曾方林，束玉鳳，王金富（揚(yáng)州市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇225000）

結(jié)核病為目前世界傳染病中病死率最高的一種傳染病。據(jù)WHO報告，全球1/3人群（約20億）感染了結(jié)核分枝桿菌，每年新發(fā)結(jié)核病例約900萬，且每年新增病例的5%為多重耐藥性結(jié)核菌株感染[1]。這些耐藥株比敏感株具有更高的病死率和發(fā)病率[2?3]。對全國范圍而言，利福平（RFP）與異煙肼（INH）雙重耐藥導(dǎo)致的耐多藥結(jié)核也成為難治性結(jié)核的主要因素。目前，絕對濃度法和比例法是檢測結(jié)核藥物敏感性的常規(guī)方法，但其具有耗時長（通常需要4～8周）、不易標(biāo)準(zhǔn)化等缺點(diǎn)，易延誤患者的治療，而基于羅氏固體培養(yǎng)法的結(jié)核耐藥診斷是最常用的檢測方法，但其周期長、操作煩瑣，也易耽誤患者的治療。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和分子探針雜交技術(shù)的藥敏試驗(yàn)檢測方法得到廣泛應(yīng)用，可用于快速篩查多重耐藥結(jié)核病患者。如能廣泛、快速地進(jìn)行抗結(jié)核藥物的耐藥性檢測，對臨床早期合理用藥具有重要價值[4]。因此，本研究采用DNA?微陣列芯片法調(diào)查了揚(yáng)州地區(qū)結(jié)核分枝桿菌（MTB）對RFP與INH耐藥基因突變位點(diǎn)的分布特征，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 標(biāo)本來源 選取2015年8月至2017年8月本院收治的結(jié)核患者痰涂片抗酸染色陽性且經(jīng)PCR?熒光探針鑒定為MTB患者的標(biāo)本、傳統(tǒng)結(jié)核培養(yǎng)鑒定為MTB的分離株標(biāo)本、PCR?熒光探針法檢測鑒定為MTB且CT值小于30（Hu）的各類標(biāo)本。

1.1.2 試劑 分枝桿菌核酸檢測試劑盒和MTB耐藥基因檢測試劑盒（博奧生物有限公司產(chǎn)品）。檢測指標(biāo)包括RFP及INH的3個耐藥相關(guān)基因rpoB基因啟動子的野生型及不同突變型，其中RFP耐藥相關(guān)基因rpoB基因檢測6個位點(diǎn)，共13種突變型，含531位TCG→TTG、531位 TCG→TGG、526位 CAC→GAC、526位 CAC→TAC、526位 CAC→CTC、526位 CAC→CGC、511位 CTG→CCG、513位 CAA→CCA、513位 CAA→AAA、516位 GAC→GTC、516位 GAC→TAC、516位GAC→GGC及533位CTG→CCG。INH耐藥相關(guān)基因katG基因、inhA基因各檢測1個位點(diǎn)，分別為katG基因315位AGC→ACC和AGC→AAC 2個突變型，inhA基因?15位C→T突變型。改良羅氏培養(yǎng)基為珠海貝索生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器 晶芯LuxScan10K?B微陣列芯片掃描儀、晶芯SlideWasher芯片洗干儀、晶芯BioMixer芯片雜交儀、晶芯Extractor36核酸快速提取儀均為北京博奧生物有限公司生產(chǎn)；Mx3000P實(shí)時熒光定量PCR儀為美國安捷倫Stratagene公司生產(chǎn)。

1.2 方法 嚴(yán)格按試劑說明書提取各標(biāo)本核酸，然后進(jìn)行分枝桿菌核酸檢測。對檢測CT值小于30（Hu）（共進(jìn)行40次循環(huán)擴(kuò)增）的核酸標(biāo)本再按基因芯片法操作說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增、芯片雜交、洗滌甩干和掃描判讀。以芯片自帶的陰陽性對照作為質(zhì)控，陽性對照點(diǎn)rpoB IC、katG IC、inhA IC應(yīng)為陽性，陰性對照點(diǎn)為陰性則判斷實(shí)驗(yàn)有效，否則判定該次實(shí)驗(yàn)無效。

2 結(jié) 果

2.1 基本情況 去除重復(fù)檢測者共檢測369例，其中MTB陰性23例，MTB陽性346例。346例MTB陽性患者中耐RFP 48例（13.9%），耐INH 78例（22.5%），對二者同時耐藥33例（9.5%）。

2.2 RFP耐藥基因分布 48例RFP耐藥標(biāo)本中RFPrpoB基因耐藥位點(diǎn)分布為531（TCG→TTG）位點(diǎn)24例（50.0%），526（CAC→TAC）位點(diǎn) 12 例（25.0%），526（CAC→CGC）位點(diǎn) 5例（10.4%），526（CAC→GAC）位點(diǎn) 1例（2.1%），511（CTG→CCG）位點(diǎn) 4例（8.3%），516（GAC→GTC）位點(diǎn)1例（2.1%），516（GAC→TAC）位點(diǎn)1例（2.1%）。

