侯玉榮，范青峰，史孫亮，袁耀佐，張 玫

(1江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，南京 210008；2中國藥科大學，南京 210009)

西索米星(sisomicin)是20世紀60年代開發(fā)的由小單孢菌產(chǎn)生的首個含雙鍵的氨基糖苷類抗生素[1-2]，也是奈替米星的合成用母體[3]，結(jié)構(gòu)與慶大霉素相似，其硫酸鹽制劑在臨床上被廣泛應用，具有療效好、價格較低等特點。國家食品藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站上顯示，目前我國硫酸西索米星原料有4個廠家生產(chǎn)，注射液、注射用粉針等不同劑型有32個生產(chǎn)廠家，原料藥質(zhì)量標準收載入中國藥典、日本藥局方、美國藥典、韓國藥典[4-7]，除《中華人民共和國藥典》采用HPLC-UV法測定原料的含量外，其余均采用抗生素微生物檢定法。硫酸西索米星氯化鈉注射液質(zhì)量標準收載入《國家食品藥品監(jiān)督管理局標準》，采用抗生素微生物檢定法測定含量。

抗生素微生物檢定法是一種生物活性測定法，通過測定供試品抗生素抑菌圈的直徑大小，與標準物質(zhì)進行比較，計算含量，以效價單位作為計量單位，缺點是操作復雜、影響因素多、誤差較大、實驗時間長等；目前美國藥典、日本藥局方和韓國藥典均采用抗生素微生物檢定法控制硫酸西索米星原料藥的含量，僅中國藥典采用HPLC-UV法控制原料藥的含量，但中國藥典的HPLC-UV法主成分與前雜質(zhì)分離不理想。本研究在目前已有各方法的基礎上，建立了一種專屬性更好的反相高效液相色譜法，用于測定硫酸西索米星氯化鈉注射液的含量。新方法簡便靈敏、重復性好，與抗生素微生物檢定法相比，縮小了結(jié)果的置信區(qū)間，節(jié)省了檢驗時間。

1 儀器與試劑

1.1 試劑與藥品

庚烷磺酸鈉(HPLC級，日本東京化成工業(yè)株式會社)，乙腈(HPLC級，Merck公司)，超純水(Milli-Q儀制備)。其他試劑均為市售，分析級。

硫酸西索米星氯化鈉注射液(江蘇亞邦生緣藥業(yè)有限公司，批號：15062303、15090602、15101801)；西索米星對照品(批號：130635-201301，含量56.0%)，奈替米星對照品(批號：130355-200702)(中國食品藥品檢定研究院)。

1.2 儀 器

LC-30AD高效液相色譜儀(日本島津公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Aminoglycoside RP 18(4.6 mm×150 mm，3 μm)色譜柱;庚烷磺酸鈉溶液(取庚烷磺酸鈉6 g，加0.1 mol/L磷酸二氫鉀溶液溶解并稀釋至1 000 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH至1.5)-乙腈(77∶23)為流動相:流速1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：205 nm；進樣量：10 μL。

2.2 溶液配制

2.2.1 系統(tǒng)適用性溶液 取西索米星對照品和奈替米星對照品各適量，加水溶解并稀釋制成每1 mL 中約含西索米星0.5 mg和奈替米星0.05 mg的混合溶液。

2.2.2 含量測定供試品溶液 精密量取硫酸西索米星氯化鈉注射液適量，加水溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含西索米星0.5 mg的溶液，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.3 含量測定對照品溶液 取硫酸西索米星對照品，用水溶解制成每1 mL中約含西索米星0.5 mg的溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

采用“2.2.1”項下溶液進行分離度和理論板數(shù)測定，結(jié)果顯示西索米星主峰和前雜質(zhì)分離良好，西索米星與奈替米星分離良好，西索米星峰理論板數(shù)為5 860，拖尾因子為0.82。本方法專屬性良好。

