31]。

2.2 心理干預(yù) 一項(xiàng)調(diào)查問卷結(jié)果顯示，ROU患者存在一定的心理異常癥狀，還具有外向性格傾向及典型焦慮、緊張、易怒等情緒不穩(wěn)定的人格特點(diǎn)[32]，提示精神心理因素在ROU的發(fā)生及復(fù)發(fā)中占有重要地位，維持良好的情緒、促進(jìn)和改善患者的心理健康狀況可有效提高ROU療效。大量研究證據(jù)指出，腸道菌群通過神經(jīng)內(nèi)分泌和自主神經(jīng)實(shí)現(xiàn)腦和腸之間的信號傳遞(即腦-腸互動)，進(jìn)而影響宿主的行為或情緒，機(jī)制可能與消化道菌群失調(diào)產(chǎn)生的內(nèi)毒素誘發(fā)的炎癥反應(yīng)有關(guān)，也是糞便類中藥治療ROU機(jī)制之一[33-34]。

2.3 健康人體微生態(tài)移植物干預(yù) 本課題組相關(guān)人員采集潰瘍性結(jié)腸炎患者當(dāng)日新鮮糞便的糞微生態(tài)粗提物，經(jīng)胃腸鏡于6h內(nèi)灌入腸道，實(shí)施糞微生態(tài)移植治療，通過恢復(fù)或重建患者消化道菌群正常結(jié)構(gòu)來治療腸道菌群紊亂的相關(guān)性疾病，評估糞微生態(tài)移植治療潰瘍性病變的初步療效和安全性[3-5]。腸鏡提示糞微生態(tài)可使病變黏膜愈合，對初治和難治性潰瘍均有較好的療效和安全性。

2.4 針灸調(diào)節(jié)作用 研究已經(jīng)證明，針灸通過作用于不同穴位可改善菌群的多樣性及有益菌群的含量[35]，具有抑菌作用[36]，對人體的生理、生化、內(nèi)分泌、免疫等有多種調(diào)節(jié)作用，可正向影響微生物的生存環(huán)境，改善定植條件，保護(hù)和促進(jìn)原籍菌的定植和繁殖，增強(qiáng)定植抗力，抑制和排斥外籍菌和環(huán)境菌的侵入和定植，克服微生態(tài)失調(diào)，最終結(jié)果表現(xiàn)為抗菌、抗感染的臨床效應(yīng)，但機(jī)制尚不明確。

2.5 飲食干預(yù) 約97.5%的ROU會產(chǎn)生食物不耐受，具有食物不耐受特異性IgG抗體介導(dǎo)產(chǎn)生的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)[37]。羅艷燕等[38]抽取60例ROU患者為對象，取同期體檢健康者60例作為對照組，研究飲食控制在ROU中的價值。結(jié)果表明，觀察組中食物不耐受特異性IgG抗體檢測為陽性者58例(96.67%)，對照組中陽性者36例(60%)。對相應(yīng)不耐受食物采取3個月的控制措施后，口腔潰瘍控制有效緩解者45例，占75%。Zhao等[39]將糖尿病患者分為常規(guī)治療對照組(U組)和利用多種膳食纖維組合的高膳食纖維組(W組)，W組采用含有復(fù)雜組分的3種不同膳食纖維組合干預(yù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組糖化血紅蛋白在起初均明顯下降，28d后W組下降更顯著，此外W組血糖指標(biāo)、體重、血脂改善也更好。此項(xiàng)研究為通過膳食纖維改善菌群結(jié)構(gòu)來改善疾病提供了有力證據(jù)，為臨床ROU患者靶向的精準(zhǔn)營養(yǎng)和個性化營養(yǎng)的目標(biāo)提供了可能。

綜上所述，中國古代的醫(yī)藥學(xué)家對ROU進(jìn)行了持續(xù)不斷的研究，積累了廣泛而豐富的經(jīng)驗(yàn)，是中國傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)極其寶貴的財富，應(yīng)用糞便微生態(tài)類相關(guān)中藥辨治ROU是中醫(yī)診療特色之一。口腔尤其是舌苔微生態(tài)學(xué)為ROU發(fā)病機(jī)制的研究以及中醫(yī)藥的應(yīng)用帶來了新的契機(jī)，口腔微生態(tài)的相互作用機(jī)制也是目前處于前沿的研究熱點(diǎn)，探索其在ROU中的治療作用可拓展糞便類中藥治療的新概念，乃至新產(chǎn)品的研發(fā)。