2.3 INH耐藥基因分布 78例INH耐藥標(biāo)本中INH katG基因耐藥位點(diǎn)分布為315（AGC→ACC）位點(diǎn)54例（69.2%），315（AGC→AAC）位點(diǎn)5例（6.4%）；inhA基因耐藥位點(diǎn)分布為?15（C→T）位點(diǎn) 18例（23.1%），其中katG基因315位AGC→ACC聯(lián)合inhA基因?15位C→T突變1例（1.3%）。

3 討 論

RFP與INH作為最重要的一線抗結(jié)核藥物組合，檢測MTB對RFP與INH的敏感性對治療用藥具有重要價值。本研究使用MTB耐藥基因檢測試劑盒進(jìn)行MTB對RFP與INH的耐藥性檢測，并在前期研究驗(yàn)證過該方法具有良好的適用性[5]。該方法與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)檢測比較，具有檢測速度快、高通量、靈敏度高、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，能很好地替代傳統(tǒng)藥敏檢測。針對目前揚(yáng)州地區(qū)尚未規(guī)模化進(jìn)行RFP與INH耐藥基因分布情況研究的現(xiàn)況，通過本研究以期了解揚(yáng)州地區(qū)RFP與INH主要耐藥基因的分布特征，推動揚(yáng)州地區(qū)對耐藥結(jié)核病的早期診斷水平，提高治療水平。

RFP主要作用于MTB DNA依賴的RNA聚合酶的β亞單位，干擾轉(zhuǎn)錄的開始及RNA延伸，發(fā)揮抑菌和殺菌作用[6]。95.0%對RFP耐藥菌株的突變發(fā)生在rpoB基因81 bp的熱點(diǎn)區(qū)域（編碼密碼子為507～533位）[7]。該區(qū)域被稱為RFP耐藥決定區(qū)（RRDR），85.0%耐藥菌株出現(xiàn)531位Ser、526位His和516位Asp基因變異。本研究采用MTB耐藥試劑盒檢測rpoB基因RRDR的531、526、516、511、533 位密碼子，結(jié)果顯示，揚(yáng)州地區(qū)531、526突變位點(diǎn)為優(yōu)勢突變位點(diǎn)，其中531位點(diǎn)占50.0%（24/48），526位點(diǎn)占 37.5%（18/48），最常見突變位點(diǎn)為531（TCG→TTG）突變位點(diǎn)（50.0%）和526（CAC→TAC）突變位點(diǎn)（25.0%），與相關(guān)研究結(jié)果相似[8?11]。

INH主要作用于細(xì)胞壁中的分枝菌酸、DNA、脂類等成分[12]。在耐 INH的 MTB分離株中有 50%～70%katG基因發(fā)生突變[13]。inhA基因編碼的烯?；€原酶是INH作用的靶點(diǎn)，與耐藥性密切相關(guān)，inhA基因突變導(dǎo)致INH耐藥的菌株達(dá)總耐藥株的25.0%[14]。本研究采用MTB耐藥試劑盒檢測katG基因的315位密碼子和inhA基因的?15位密碼子，結(jié)果顯示，揚(yáng)州地區(qū)katG基因突變占主導(dǎo)地位[75.6%（59/78）]，inhA基因突變占次要地位（23.1%），其中 katG基因 315位 AGC→ACC聯(lián)合inhA基因?15位C→T突變1例（1.3%）。katG基因315（AGC→ACC）為主要突變位點(diǎn)（69.2%），inhA 基因?15（C→T）突變位點(diǎn)占 23.1%，與相關(guān)研究結(jié)果相似[8?11]。

另外，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，最近在RFP耐藥菌株中的rpoB?RRDR發(fā)現(xiàn)了2個新的突變基因——Asp516Thr和Ser531Gly基因，以及在rpoB外也發(fā)現(xiàn)了一個突變基因——Ile572Phe基因[15]。此外，INH耐藥相關(guān)基因——katG和inhA基因雖然為主要突變基因，但有研究表明，由于katG和InhA操縱子的改變而導(dǎo)致MTB耐INH的分離株只占80.0%，還有20.0%耐INH分離株的這2個基因均無變化，可能還有其他耐藥機(jī)制的存在[16]。然而，MTB耐藥檢測試劑無法包含上述所有突變基因和突變形式，在檢測結(jié)果中有可能出現(xiàn)對RFP與INH實(shí)際上耐藥而檢測結(jié)果敏感的情況，因此，該方法檢測的RFP與INH的敏感性只能作為參考，并不能確診。但參考作者的前期研究，基因芯片法仍具有良好的靈敏度和特異性[5]，加之其速度快、高通量、靈敏度高、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，也可作為當(dāng)前該地區(qū)臨床MTB耐藥篩選的重要手段。

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