Figure1 Chromatogram of content determination (1:Unknown impurity;2:Sisomimy;3:Netilmicin)

2.4 破壞試驗

取供試品適量，按“2.2.2”項下方法制成每1 mL 中約含西索米星1.0 mg的供試品溶液，分別經(jīng)強酸(1 mol/L鹽酸)1 mL沸水浴、強堿(1 mol/L氫氧化鈉溶液)1 mL沸水浴、過氧化氫溶液1 mL、水浴90 ℃加熱30 min和紫外光照(λ254 nm)24 h破壞處理，各液中和后分別用水稀釋成每毫升中約含0.5 mg的供試品溶液；取空白溶劑同上進行破壞實驗。各取10 μL進行HPLC分析。結(jié)果表明：在上述色譜系統(tǒng)下，西索米星色譜峰與各降解產(chǎn)物能良好分離，空白溶劑不干擾主成分的測定(西索米星主成分峰峰純度閾值均>0.999 99，最小峰純度指數(shù)均大于0)。破壞實驗色譜圖見圖2。

Figure2 Chromatogram of destruction test (1:Not destroyed;2:Acid destruction;3:Alkali destruction;4:Oxidative damage;5:Thermal damage;6:Light damage;7:Blank solvent)

2.5 檢測限

將對照品溶液逐級稀釋后進樣10 μL，按S/N=3作為檢測限,記錄色譜圖，定量限濃度約為0.06 μg/mL，相對西索米星供試品溶液濃度水平的0.000 1%。

2.6 定量限

將對照品溶液逐級稀釋后進樣10 μL，按S/N=10作為檢測限,記錄色譜圖，定量限濃度約為0.2 μg/mL，相對西索米星供試品溶液濃度水平的0.000 4%。

2.7 線性范圍

取西索米星對照品，加水溶解并稀釋制成1.002 4、0.800 52、0.501 2、0.200 13、0.100 24、0.050 033、0.010 024 mg/mL的溶液，分別量取10 μL 注入液相色譜儀，記錄峰面積，以濃度(X)和峰面積(Y)作線性回歸，得回歸方程為：Y=4.210 2×106X+9.107 0×103(r=0.999 9，n=7)。

西索米星濃度在0.010 024～1.002 4 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系。選擇0.5 mg/mL 作為供試品測定濃度，即在供試品濃度的2%～200%范圍內(nèi)線性關系良好。

2.8 精密度

按“2.2.3”項下配制西索米星對照品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，計算主峰面積的RSD為0.09%，保留時間的RSD為0.11%，表明該方法精密度良好。

2.9 重復性

取批號為15062303的樣品6份，按“2.2.2”項下條件處理得供試品溶液。分別取10 μL注入液相色譜儀測定含量，結(jié)果的RSD為0.76%，保留時間的RSD為0.19%，表明本方法重復性較好。

2.10 溶液穩(wěn)定性

取批號為15062303的樣品，按“2.2.2”項下條件處理得供試品溶液，分別置在0、2、4、6和8 h后測定，考察樣品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果主峰面積的RSD為0.33%，保留時間的RSD為0.13%，表明西索米星供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.11 回收率試驗

精密稱取西索米星對照品，按處方配制樣品溶液，用水稀釋制成測定濃度的80%、100%、120%的溶液，按“2.1”項下條件分析，計算回收率，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，方法的準確度良好。

2.12 方法的耐用性

采用3種品牌的耐酸色譜柱進樣系統(tǒng)適用性溶液，考察方法的耐用性，結(jié)果前雜質(zhì)峰與西索米星峰、西索米星與奈替米星峰均可以達到較為理想的分離，耐用性較好(見表2)。

Table1 Results of recovery rate test

GroupAdded/mgFound/mgRecovery/%Average recovery/%RSD/%80%8.2148.14899.2099.850.908.2598.21599.478.1318.202100.87100%9.96810.019100.51100.160.849.97910.056100.7710.10510.02499.20120%12.12212.06299.5199.670.6712.15212.200100.3912.30812.19799.10

Table2 Separation effects under different columns

ColumntR of main peak/minTheoretical platesTail factorSeparation from the pre-impurity peakResolution with netilmicin peakThermo Aminoglycoside (4.6 mm×150 mm,3 μm)6.3905 2480.702.053.52Agilent Zorbax SB-C18 (4.6 mm×150 mm,5 μm)9.5397 4710.872.024.15Agilent Poroshel 120 SB-C18 (4.6 mm×150 mm,2.7 μm)8.57416 1390.782.587.51

采用Thermo Aminoglycoside (4.6 mm×150 mm，3 μm)色譜柱，略微改變“2.1”項下色譜條件的參數(shù)：柱溫(32 ℃、35 ℃、38 ℃)，流速(0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min)，流動相pH(pH 1.4、pH 1.5、pH 1.6)分別進樣。系統(tǒng)適用性各峰分離良好，方法的耐用性良好。

2.13 含量測定

取硫酸西索米星氯化鈉注射液，按“2.2.2”項下處理得供試品溶液，同法配制對照品溶液。分別精密量取供試品溶液和照品溶液各10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖；按外標法計算西索米星的含量，并與抗生素微生物檢定法進行比較。結(jié)果見表3。

Table3 Comparison of antibiotic microbial assay and HPLC methods

MethodContent/%150623031509060215101801Experiment time/hRange of FLRSDAntibiotic microbiological assay103.2102.8104.5205%HPLC-UV104.4103.8104.92-32%

結(jié)果顯示，兩種方法的含量測定結(jié)果無顯著性差異。但從實驗時間、成本以及誤差范圍綜合考量，HPLC-UV方法有更大優(yōu)勢。

3 討 論

3.1 方法的優(yōu)化

《中華人民共和國藥典》(2015年版)硫酸西索米星原料含量測定方法與USP40奈替米星含量測定方法色譜條件相同，均采用C18色譜柱，以庚烷磺酸鈉溶液(取庚烷磺酸鈉20.22 g，加0.07 mol/L的磷酸溶液溶解并稀釋至1 000 mL)-乙腈(62∶38)為流動相。在該色譜條件下，西索米星峰難以與其前相鄰雜質(zhì)峰良好分離，且流動相離子對試劑濃度偏高，需較長的平衡時間。本文在中國藥典方法基礎上，降低流動相中庚烷磺酸鈉的濃度(由2%至0.6%)，用磷酸調(diào)節(jié)pH至1.5，優(yōu)化后的色譜條件下西索米星峰與前相鄰雜質(zhì)峰以及西索米星峰與奈替米星峰均能達到良好的分離效果。

3.2 本文方法與抗生素微生物檢定法的比較

抗生素微生物檢定法可直觀反映藥品的抗菌活性，與臨床應用的要求相符，能確定抗生素的醫(yī)療應用潛質(zhì)，但該方法專屬性較差，凡具有抗菌活性的物質(zhì)都會干擾測定結(jié)果，且耗時長，對操作人員要求高且易產(chǎn)生諸多操作誤差，重復性及精密度均較低。反相高效液相色譜法能使制劑中的組分與輔料有效分離，雜質(zhì)及輔料對測定結(jié)果無干擾，靈敏度高，操作簡單、快速，結(jié)果準確。本研究方法優(yōu)化了中國藥典所用HPLC方法的條件，提高了分離能力，大大降低了檢驗成本，同時滿足了較高的精密度和準確度。本研究方法的測定結(jié)果與抗生素微生物檢定法測定結(jié)果間沒有顯著差異，在實驗時間、成本和置信區(qū)間等方面，HPLC-UV法具有更大的優(yōu)勢。

致謝：趙述強，張如夢同志收集整理相關資料并對研究工作給予幫助。